MAKALAH PRAKTEK INSTRUMEN FARMASI

High Performance Liquid Chromatography

(HPLC)

Disusun Oleh : Kelompok 2

Anggota/NIM : 1. Dinda Puspita / PO.71.39.1.18.007

2. Elfa Sakinah / PO.71.39.1.18.008

3. Ellen Angelina / PO.71.39.1.18.009

4. Fadila Dwi Wardani / PO.71.39.1.18.010

5. Fatima Roihana / PO.71.39.1.18.011

6. Feli Sabila / PO.71.39.1.18.012

Kelas : Reguler 2A

Dosen Pembimbing : Vera Astuti S.Farm, Apt, M.Kes.

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES PALEMBANG

JURUSAN FARMASI

TAHUN AKADEMIK 2019/2020

 KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan kesehatan
jasmani dan rohani sehingga kita masih tetap bisa menikmati indahnya alam
ciptaan-Nya. Sholawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada teladan
kita Nabi Muhammad SAW yang telah menunjukkan kepada kita jalan yang lurus
berupa ajaran agama yang sempurna dan menjadi rahmat bagi seluruh alam.
Saya sangat bersyukur karena telah menyelesaikan tugas pada Mata Kuliah
Praktek Instrumen Farmasi dengan judul “High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)”. Disamping itu, saya mengucapkan banyak terima
kasih kepada semua pihak yang telah membantu hingga terselesaikannya tugas ini.

Akhir kata, saya memahami jika makalah ini tentu jauh dari kesempurnaan
maka kritik dan saran sangat saya butuhkan guna memperbaiki karya-karya saya
di waktu-waktu mendatang.

Palembang, September 2019

Penulis

i
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar ............................................................................................ i

Daftar Isi ..................................................................................................... ii
BAB I Pendahuluan
1.1 Latar Belakang .......................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ..................................................................... 1
1.3 Tujuan Pembahasan .................................................................. 1
BAB II Pembahasan
2.1 Definisi HPLC.................................................................................... 2
2.2 Konsep Dasar HPLC.......................................................................... 2
2.3 Prinsip Kerja HPLC........................................................................... 3
2.4 Jenis - Jenis HPLC............................................................................. 4
2.5 Kegunaan HPLC................................................................................ 4
2.6 Mengetahui Perbedaan HPLC dengan Spektrofotometri lainnya...... 5
2.7 Komponen-Komponen Alat HPLC.................................................... 6
2.8 Cara Kerja Alat HPLC....................................................................... 7
2.9 Prosedur Pemakaian HPLC................................................................ 8
2.10 Kelebihan dan Kekurangan HPLC................................................... 11
BAB III Penutup
Kesimpulan ................................................................................................. 14
Daftar Pustaka ............................................................................................. 15

ii
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Di zaman yang modern seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu
Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan pesatnya. Tuntutan kebutuhan
hiduplah yang menjadikan manusia giat mengembangkan ilmu pengetahuan dan
teknologi. Berbagai ilmu dikembangkan, mulai dari ilmu sosial hingga ilmu
eksak. Seperti salah satu ilmu eksak yaitu ilmu kimia. Dalam praktiknya secara
umum ilmu kimia, yaitu ilmu yang mempelajari tentang sususnan, sifat, dan reaksi
suatu unsur atau zat dalam berbagai jenis  benda material.

            Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian yang dilakukan. Seperti
halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul- molekul dari senyawa zat
nya, atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi
terbagi menjadi berbagai macam lagi. Salah satunya yaitu “Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi” atau yang biasa di kenal HPLC.

1.2 RUMUSAN MASALAH

 Apa definisi HPLC ?
 Apa konsep dasar HPLC ?
 Apa prinsip kerja HPLC ?
 Sebutkan jenis-jenis HPLC ?
 Apa kegunaan HPLC ?
 Apa yang membedakan HPLC dengan metode kromatografi lainnya?
 Apa komponen-komponen alat HPLC ?
 Bagaimana cara kerja alat HPLC ?
 Apa Kelebihan dan kelemahan HPLC?
1.3 TUJUAN PEMBAHASAN
 Untuk Mengetahui Konsep dasar HPLC.
 Untuk Mengetahui Prinsip Kerja HPLC.
 Untuk Mengetahui Komponen HPLC.
 Untuk mengetahui Jenis-Jenis HPLC.
 Untuk Mengetahui Kegunaan HPLC.
 Untuk mengetahui perbedakan HPLC dengan metode kromatografi
lainnya
 Untuk Mengetahui Cara Kerja HPLC
 Untuk mengetahui Kelebihan dan kelemahan 

1
 BAB II

2. PEMBAHASAN

2.1 DEFINISI HPLC

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat
tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya
merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan
beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif
antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta
integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu
tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat

kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas
permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul
yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari
komponen-komponen dalam campuran. Sampel yang akan dianalisis dijadikan
dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh
fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini
adalah mengetahui kadar asam organik.

Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase

diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu
retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan
dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi
analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak
digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol. Jika sampel mula-mula
berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa
larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening, karena syarat

2
sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan
dan harus bening.

2.2 KONSEP DASAR HPLC

Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur

sampel. Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi
saat sampel bergerak melewati fase diam (dapat berupa zat padat atau cair)
karena terbawa oleh fase gerak (dapat berupa zat cair atau gas).

Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan

afinitasnya terhadap fase diam. Komponen yang dapat berinteraksi secara kuat
dengan fase diam akan bergerak lebih lambat sehingga dapat terpisah dari
komponen lain dengan interaksi yang lemah.

Pada kromatografi kertas, sampel yang diteteskan di bagian ujung kertas

kromatografi (fase diam) akan lambat laun bergerak dan terpecah komponennya
seiring dengan pergerakan cairan pada dasar kertas (fase gerak). HPLC pun
demikian, sampel yang diinjeksikan bergerak melalui fase diam dalam kolom
karena terbawa oleh fase gerak.

2.3 PRINSIP KERJA HPLC

Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel
yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian
akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan
perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh
detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang
gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat
oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau
menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC
tersebut.

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari

sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap

3
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom)
HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18
atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya
(gradien elusi), misalnya : air:asetonitril, hal ini bergantung pada kepolaran analit
yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,
dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
punsak-puncaknya terpisah.

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi

karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak
pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil
pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu
menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai
molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik
didih yang sangat tinggi seperti polimer.

2.4 JENIS- JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase

diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik.

Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan

pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan
jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
2. Kromatografi fase terikat
3. Kromatografi penukar ion
4. Kromatografi Pasangan ion

4
 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
6. Kromatografi Afinitas

2.5 KEGUNAAN HPLC 

1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa

biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element),
dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri.
8. Merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif maupun kuantitatif.

2.6 APAKAH YANG MEMBEDAKAN HPLC DENGAN METODE

KROMATOGRAFI LAINNYA?

Sebagai salah satu metode kromatografi cair (liquid chromatography),

HPLC menggunakan zat cair sebagai fase geraknya. Sampel yang telah dilarutkan
dapat dipisahkan dan dihitung konsentrasi zat spesifik yang terkandung di
dalamnya. Sebagai contoh, kandungan kafein dalam sampel minuman dapat
diukur dengan HPLC berdasarkan afinitas kafein terhadap fase diam pada kolom
yang digunakan.

5
 Diagram di atas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada HPLC.
Larutan sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fase gerak (1)
melewati fase diam pada kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh detektor (6)
dan ditampilkan pada pengolah data (7) sebagai kromatogram.

Berbeda dengan kromatografi kolom tradisional yang memanfaatkan

gravitasi agar fase gerak dapat melalui fase diam, HPLC menggunakan pompa
bertekanan tinggi (2) untuk mengalirkan fase gerak menuju kolom fase diam.

Kromatografi kolom

Fase diam yang digunakan dalam HPLC dapat terdiri dari partikel dengan
pori berukuran mikron sehingga tekanan tinggi diperlukan agar fase gerak dan
sampel dapat bergerak melewati pori tersebut. Penggunaan tekanan tinggi inilah
menyebabkan metode ini dinamakan  High Performance Liquid
Chromatography atau yang dulu disebut juga sebagai High Pressure Liquid
Chromatography

6
2.7 KOMPONEN-KOMPONEN ALAT HPLC

Keterangan :

1. Botol pelarut (reservoir)

            Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau
eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa.

2. Pompa (pump)

            Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan
melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran tekanan (output
pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.

3. Injektor (injector)

            Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom.

Sampel yang akan dimasukkan  ke bagian  ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom.

4. Kolom (coloum)

            Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge, ada
pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil,
oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-partikel
silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.

