LIQUID

CHROMATOGRAPHY
Laboratorium Lingkungan (TPL62011/2/W)

Program S1 Teknik Lingkungan

UNIVERSITAS BRAWIJAYA
 Liquid Chromatography

Liquid Chromatography (kromatografi cair) adalah teknik pemisahan yang melibatkan:

1. Penempatan (injeksi) dari sedikit volume sampel cair
2. Tabung yang dikemas dengan partikel berpori (fase stationary/diam)
3. Masing-masing komponen sampel diangkut sepanjang tabung kemasan (kolom) dengan cairan
dipindahkan oleh gravitasi.

Komponen sampel yang dipisahkan satu sama lain oleh kemasan kolom yang melibatkan berbagai
bahan kimia dan/atau interaksi fisik antara molekul dan partikel kemasan. Komponen yang
dipisahkan dikumpulkan di pintu keluar dari kolom ini dan diidentifikasi oleh teknik pengukuran
eksternal, seperti spektrofotometer yang mengukur intensitas warna, atau dengan perangkat lain
yang dapat mengukur jumlah mereka.
 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang juga dikenal dengan High Pressure
LC telah beredar selama 35 tahun dan merupakan teknik pemisahan terbesar yang digunakan.
Sejarah dari HPLC yaitu:

• Bermula pada tahun 60an; memulai HPLC sebagai High Pressure Liquid Chromatography.
• Pada akhir tahun 70an melakukan impruvisasi dari material kolom dan instrumentasi – High
Performance Liquid Chromatography.
• Sejak permulaan tahun 80an: “boom” pada HPLC dimulai.
• Sejak tahun 2006 istilah baru muncul seperti UPLC, RRLC, UFLC, RSLC, dan sebagainya.

HPLC pada tahun 1973

HPLC pada tahun 2009
 Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC/MS)

Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC/MS) adalah teknik analisis yang menggabungkan
kemampuan pemisahan kromatografi cair dengan kemampuan analisis massa spektrometri. LC/MS
berorientasi pada deteksi spesifik dan identifikasi potensi bahan kimia dengan bahan kimia lainnya
(campuran).
Prinsip Kerja Liquid Chromatography
 Prinsip Kerja HPLC

HPLC digunakan untuk separasi dan analisa non-volatil atau senyawa terma tidak stabil. HPLC optimal
untuk separasi dari senyawa kimia dan biologi yang non-volatil. Berikut beberapa tipikal senyawa no-volatil:

• Farmasi seperti aspirin, ibuprofen, atau asetaminofen (Tylenol)

• Garam seperti natrium klorida dan kalium fosfat
• Protein seperti putih telur atau protein darah
• Bahan kimia organik seperti polimer (misalnya polystyrene, polyethylene)
• Hidrokarbon berat seperti aspal atau oli motor
• Banyak produk alami seperti ginseng, obat-obatan herbal, ekstrak tumbuhan
• Senyawa termal tidak stabil seperti trinitrotoluena (TNT), enzim
 Prinsip Kerja HPLC
•Analisis Kualitatif
Identifikasi (ID) dari masing-masing senyawa dalam sampel;
▪ parameter yang paling umum untuk senyawa ID adalah waktu retensi (waktu yang dibutuhkan untuk senyawa
khusus untuk terelusi dari kolom setelah injeksi);
▪ tergantung pada detektor yang digunakan, senyawa ID juga didasarkan pada struktur kimia, berat molekul atau
beberapa parameter molekul lainnya.

