Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High Performance Liquid Chromatography)

I.

TUJUAN PERCOBAAN
I.1 Dapat menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
I.2 Dapat mengoperasikan alat HPLC dengan baik dan benar
I.3 Dapat menganalisa senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif dengan
menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi

II.

DASAR TEORI
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi elusi

yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknik ini digunakan oleh para kimiawan
untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau senyawa seperti
senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada kromatografi cair, fasa gerak
merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran dari bahan-bahan terlarut. Jenisjenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya dikelompokkan oleh mekanisme
pemisahannya ataupun jenis fasa diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:
a)
b)
c)
d)
e)
f)

Partisi atau Kromatografi Cair-Cair

Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
Penukar Ion atau Kromatografi Ion
Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
Kromatografi Afinitas
Kromatografi Kiral

Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi isokratis dan
elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau
campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi isokratik. Sedangkan
pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu sistem yang
memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari kedua atau lebih
pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan program saat pemisahan
berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan secara terus-menerus dan
kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan efisiensi pemisahan, seperti
halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC modern biasanya dilengkapi dengan
katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan cairan dari dua atau lebih reservoir
dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara terus menerus.

Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang
digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu
rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di
atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC yang
menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan

terutama bila

detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan
menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak
dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik
bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh: kolom berikatan
dengan NH2).
Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

Reservoir (wadah pelarut / cairan)

Pompa
Sistem injeksi sampel
Kolom, terdiri dari
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
Detektor
Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan

dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur cairancairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa. Pelarut
dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa yang
digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang reproducible
2) Harus menghasilkan aliran yang pulse-free (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel
dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume 0,5
mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa gerak dan
terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari loop sampling
digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel dengan
diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30 mm sampai
300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel silika berpori yang
dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan
berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa hidupnya.
Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan performa
kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material partikulat yang

diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari itu, kolom guard
ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah-masalah tersebut. Kolom
guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan kolom
analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5 mm dan harganya satu
persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard digunakan sebagai tumbal
dan diganti secara berkala.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektordetektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:

Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)

Detektor elektrokimia

Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index refraksi
dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-komponen fasa
gerak memiliki index refraksi yang mirip.
Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal
kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan

yang sama

membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak
diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap,
KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi
akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga
menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas
detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara
lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang
dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektordetektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram(10-12
gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll
dapat juga digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis
solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat zat yang tidak
bisa

dianalisis dengan

KG karena volatilitas rendah

, biasanya diderivatisasi untuk

menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk
mengalissis zat zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah

melewati

detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi

penukarion memerlukan prosedur khusus.
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram,
dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan

kurang

menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka
pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet obat
yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan
senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini memungkinkan analisis
dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar
campuran beberapa pelarut.
III.

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

3.1 Alat
1. Perangkat HPLC + Injektor + Pencetak Kromatogram
2. Kolom licosphere C-18
3. Syiringe
4. Penyaring milipone
3.2 Bahan

1. Cafein 15 ppm
2. Metanol
IV.

LANGKAH KERJA
1. Terlebih dahulu menyiapkan fase gerak yang akan digunakan dan memasukkan ke
botol fase gerak yang tersedia.
2. Memeriksa ketersediaan cairan seal wash pada pompa, bila habis (sudah lama,
harap ditambahkan)
3. Memasang kolom sesuai kebutuhan analisa (posisi panah kolom ke arah bawah)
4. Menyalakan instrument, pompa, detektor (tombol power ada dibelakang
5.
6.
7.
8.
9.