7
            Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom
dan kondisi percobaan yang sesuai.

            Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1)      Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan
adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini
ada yang 5 cm.

2)      Kolom preparatif: umumnya memiliki  diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya
dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih
tinggi, terutama untuk  kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
Pengepakan kolom tergantung  pada model KCKT  yang digunakan (Liquid Solid
Chromatography,  LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion  Exchange
Chromatography,  IEC, Exclution Chromatography, EC)

5. Detektor (detector)

            Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet
(UV)/Visible, fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang gelombang
eksitasi dan emisi) dan detektor indeks bias.

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di

dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).
Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang
rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe
senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan  fluktuasi temperatur
sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  Detektor KCKT yang
umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat
digunakan  untuk mendeteksi banyak  senyawa dengan range yang lebih luas.
Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang  sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

6. Komputer (PC) dan Printer

8
            Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari
pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan
disebut kromatogram.

2.8 CARA KERJA ALAT HPLC

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel

diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari
injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa
sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu
biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah
terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah
disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah
itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan

dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum
menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih
dahulu dengan menggunakan larutan standar.

     Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama
analisis kromatografi berlangsung. Efek  dari Elusi Gradien adalah 
mempersingkat waktu retensi.

2.9 PROSEDUR PEMAKAIAN HPLC

a. PREPARASI SAMPEL

• Sampel harus dalam bentuk larutan.

• Untuk skala analisis sampel dalam μL, konsentrasi sampel yang diinjeksikan
tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal
adalah sekitar 40 ppm.

9
b. PREPARASI FASA GERAK

 Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade
HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.
 Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore kemudian
diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk
menghilangkan udara terlarut.
 Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan,
untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.
 Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang
digunakan.

c. PENYALAAN ALAT

 Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung

eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat
gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung
pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat
penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa
kembali seperti semula.
 Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).
 Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).
 Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)
 Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)
 Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.

d. MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION

Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul
tampilan :

 Windows NT workstation version 4.00

 Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)

e. PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI

10
 Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih
dahulu untuk menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan juga
dimaksudkan agar alat benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram yang
dihasilkan akan bagus.

Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation,

klik menu Run Control. Kemudian :

 Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.

 Klik menu Instrument, klik pada set up pump
 set gradient fasa gerak
 set laju alir
 set waktu run dan post run

Catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1 uL/menit
untuk menghemat eluen.

 Klik pada kolom, klik control, klik on.

 Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible),
tergantung sample yang akan diinjeksikan.
 Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi kolom
yang diinginkan.
 Klik menu Instrument, klik Set Up DAD Signals untuk mengatur panjang
gelombang detektor yang diinginkan. Masukkan panjang gelombang
pilihan disertai dengan tanda X.
 Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang
lebih 45-60 menit untuk menstabilkan.
 Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang
diinginkan (jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT !
Naikkan Perlahan....Agar tekanan pompa stabil...!

f. PERSIAPAN INJEKSI

TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP

TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING

11
TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI

 Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)

 Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas
 Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan
line dengan jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline
pada skala nol tekan BALANCE.
 Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL,
klik SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut
keterangan sampel.
 Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.
 Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak
utama ke kolom. Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan
ganti dengan sampel lain, kolom harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit),
pencucian masukkan ke dalam file CUCI.

g. CARA INJEKSI

 Ambil alat injek (syringe).

 Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya
metanol)
 Kemudian bilas syringe dengan sampel
 Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi
tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau
gelembung udara
 Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar
terpasang loop 20 uL
 Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas),
injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum
syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress
data aquasition….
 Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk
menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi

12
 puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di
layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...”Run in Progress Data
Analysis”.
 Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka
pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali
sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running
cuci kolom ke dalam file cuci.

h. PRINT OUT KROMATOGRAM

 Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap

sampel yang telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA
ANALYSIS.
 Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih file
mana yang akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang
diinginkan. Segera akan keluar tampilan kromatogram yang dipanggil.
 Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang
dipanggil tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE.
Maka segera akan muncul nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor
yang ada yaitu DAD (Diode Arays Detector) sangat sensitif, maka setiap
puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat terintegrasi sehingga
puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita tampilkan
waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan
saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK
sampai muncul tanda X merah. Atau dapat langsung klik di menu X merah
yang biasanya ada di layar. Untuk menghapusnya, klik dengan X merah
tersebut di tempat-tempat yang waktu retensinya tidak ingin ditampilkan.
 Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik
SPECIFY REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang
diinginkan. Setelah siap, klik PRINT REPORT lalu tunggu sebentar
sampai komputer menampilkan print previewnya. Kemudian klik pada
icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.

