KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ( HPLC )

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :
• Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
• Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dan benar
• Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif
dengan menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi

II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

Alat yang Digunakan:
• Perangkat HPLC + Injektor + pencetak kromatogram
• Kolom licosphere C-18
• Syiringe  Penyaring milipone

Bahan yang digunakan :

• Cafein 20 ppm
• Methanol

III. DASAR TEORI

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan
HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun
1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra
lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asamasam
nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid
Chromatography) merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat
berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan
biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi.

KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa

tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam
cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil
samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi;
memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan
senyawasenyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan
distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti
jalannya reaksi sintetis. Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi
senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS).
Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang
baik sulit diperoleh.
Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam
yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang
berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada
perbedaan laju migrasi masing- masing komponen dalam sistem kromatografi.
Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari
perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak
dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar
pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu
diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa
cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada
kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan
analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya
dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative
singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang
sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus
diperhatikan, dan detector yang memadai.
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair– cair yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area
puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan
standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis
senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral,
ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-
senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan
jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala
proses industry.
Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau
zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut
dalam fase gerak dan fase diam.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis
senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral,
ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan
senyawasenyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa
dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak dan dalam skala
proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari
berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan
diameter kolom, kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak
3. Alat untuk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Suatu komputer atau integrator atau perekam

1. Wadah fase gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase
gerak harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak
maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan
kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan
digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).

2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting
dalam pemilihan fase gerak.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi. 2)
Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang
berfungsi sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok
dengan detektor.

3. Pompa
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant
pressure) dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan
konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),
oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif
terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas.
Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan
konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tekanan konstan.

Syarat – syarat pompa yang ideal:

a. Mampu membangkitkan tekanan tinggi
b. Pulse free – out put
c. Control laju alir yang akurat
d. Tahan korosi
e. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
f. Bebas pulsa
g. Perlu“de gasser”
h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
i. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
j. Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

4. Injektor (penyuntikan sampel)

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan
anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat
dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi
gas (jika anda telah mempelajarinya).
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke
kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1
%. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan
untuk autosampler pada KCKT.
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu
yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagaiwaktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana
sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu
retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom. Efek dari Elusi
Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan
kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien
menawarkan beberapa keuntungan :
Column Oven pada HPLC berfungsi untuk menjaga suhu atau temperature
pada range tertentu, hal ini dilakukan karena pengukuran nilai pada mobile phase
bisa berubah pada suhu yang berbeda. Artinya, jika sample diberikan perlakuan yang
sama pada suhu yang sama akan meningkatkan ke-akuratan proses pengambilan
data. Pada HPLC juga anda akan berhubungan dengan phase, orang sering juga
menyebutnya fase, fase dalam HPLC ada dua jenis, yakni normal dan terbalik. Pada
fase normal yang menjadi fase diam adalah kolom yang bersifat polar, sedangkan
fase geraknya non polar. Sedangkan pada fase terbalik, fase diamnya bersifat non
polar dan fase geraknya polar. Polar pada umumnya memiliki sifat larut dalam air
atau rantai karbon

5. Detektor

Detektor digunakan untuk mendeteksi suatu zat atau sample. Sifat-sifat detektor
yang diperlukan adalah mempunyai spesifitas tinggi, bersifat linear untuk jangka
konsentrasi tertentu dan dapat mendetek dieluen tanpa mempengaruhi resolusi
kromatogram. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa
gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika
dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:

a. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

b. Mudah melaksanakannya
c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
e. Dapat digunakan bermacam- macam detektor
f. Kolom dapat digunakan kembali
g. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang
dianalisis.
h. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi
karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
i. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik
didihnya sangat tinggi seperti polimer
k. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
l. Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1
jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk
analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit
bisa dicapai
m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa
diam.
n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa
gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat.
p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis
yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang
diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
r. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk
menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

s. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC

tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
 diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detector.
t. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi
penukar ion memerlukan prosedur khusus.
Sedangkan kekurangannya adalah:
a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient
elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas

IV. LANGKAH KERJA

A. Pembuatan larutan standar caffein
1. Menimbang 50 mg caffein murni
2. Membuat pelarut organik sebanyak 500 ml ( 49% aquabidest + 51% methanol)
3. Melarutkan caffein menggunakan pelarut yang telah dibuat dan memasukkan
ke dalam labu takar 500 ml lalu ditanda bataskan.
4. Memipet 1 ml larutan caffein dalam 50 ml pelarut
5. Menyaring larutan dengan membran dan menghitung konsentrasinya.

B. Pembuatan larutan sampel

1. Menimbang 10 tablet dan menentukan berat rata-rata tablet
2. Menggerus tablet menggunakan mortar
3. Menimbang 50 mg dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 ml
4. Menambahkan pelarut dan mengencerkan, lalu ditanda bataskan
5. Mengambil 1 ml larutam ke dalam 50 ml pelarut lalu ditanda bataskan
6. Menyaring larutan menggunakan membran whatman PFTE

C. Prosedure operational instrument HPLC thermo-dionex:

1. Terlebih dahulu menyiapkan fase gerak yang akan digunakan untuk analisa
dan masukkan ke botol fase gerak yang tersedia.
2. Memeriksa ketersediaan cairan seal wash pada pompa, bila habis / sudah lama
harap di tambah / ganti dengan aquadest baru.
3. Memasang kolom sesuai kebutuhan analisa.
4. Menyalakan instrument : pompa, detektor ( tombol power ada dibelakang
instrument)
5. Menyalakan CPU komputer dan monitor.
6. Mengaktifkan server monitor pada bagian pojok kanan bawah layar monitor.
7. Membuka software chromelon 6,8
8. Membuka panel instrument : (bila ada warning tekan ok)
9. Melakukan koneksi software dengan instrument, caranya dengan memberi
cheklist pada pump dan detektor.
10. Melakukan purging pada chanel fase gerak yang akan digunakan:
a) Membuka knop purging
b) Mengatur prosentasi pompa
c) Meng-klik purge pada software
Bila selesai jangan lupa menutup kembali knob purging.
11. Mengalirkan fase gerak ke kolom dengan flow 1ml/mnt.
12. Menyalakan lampu Uv-vis pada detektor sesuai kebutuhan analisa.
13. Membiarkan kolom teraliri fase gerak selama 30-60 menit
14. Memindahkan window software ke posisi browser.
15. Membuat sequence, instrument methode program dan processing data
(rincian ada pada bagian selanjutnya)
16. Bila sequence, program dan instrument methode telah dibuat, kik batch start
17. Meng-klik ready check untuk memastikan sequence telah siap running, lalu
start
18. Melakukan injeksi standar dan sampel.
Note : Bila ingin menginjeksi sampel, posisi injektor ada pada posisi load
(atas). Bila sudah ada warning waiting for injection, lalu putar injektor
ke posisi INJECT

19. Melakukan processing data ( ada pada bagian proses kuantitasi )

20. Bila analisa telah selesai, mencuci terlebih dahulu kolom yang digunakan
dengan kandungan air : MeOH selama 30-60 menit
21. Mengakhiri pencucian kolom dengan dialiri metanol 100% selama 30 menit.
22. Mematikan flow pompa dan lampu yang digunakan 23. Menutup software
chromelleon beserta server monitornya
24. Mematikan instrument HPLC dan komputernya.