Retensi Waktu
 Prinsip Kerja HPLC
2. Analisis Kuantitatif
Pengukuran jumlah senyawa dalam sampel (konsentrasi); yang berarti, ada berapa banyak? Ada dua cara utama
untuk menafsirkan kromatogram (yaitu melakukan kuantifikasi):
1. Penentuan ketinggian puncak dari puncak kromatografi diukur dari garis dasar;
2. Penentuan dari daerah puncak;
Dalam rangka untuk membuat penilaian kuantitatif senyawa, sampel dengan jumlah yang diketahui senyawa
disuntikkan dan tinggi puncaknya atau daerah puncak diukur. Dalam banyak kasus, ada hubungan linear antara
tinggi atau daerah dan jumlah sampel.
 Prinsip Kerja HPLC

3. Preparasi senyawa murni

• Dengan mengumpulkan puncak kromatografi di pintu keluar dari detektor,
• Konsentrasi senyawa (analit) dengan menghapus/penguapan pelarut,
• Zat murni dapat dipersiapkan untuk digunakan nanti (misalnya sintesis organik, studi klinis, studi
toksikologi, dll).
• Metodologi ini disebut kromatografi preparatif.

Kromatogratif prepatarif
 Prinsip Kerja HPLC
4. Analisis Trace
Senyawa trace adalah senyawa yang menarik bagi analis tapi konsentrasi sangat rendah, biasanya kurang dari
1% berat, sering bagian per juta (ppm) atau lebih rendah;
- penentuan senyawa trace sangat penting dalam farmasi, biologi, toksikologi, dan studi lingkungan karena
bahkan zat jejak bisa berbahaya atau beracun;
- dalam kromatogram zat jejak bisa sulit untuk dipisahkan atau dideteksi;
- resolution separatioseparasi resolusi tinggi dan detector yang sangat sensitif diperlukan.
 Prinsip Kerja HPLC
Cara kerja HPLC sama dengan LC kecuali pada kecepatan, secara efisien, sensivitas, dan keringanan pada pengoperasian HPLC superior cepat. HPLC
merupakan teknik separasi yang meliputi:
• Injeksi volume kecil dari sampel cair
• Tabung yang dikemas dengan partikel kecil (3 hingga 5 mikron (µm) pada diameter yang disebut fase stasionari)
• Masing-masing komponen sampel dipindah ke tabung kemasan (kolom) dengan cairan (mobile phase) melalui kolom dengan tekanan tinggi yang dikirim oleh
pompa.

Komponen sampel yang dipisahkan satu sama lain oleh kemasan kolom yang melibatkan berbagai bahan kimia dan/atau interaksi fisik antara molekul dan
partikel kemasan. Komponen yang dipisahkan dikumpulkan di pintu keluar dari kolom ini dengan aliran melalui alat (detektor) yang mengukur jumlah mereka.
Sebuah keluaran dari detektor ini disebut “liquid chromatogram”. Seperti apakah liquid chromatogram dapat dilihat pada Gambar dibawah. Gambar menjelaskan
hasil kromatogram dari injeksi volume kecil dari cairan ekstraksi kampus vitamin E yang dilarutkan dalam pelarut organik. Setiap pemisahan oleh HPLC yang
modern biasanya membutuhkan waktu 10 hingga 30 menit.