13
  Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu
VIEW, klik METHOD AND RUN CONTROL
 Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00)
secepatnya, kemudian tekan ENTER.
 Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.
 Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu
diisi apa-apa, langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG
PASSWORD PADA PENGOLAH DATA !
 Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No
 Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik
pada menu Instrument 1 Online.

Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan pengolahan

data tanpa penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat komputernya
saja). Menu ini misalnya digunakan untuk print out kromatogram yang belum
sempat dilakukan atau untuk melakukan print ulang kromatogram yang sudah
ada.

 Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.

2.10 KELEBIHAN DAN KELEMAHAN HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini
jika dibandingkan dengan metode lainnya.

Kelebihan HPLC:

 Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

 Mudah melaksanakannya
 Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

14
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
ü Resolusi yang baik
 Dapat digunakan bermacam- macam detektor
 Kolom dapat digunakan kembali
 Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang
dianalisis.
 Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi
karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
 Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa
anorganik.
 Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik
didihnya sangat tinggi seperti polimer
 Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan
panas
 Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari
1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk
analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5
menit bisa dicapai
 Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan
rasa diam.
 Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan
rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
 Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat.
 Detektor - detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti

15
 Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga
digunakan dalam HPLC
 Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) .
Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum
dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven
yang digunakan
 Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi
untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar
ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
 Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC
tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detector.
 Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Kekurangan HPLC:

 Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

 Hanya bisa digunakan untuk asam organic
 Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan
gradient elusi
 Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas.

16
 BAB III

PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

1. Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk
zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan
untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap
zat padat tertentu.

17
 2. Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu
sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut
kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia
( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya.
3. Sebagai salah satu metode kromatografi cair (liquid chromatography),
HPLC menggunakan zat cair sebagai fase geraknya. Sampel yang telah
dilarutkan dapat dipisahkan dan dihitung konsentrasi zat spesifik yang
terkandung di dalamnya.

3.2 PERTANYAAN

Notulen : Feli Sabila

1. Siti Qurota Akyuni Reg.2b

 Fase normal dan fase terbalik apakah alat yang digunakan sama?
Jawaban :
(Ilsa Nabila Reg.2b)
Fase normal dan fase terbalik adalah penggunaan alat yang berbeda. Bedanya
terletak pada kolom yang digunakan.
 Apa yang membuat fase terbalik lebih unggul?
Jawaban :
(Meinia Reg.2b)
- Lebih mudah digunakan
- Dapat diaplikasikan untuk molekul dalam range yang luas
- Lebih banyak pilihan kromatografi yang membolehkan
- Mengkontrol dari berbagai tipe solvent-organik, konsentrasi dan pH
- Molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom
 Sebutkan senyawa apa saja pada fase normal dan fase terbalik?
Jawaban :
(Meilin Fadilah Reg.2b)
- Fase Normal, contonya :

18
1. Molekul-molekul hidrofobik (fasa diam)
2. Pelarut-pelarut organik (non polar)
- Fase Terbalik, contonya :
1. Molekul-molekul hidrofilik (fasa diam)
2. Molekul-molekul polar

2. Ratika Reg.2b

 Sampel apa saja yang dapat digunakan dialat ini? Apakah sampe terseut
harus memiliki kriteria yang sesuai dengan fase geraknya?
Jawaban :
(Yoriza Afriola Reg.2b)
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2
macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan
pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
3. Oktarisa Reg.2a

 Perbedaan dari masing-masing detektor tersebut dan masing-masing

detektor tersebut digunakan pada kondisi seperti apa?
Jawaban :
(M.Aldino Putra Reg.2a)
1. Detektor spektrofotometrik 
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara
luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang
yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi
berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang
biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom
guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. 
2. Detektor Fluorometrik 
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis
yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus
di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan
memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-
penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada

19
foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Suatu contoh yang paling
terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah
reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin). 
3. Detektor Elektrokimia 
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya
digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks
baik senyawa organic maupun anorganik. Pendeteksian jenis ini telah digunakan,
misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular
dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin,
norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada
elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda
referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati
semacam jembatan garam.
4. Tharissa Reg.2b

 Apakah sama prinsip kerja HPLC yang menggunakan gas sebagai fase
gerak dengan prinsip HPLC yang mengguanakan zat cair sebagai fase
gerak? Jika sama, sebutkan contoh prinsip HPLC yang menggunakan gas
sebagai fase gerak?
Jawaban :
(Titis Nadhira Reg.2b)
Sumber yang kami dapat mengatakan bahwa KCKT teknik fase geraknya
berbentuk cairan. Jika fase geraknya gas maka teknik yang digunakan adalah
kromatografi gas.