Cara membuat sequence

1. Meng-klik new ---> sequence --> ok

2. Meng-klik next tanpa mengubah ketentuan informasi yang ada
3. Lalu meng-klik finish

Cara membuat program

1. Meng-klik new ---> program file ---> ok

2. Meng-klik my computer ---> HPLC ---> next
3. Memasukkan konsentrasi fase gerak yang diinginkan, dan flow rate yang
digunakan ---> next
4. Memasukkan waktu run time setiap injektor ---> next
5. Memasukkan panjang gelombang yang diinginkan ---> next
6. Lalu simpan, file ---> memberi nama ----> save

Cara membuat methode file HPLC

1. Meng-klik file ---> new

2. Meng-klik methode file ---> OK
3. Mengklik file ---> save as
4. Mencari folder yang diinginkan ---> memberi nama method-nya ---> save

Cara Kuantitasi data HPLC

1. Pada window browser, double klik salah satu standar

2. Akan muncul hasil data Uv-vis lalu meng-klik QNT
3. Meng-klik general, memasukkan dimension of amounts, mis : ppm
4. Meng-lik detection ---> melakukan pengaturan integrasi, mis : minimum area :
0,1
5. Meng-klik peak table ----> mengarahkan panah ke tengah peak ---> mengisi
nama zat ---> meng-klik add peak to peak ---> close, lalu menghapus baris
peak 1 yang tak bernama.
6. Meng-klik amount title ---> memasukkan amount of consentrate standart,
mis : 60 ppm
7. Meng-klik save
8. Meng-klik printer layout
9. Tampil hasil proses data baik standar maupun sampel ----> print 10. Meng-
klik next sample untuk melihat data injeksi selanjutnya ----> print Memprint
semua data yang dibutuhkan.
DATA PENGAMATAN
No Sampel Luas Area

1 Standar caffein 2,744

2 Bodrex 2,799

3 Paramex 3,276

4 Oskadon 2,445

PERHITUNGAN

• Konsentrasi Larutan Standar Caffein

Massa kafein murni = 50 mg

Volume larutan = 500 ml = 0,5 L
Ppm awal = 𝑚𝑔
𝐿

= 50 𝑚𝑔
0,5 𝐿

= 100 ppm
• Ppm setelah memipet 1 ml larutan dalam 50 ml pelarut
M1 = 100 ppm
V1 = 1 ml V2
= 50 ml M2
=?
M1 x V1 = M2 x V2
100 ppm x 1 ml = M2 x 50 ml
M2 = 100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 1 𝑚𝑙
50 𝑚𝑙

M2 = 2 ppm
• Kadar kafein dalam sampel
Bodrex
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
=
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛

Ppm sampel = 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

x ppm standar caffein
𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛

Ppm sampel = 2,799

x 2 ppm
2,744

Ppm sampel = 2,0401 ppm

Paramex
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛

Ppm sampel = 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

x ppm standar caffein
𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛

Ppm sampel = 3,276

x 2 ppm
2,744

Ppm sampel = 2.3878 ppm

Oskadon
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

=
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛

Ppm sampel = 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

x ppm standar caffein
𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛

Ppm sampel = 2,445

x 2 ppm
 2,744

Ppm sampel = 1.7821 ppm

• Berat caffein dalam vial

Bodrex Berat caffein dalam 10 tablet =
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
x massa rata-rata
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 1 𝑏𝑢𝑡𝑖𝑟

obat Berat caffein dalam 10 tablet = 50 𝑚𝑔

x
0,8366 gr
50 𝑚𝑔

Berat caffein dalam 10 tablet = 0,8366 gr

Paramex Berat caffein dalam 10 tablet =

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
x massa rata-rata
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 1 𝑏𝑢𝑡𝑖𝑟

obat Berat caffein dalam 10 tablet = 50 𝑚𝑔

x
0,7357 gr
50 𝑚𝑔

Berat caffein dalam 10 tablet = 0,7357 gr

Oskadon Berat caffein dalam 10 tablet =

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
x massa rata-rata
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 1 𝑏𝑢𝑡𝑖𝑟