instrument)
Menjalankan CPU komputer dan monitor
Mengaktifkan server monitor pada pojok kanan bawah layar monitor
Membuka software choromeon 6.8
Membuka panel instrument (bila ada warning tekan ok)
Melakukan koneksi software pada instrument dengan memberi tanda ceklis pada

pump dan detektor

10. Melakukan purging pada channel fase gerak yang akan digunakan :
Melakukan knob purging pada pompa
Mengatur presentasi pada pompa
Klik purge pada software
Bila selesai purging, menutup kembali knob purgenya
11. Mengalirkan kolom dengan fase gerak yang diinginkan pada flow 1 ml/menit
12. Menyalakan lampu UV/VIS pada detektor sesuai kebutuhan analisa
13. Membiarkan kolom beraliri fase gerak selma 30-60 menit
14. Memindahkan window software ke posisi browser
15. Membuat squent, instrument method (program) dan processing data
16. Bila sequent, program dan method telah dibuat, klik batch start
17. Mengklik ready check untuk memastikan sequent telah siap running, lalu start
18. Melakukan injeksi standard dan sample
Catatan : bila ingin menginjek sample, posisi injeksi pada posisi LOAD (atas), bila
sudah ada warning waiting for injection, lalu memutar injektor ke posisi inject
19. Melakukan processing data (ada pada logam bagian prose kuantitas)
20. Bila analisa anda telah selesai, mencuci terlebih dahulu kolom yang digunakan
dengan kandungan air : Me OH selama 30-60 menit
21. Mengakhiri pencucian kolom dengan dialiri methanol 100% selama 30 menit
22. Mematikan flow pompa dan lampu yang digunakan
23. Menutup software cromelon beserta monitornya
24. Mematikan instrument HPLC dan softwarenya

VI.

ANALISA DATA
Kali ini bertujuan untuk menentukan kadar kafein menggunakan instrumen HPLC

(High Performance Liquid Chromatography). Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan

perbedaan distribusi komponen-komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan
fase diam. Fase gerak yang digunakan berupa sample. Sedangkan fase diam yang digunakan
adalah kolom yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini menggunakan
metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan fase
diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama analisis digunakan
fase gerak dengan perbandingan pelarut yang tetap.
Digunakan aquabidest karena dalam analisis menggunakan HPLC diperlukan pelarut
dengan kemurnian yang tinggi, sebab larutan sampel yang akan dianalisis jumlahnya sangat
sedikit (sekitar 20l) sehingga apabila digunakan pelarut dengan kemurnian kurang akan
dapat mengganggu hasil pemisahan.
Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis
kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi komponen dalam sampel dengan
waktu retensi standar. Puncak yang akan muncul pada kromatogram adalah puncak komponen
caffeine terlebih dahulu.
Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar kafein dalam sampel
berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kurva kalibrasi larutan derat standar yang
dibuat dari pengenceran. Kadar analit dapat ditentukan dengan menghitung konsentrasi analit
menggunakan persamaan garis y = mx + b yang diperoleh dari kurva kalibrasi deret standar.
Namun, apabila luas area puncak analit tidak masuk dalam area deret standar maka digunakan
perbandingan konsentrasi dan luas area deret standar dengan sampel.
Sebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada keadaan
optimal agar hasil pemisahan yang didapatkan baik. Kemudian baik sampel maupun deret

standar, sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan degassing untuk

menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat terkumpul di kepala pompa
ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC.
Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar kafein dalam 3 sample dengan ret time
antara 3.94, 3.95 dan 3.95 dengan luas area berjarak antara 9.534, 9.535 dan 9.524 sebesar
8.612 ppm, 0.971 ppm, dan 9.992 ppm.
Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini di
antaranya, masih terdapat gelembung setelah dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian
instrument yang kurang tepat sehingga mempengaruhi hasil kromatogram yang akan didapat.
VII.

KESIMPULAN
Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar kafein dalam 3 sample dengan ret time

antara 3.94, 3.95 dan 3.95 dengan luas area berjarak antara 9.534, 9.535 dan 9.524 sebesar
8.612 ppm, 0.971 ppm, dan 9.992 ppm.

DAFTAR PUSTAKA
Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrument Politeknik Negeri Sriwijaya 2016
GOOGLE
http://www.scribd.com
http://wikipedia.com

LAMPIRAN FOTO

Instrumen HPLC
Pelarut/ Fasa Gerak

Deret Larutan Standar/ Larutan sampel

siap diinjeksikan, sudah tidak terdapat
gelembung dalam syringe.
Pelarut/ Aquades