5. Shafa Reg.2b

 Ada 2 jenis kolom pada HPLC, yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Apa perbedaan HPLC yang menggunakan kolom konvensional
dengan yang menggunakan kolom mikrobor?
Jawaban :
(Yuli Agustia Reg.2b)

20
- Kinerja dibuat tabel adalah efesiensi meningkat dengan bekurangna ukuran
partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengn partikel 3 um lebih pendek.
Kolom konvensional sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat, konsumsi
fase gerak hana ¼ dari kolom konvensional.
- Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni :
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hana 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fafse
gerak lebih lambat (10-100ul/menit)
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. sensivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis. Meskipun demikian, dalam praktekna, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
6. Sri Ismawati Reg.2b

 Pada prinsip kerja HPLC, interaksi apa yang terjadi? Suatu senyawa yang
lebih kuat akan bertahan dan sebaliknya? Jelaskan
Jawaban :
(Melisyah Meliana Reg.2a)
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar
atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan
interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat
interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya
senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama.
 Adakah aplikasi jenis selain windows NT workstation version 4.00 yang
digunakan untuk membaca data hasil pengukuran HPLC?
Jawaban :
(Kurniati Munzilah Reg.2b)
Setiap perangkat keras computer ataupun system operasi computer untuk setiap
teknisi berbeda beda. Dalam pengukuran HPLC telah dirancang menggunakan
Windows NT workstation version 4.00 yang mana lebih mempermudah untuk

21
teknisi ilmiah. Sementara sebagai contoh untuk teknisi Arsitektur menggunakan
system operasi computer yang berbeda dengan system operasi computer untuk
ilmiah. Seperti tombol F8 dalam hplc tombol tersebut digunakan untuk
memberhentikan kerja dari hplc, sementara untuk teknisi lain bias saja untuk
membesarkan volume suara perangkat.
 3 jenis injeksi mana yang paling sering digunakan dan kenapa?

7. Sabila Gustiharda Reg.2a

 Kromatografi HPLC ini digunakan untuk mengukur apa saja? Berikan

contoh penggunaan metode kromatografi cair (HPLC) pada bidang
farmasi/kesehatan?
Jawaban :
(Mealdry Dwie Almira Reg.2a)
Salah satu contoh penggunaan metode HPLC pada bidang farmasi yaitu dengan
pengujian kadar parasetamol dalam obat. Diawali dengan menginjeksi larutan
obat dengan injektor, kemudian sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan
bantuan pompa bertekanan tinggi. Didalam komponen-komponen pada sampel
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solute terhadap fase
diamnya, solute dengan interaksi kuat akan keluar terlebih dahulu kemudian akan
dideteksi dengan detektor. Pada analisa ini menggunakan detektor UV, hal ini
dikarenakan parasetamol merupakan zat organik yang dapat menyerap UV.
Selanjutnya analisa ini akan menghasilkan kromatografi berupa peak.
(Khoirun Nisak Reg.2a)
Kegunaan umum HPLC antara lain : pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatil); penentuan
molekul-molekul netral, ionil, maupun zwitter ion; serta isolasi dan pemurnian
senyawa.

8. Almuhibu Sakinah Reg.2a

22
  Adakah pompa dan injeksi yang memang mempunyai satu kinerja (atau
memang sepasang) atau satu fungsi yang sama?
Jawaban :
(Oka Selviana Reg.2a)
Tidak, karena ada 2 jenis pompa HPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Dalam HPLC pompa yang
digunakan harus pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam
reservoi menuju kolom fase diam dan melewati detektor.
9. Elsa Septina Reg.2b

 Apa yang dimaksud dengan mekanisme pemisahan yang lebih variatif?