obat Berat caffein dalam 10 tablet = 50 𝑚𝑔

x
0,6924 gr
35 𝑚𝑔

Berat caffein dalam 10 tablet = 0,9891 gr

I. ANALISAPERCOBAAN
Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar caffeine dalam sampel
obat dengan menggunakan instrumen HPLC. Kromatografi cair berperforma
tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu
teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya
terhadap zat padat tertentu. Sampel obat yang digunakan adalah jenis obat sakit
kepala yaitu panadol danbodrex.
Langkah pertama yang dilakukan adalah membuat pelarut yang merupakan
campuran antara metanol 51% dan aquabidest 49% dalam 500 ml. Selanjutnya
membuat larutan standar caffeine dengan menimbangnya sebesar 0,05 gr
standar dan dilarutkan dengan 500 ml pelarut. Kemudian memipet 1 ml larutan
dalam 50 ml pelarut. Setelah itu, semua sampel obat ditimbang per tablet lalu
didapatkan berat rata-rata nya. Kemudian sampel digerus dan diambil setara 50
mg dari komposisi caffeine dari masing – masing obat dikali dengan berat rata-
rata. Sampel lalu dilarutkan dengan menggunakan pelarut dalam labu takar 50
ml. Selanjutnya, larutan standar dan larutan sampel dihomogenkan dengan
ultrasonic vibrator. Kemudian, masing-masing larutan tersebut disaring dengan
menggunakan saringan membran agar diperoleh larutan sampel murni tanpa ada
partikel-partikel pengganggu / pengotor yang dapat mempengaruhi hasil
pemisahan.
Alat HPLC dan software pada komputer telah diset sesuai dengan kebutuhan
pengukuran. Larutan standar maupun larutan sampel yang diinjeksikan ke
septum menggunakan syringe sebanyak 20µl. Sebelum diinjeksikan, syringe
dibilas terlebih dahulu dengan menggunakan larutan yang akan diinjeksikan.
Larutan standar diinjeksikan terlebih dahulu. Kemudian dilanjutkan dengan
menginjeksikan larutan sampel. Larutan yang masuk kemudian dialirkan oleh fase
gerak menuju kolom dengan bantuan pompa. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen yang didasarkan pada tingkat kepolaritasan dari setiap
komponenkomponen yang ada di dalam campuran. Setelah keluar dari kolom
akan terdeteksi oleh detektor yang kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram yang menghasilkan puncak.
 Analisis kualitatif dilakukan dengan melihat waktu retensinya. Hasil yang
didapat waktu retensi untuk larutan standar yaitu 2,81 menit, sampel bodrex
3,38 menit, sampel panadol 4,11 menit dan sampel paramex 2,74. Kemudian
didapatkan juga data berupa tinggi dan area dari masing-masing cuplikan.

I. KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid
chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat
cair yang biasanya disertai dengan tekanantinggi.
2. Pelarut yang digunakan yaitu campuran metanol 41% dan aquabidest59%.
3. Waktu retensi untuk larutan standar yaitu 2,81 menit, sampel bodrex 3,38
menit sampel Paramex 2,74 menit dan sampel oskadon 4,11 menit.
4. Tinggi dan area yangdihasilkan:
• Tinggi yang dihasilkan dari std. caffeine 116,208 mAU dan area 2.744
mAu*min.
• Tinggi yang dihasilkan untuk sampel paramex 131,648 mAU dan area
3.276 mAU*min.
• Tinggi yang dihasilkan untuk sampel bodrex 121,088 mAU dan area 2.799
mAU*min.

• Tinggi yang dihasilkan untuk sampel oskadon 102.992 mAU dan area
2,445 mAU*min
GAMBAR ALAT

Seperangkat alat HPLC

Syringe
DAFTAR PUSTAKA
Kasie Laboratorium Kimia Analitik Instrumen. 2020. Penuntun Praktikum Kimia Analitik
Instrumen. Palembang : Politeknik Negeri Sriwijaya.

Andiran, Eka. 2013. HPLC. Diakses dari

https://ekaandrians.blogspot.com/2013/04/hplc.htmlpada tanggal 1 Desember
2020.

Deda, Putri. 2018. Laporan Praktikum HPLC. Diakses dari

https://pfanesha.blogspot.com/2018/11/laporan-praktikum-hplc.htmlpada tanggal 1
Desember 2020.