JURNAL PRAKTIKUM KIMIA PEMISAHAN DAN PENGUKURAN

PENENTUAN KAFEIN DAN NATRIUM BENZOAT DALAM

MINUMAN BERENERGI DENGAN TEKNIKKROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)
Diajukan untuk memenuhi salah satu Tugas Mata Kuliah Praktikum Kimia Pemisahan
dan Pengukuran

Dosen Pengampu: Dra. Hj. Zackiyah, M.Si.

Tanggal Percobaan:
Awal : 22 Maret 2021
Akhir : Maret 2021

Disusun Oleh
Luthfan Kanzi Hazazi Ridwan (1501085)

PROGRAM STUDI KIMIA

DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
2021
 PENENTUAN KAFEIN DAN NATRIUM BENZOAT DALAM
MINUMAN BERENERGI DENGAN TEKNIKKROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)
Tanggal Praktikum : Awal : 23 Maret 2021
Akhir : Maret 2021

1. Tujuan Praktikum
a. Mahasiswa memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
b. Mahasiswa dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta dapat
mengikuti manual pengoperasian HPLC.
c. Mahasiswa dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel
minuman. (kafein dan natrium benzoate)
2. Prinsip Dasar
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi
elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini digunakan oleh para
kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau
senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada
kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa
campuran dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) biasanya dikelompokkan oleh mekanisme pemisahannya ataupun jenis fasa
diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:
a) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair
b) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
c) Penukar Ion atau Kromatografi Ion
d) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
e) Kromatografi Afinitas
f) Kromatografi Kiral

Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi
isokratis dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi
tetap atau campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi
isokratik. Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut
dalam suatu sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan.
Perbandingan dari kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah
ditentukan dengan program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan
 ini kadang dilakukan secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien
seringkali meningkatkan efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada
GC. Instrumen HPLC modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan
sehingga dapat memasukkan cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan
yang dapat divariasikan secara terus menerus.
(Skoog, 2004: 973-977)
Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang
sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua
persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC

yang menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan
terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang
tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga
data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan
gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif
terhadap udara (contoh :kolom berikatan dengan NH2).

(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)

Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

• Reservoir (wadah pelarut / cairan)
• Pompa
• Sistem injeksi sampel
• Kolom, terdiri dari
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
• Detektor
• Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan

dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur
cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.

Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.

Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom.
Pompa yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang ‘reproducible’
2) Harus menghasilkan aliran yang ‘pulse-free’ (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
(R.P. Budhiraja, 2004: 172)
 Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu,
sampel dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia
pada volume 0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop
terisolasi dari fasa gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan
kapasitas beberapa kali dari loop sampling digunakan untuk menempatkan sampel
kedalam loop.

Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel dengan
diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30 mm
sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel
silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi
sebagai tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel
menurunkan performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang.
Kedua, material partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom
analitik. Maka dari itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk
meminimalisasi masalah-masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material
partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih
pendek dan murah. Panjangnya 7,5 mm dan harganya satu persepuluh dari kolom
analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard digunakan sebagai “tumbal” dan diganti
secara berkala.

Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor

ini berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan.
Detektor-detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
• Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)
• Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index
refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-
komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.
(Harvey David, 2000: 578-585)
Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan
atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti
KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para
analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini
dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya
digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan
zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam
zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul
besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas
rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan tipe
eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
melewati detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat

digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,
pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
standar. Oleh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik
kurva kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet
obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti
C-18 dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut.

(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)

Kafein

Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa heterosiklik yang

majemuk, yang merupakan kondensasi antara lingkar imidazol dan lingkar pirimidin).
Dengan rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam biji-biji kopi dan daun teh.
Kristal kafein berbentuk jarum-jarum berwarna putih, tidak berbau, dan berasa pahit.
Kafein yang tidak mengandung kristal mencair pada suhu 238 °∁. Kafein larut dalam
larutan pirol dan tetrahidrofuran. Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya
asam-asam organik.
(Damin Sumardjo, 2009: 447)
Natrium Benzoat
Natrium benzoat merupakan garam atau ester dari asam benzoat secara komersial
yang dibuat dengan sintesis kimia.Sifat-sifat natrium benzoat (C7H5NaO2) adalah
sebagai berikut: berat molekul 144,11; pemerian granul atau serbuk hablur; putih; tidak
berbau dan praktis tidak berbau; stabil di udara; kelarutan mudah larut dalam air; agak
sukar larut dalam etanol dan lebih mudah larut dalam etanol 90% (Anonim, 1994).