Jawaban :
(Zafira Fathya Reg.2a)
Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyakna pilihan fase gerak dan fase diam
yang digunakan serta besarna interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak
memungkinkan teradina pemisahan dengan berbagai mekanisme.
10. Devia Lestari Reg.2b

 Jelaskan bagian-bagian alat dan fungsinya serta proses apa yang terjadi
pada alat tersebut?
 Jelaskan dengan bahasa kalian konsep dan prisnsip kerja dari HPLC?
 HPLC adalah pemisah analit molekul berdasarkan kepolaran, komponen
apakah yang dianalisis oleh HPLC?
Jawaban :
(Siska Oktari Reg.2a)
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan
setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif).
Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia
dari analit dalam suatu sanple. Sedangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui
jumlah dan konsentrasi analit tesebut dalam sample.x.
 Jenis zat apa yang dalam analisisnya harus menggunakan HPLC?
Jawaban :

23
(Yoriza Afriola Reg.2b)
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2
macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan
pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
 Jenis analisa apa yang paling ditekankan pada HPLC kualitati/kuantitatif?
Alasannya?
Jawaban :
(Meilin Fadhilah Reg.2b)
Metode ini tidak menitik beratkan pada salah satu pihak antara hasil analisa
kualitatif dan analisa kuantitatf. Karena secara kualitatif HPLC dapat melihatkan
penimpanan waktu (RT) dan specturn 3D dari signal kromatogram dan secara
kuantitatif dapat mengetahui kadar komponen yang dianalisi dalam sampel.
 Wadah fase gerak berupa kaca, bisakah wadah tersebut terbuat dari kaca
adakah dampak yang ditimbulkan jika wadah bukan dari kaca?
Jawaban :
(Widyan Reg.2b)
Kaca dipakai di berbagai percobaan laboratorium / eksperimen / alat alat
laboratorium karena kaca sendiri bersifat inert , atau sukar bereaksi, namun ada
beberapa bahan lain yang dipakai, namun tidak se efisien kaca , yang spesifiknya
adalah kaca borosiklat (borosiclate glass).
 Pada saat digeser terjadi penekanan udara, apa dampak yang akan terjadi
jika dalam analisa HPLC jika udaranya tidak hilang sempurna?
 Fase gerak seperti apakah senyawa zat cair/gas yang dapat digunakan
sebagai fase gerak dalam HPLC?
Jawaban :
(Puput Oktarina Reg.2b)
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki viskositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan “sample recovery”

24
 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Contoh pembuatan fasa gerak

Sebanyak 420 mL KH2PO4 0,01 , ditambahkan metanol20 mL, ditambahkan

asetonil 30mL, ditambahkan isopropil alkohol 30mL, disaringmengguanakan
membran whatman filter PTFE 0,2 um, disonikasi selama 30 menit.

11. Fitri Reg.2b

 Coba jelaskan kembali cara kerja video tersebut dengan bahasa kalian
sendiri yang mudah dipahami?
Jawaban :
(Widyan Reg.2b)
Video tersebut sudah cukup jelas, dan sudah dijelaskan selama presentasi
 Mengapa HPLC termasuk kromatografi kolom?
Jawaban :
(Widyan Reg.2b)
HPLC termasuk kromatografi kolom karena fungsi HPLC itu berprinsip atas
kromatografi kolom, kromatografi kolom itu sendiri adalah metode yang
digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya, atau fase
diam dan fase gerak.

12. Sisi Kurnia Reg.2b

 Cara Pemurnian dari HPLC di ppt kalian coba jelaskan?

Jawanban :
(Rheini Dwi Reg.2b)
Maksudnya dari pemurnian itu bukan memurnikan suatu sampel tapi sampel yang
kita ukur ingin dianalisis itu mengetahui kadar kemurnianna dalam obat atau zat
aktif tersebut misal kita mau menganalisis atau mengetahui kadar kemurnian
paracetamol kita ukur pakai alat HPLC ternyata saat tampil dilayar monitor yang
dideteksi oleh detektor kadar parasetamol dalam obat 100% jadi disimpulkan
kadar Paracetamol itu 100% murni. Dan misalkan juga kita mau menganalisis
kadar etanol 96% ternyata saat di layar monitor yang telah di deteksi oleh detektor
kadar etanol 70% jadi dapat disimpulkan bahwa etanol tersebut tidak sepenuhnya
murni mungkin terkontaminasi bahan lain.

25
 DAFTAR PUSTAKA

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Sumatera Utara

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University

Press. Surabaya.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga,
Jakarta.

26