Gambar 1.Struktur kimia natrium benzoate (Ratnani, 2009)

Menurut Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik

Indonesia Nomor 36 Tahun 2013 batas penggunaan asam benzoat dan garamnya
(natrium benzoat, kalium benzoat, dan kalsium benzoat) dalam bahan makanan adalah
0-5 mg/kg berat badan. Dalam penggunaanya, asam benzoat dan garamnya umumnya
dapat ditambahkan secara langsung ke dalam makanan atau dilarutkan terlebih dahulu
di dalam air, oleh karena itu lebih sering digunakan dalam bentuk garamnya yaitu
natrium benzoate.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
- Perangkat HPLC 1 set
- Labu ukur 100 mL 1 buah
- Labu ukur 10 mL 6 buah
- Pipet tetes 3 buah
- Gelas kimia 20 mL 2 buah
- Gelas kimia 500 mL 1 buah
- Ultrasonic vibrator 1 set
- Mikroburet 10 mL 1 buah

2. Bahan
- Natrium benzoat p.a. secukupnya
- Kafein secukupnya
- Sampel hormoviton secukupnya
- Aquabides secukupnya
- Asetonitril + KH2PO4 secukupnya
- Metanol dan
asetonitril
untukperangkat
HPLC

D. LangkahKerja

a. Pembuatan fasa gerak (Pelarut)

Labu takar 100ml
-Hitunglah jumlah KH2PO4 yang diperlukan untuk
membuat larutan KH2PO4 0.01 M sebanyak 500mL
dalam akuades. Kemudian ‘ajust’ pH pada nilai 2,65
dengan asam fosfat.
-Lakukan penyaringan untuk larutan KH2PO4
menggunakan membran selulosa nitrat
-Lakukan penyaring pula untuk asetonitril dengan
PTFE
-Hilangkan gelembung pada larutan dengan ultrasonic
vibrator selama 15 menit.
-Buatlah campuran larutan fasa gerak KH2PO4 dan
asetonitril (60:40) untuk keperluan larutan standar dan
larutan sampel, sesuai kebutuhan

b. Pembuatan larutan induk natrium benzoat, Vit C, dan

kafein
natrium benzoat, Vit C, dan kafein
-Timbanglah zat standar natrium benzoat 20mg, vit C 20
mg dan kafein 20 mg
-Campurkan ketiga zat standar dengan melarutkan dalam
50 mL fasa gerak secara kuantitatif pada labu ukur.
-Homogenkan selama 5 menit menggunakan ultra sonic
vibrator.
c. Pembuatan deret larutan standar natrium benzoat, Vit C,
dan kafein
natrium benzoat, Vit C, dan kafein
-Pipet larutan induk masing-maing 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL,
dan 5 mL encerkan dengan fasa gerak dalam labu ukur
10 mL.
-Homogenkan larutan, kemudian, saringlah semua larutan
standar tersebut dengan menggunakan membrane PTFE.
-Tempatkan hasil saringan ke dalam vial bertutup yang telah
diberi label.
-Lakukan degassing selama 5 menit. Larutan standar siap
diinjeksikan.

d. Pembuatan larutan sampel

Sampel
-Pipet 5 mL larutan sampel larutkan dengan fasa gerak hingga
10 mL secara kuantitatif pada labu ukur.
-Lakukan penyaringan dengan PTFE, tampung dalam botol vial
bertutup.
-Hilangkan gelembung pada larutan sampel dengan
menggunakan ultrasonic vibrator selama 5 menit.

e. Penyiapan Instrumen HPLC

Spektrofotometri UV/Vis
-Lakukan cuci kolom dengan methanol hingga baseline lurus
dan lihat noise test.
-Lakukan uji kesesuain alat dengan menginjeksikan standar
sebanyak 6 kali lakukan.
-Atur kondisi analisis dengan sistem elusi gradien dengan data
sebagai berikut:

-Setelah baseline lurus dengan kondisi kromatografi yang

digunakan lakukan injeksi standar mulai dari konsentrasi
terkecil, lalu sampel.
-Sebelum Anda membuat grafik kurva kalibrasi lakukan
perhitungan dari konsentrasi masing-masing standar.
-DAFBuat kurva kalibrasi antara konsentrasi standar dan
area yang dihasilkan
E. Daftar Pustaka
Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International (p) Ltd.
David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill
De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi Jurnal, hlm. 5-8.
Ellis, Frank dkk. (2002). Paracetamol-a curicullum resource. United Kingdom :
Royal Society of Chemistry
Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson Brooks/Cole
Sumardjo, Damin. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran. Jakarta : EGC
Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2015). Instruksi Kerja Penentuan
Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik HPLC. Bandung: UPI