Waktu setelah injeksi

 Komponen-Komponen HPLC

1. Pompa
• Peran pompa untuk memaksa cairan (disebut fase gerak) melalui liquid chromatograph pada kecepatan aliran tertentu, dinyatakan dalam mililiter per menit (mL/menit).
- Tingkat aliran normal pada HPLC berada di kisaran 1-2 mL/menit.
- Tipikal pompa dapat mencapai tekanan dalam kisaran 6000-9000 psi (400 hingga 600bar).
• Selama percobaan kromatografi, pompa dapat memberikan komposisi konstan fase gerak (isokratik) atau meningkat komposisi fase gerak (gradien).
2. Injektor:
• Injektor digunakan untuk memperkenalkan sampel cairan ke dalam aliran fase gerak.
- Volume sampel yang tipikal adalah 5-20 mikroliter (µL).
- Injektor juga harus mampu menahan tekanan tinggi dari sistem cair.
• Sebuah autosample merupakan versi otomatis ketika pengguna memiliki banyak sampel untuk dianalisis atau ketika injeksi manual tidak praktis.
3. Kolom:
• Dianggap sebagai "jantung kromatografi" fase stasioner kolom ini memisahkan komponen sampel dari kepentingan menggunakan berbagai parameter fisik dan kimia.
- Partikel-partikel kecil di dalam kolom merupakan penyebab tekanan balik yang tinggi pada tingkat aliran normal
- Pompa harus mendorong dengan keras untuk memindahkan fase gerak melalui kolom dan perlawanan ini menyebabkan tekanan tinggi dalam kromatografi tersebut.
4. Detector:
• Detektor dapat melihat (mendeteksi) masing-masing molekul yang keluar (elute) dari kolom.
- Sebuah detektor berfungsi untuk mengukur jumlah molekul-molekul sehingga chemist secara kuantitatif dapat menganalisis komponen sampel.
- Detektor memberikan output untuk perekam atau komputer yang menghasilkan kromatogram cair (misalnya grafik respon detektor).
5. Komputer:
• Sering disebut sistem data, komputer tidak hanya mengendalikan semua modul dari instrumen HPLC namun butuh sinyal dari detektor dan menggunakannya untuk
menentukan waktu elusi (waktu retensi) dari komponen sampel (analisis kualitatif) dan jumlah sampel (analisis kuantitatif).
Komponen-Komponen HPLC
 Prinsip Kerja LCMS
• Liquid Chromatography adalah teknik dasar yang digunakan untuk memisahkan sampel ke dalam masing-masing komponen.
Pemisahan terjadi berdasarkan pada interaksi sampel dengan fase gerak dan fase diam. Kromatografi cair memisahkan komponen-
komponen sampel berdasarkan perbedaan afinitas mereka untuk fase diam atau fase gerak. LC dapat memisahkan dari berbagai
senyawa organik dari molekul kecil metabolit untuk peptida dan protein.
• Detektor tradisional untuk LC meliputi: indeks bias, elektrokimia, fluoresensi, dan ultraviolet-tampak (UV-Vis). Detektor mengukur
zat berdasarkan waktu retensi dan quantitate zat berdasarkan puncak intensitas dan daerah puncak. Kromatografi menawarkan resolusi
yang bagus, tetapi mengukur dan mengkuantitas zat dengan akurat bias jadi sulit, terutama ketika komponen terelusi pada waktu
yang sama.
• Mass Spectrometry (MS) menawarkan teknik deteksi yang sangat sensitif yang mengionisasi komponen sampel dengan menggunakan
berbagai metode. Ion yang dihasilkan dipisahkan dalam ruang hampa berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan dan
intensitas masing-masing ion yang diukur. Detektor MS menghasilkan informasi berharga tentang berat molekul, struktur, identitas,
kuantitas, dan kemurnian dari sampel. Detektor MS meningkatkan kepercayaan analisis kualitatif dan kuantitatif.
• MS merupakan detektor yang lebih sensitif dan lebih spesifik dari semua detektor LC lain. MS dapat menganalisis senyawa tanpa
kromofor yang cocok. MS dapat mengidentifikasi senyawa di puncak kromatografi yang belum terselesaikan, mengurangi kebutuhan
untuk kromatografi sempurna.
• Unit LCMS terdiri dari unit untuk memisahkan komponen (HPLC), sumber ion yang mengionisasi sampel, lensa elektrostatik yang
memperkenalkan ion yang dihasilkan, analisa massa yang memisahkan ion berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan
mereka, dan unit detektor yang mendeteksi ion dipisahkan.
Komponen-Komponen LCMS

dimana:

1. Sumber ion : efluen HPLC disemprotkan ke wilayah tekanan atmosfer.

2. Skimmer Cone : sebuah kerucut dengan lubang sampling dari pengurangan diameter untuk fase ion sampel gas
istimewa dan mengurangi masukan beban gas ke sistem hampa udara dari alat analisa massa.
3. Quadrupole : alat yang menggunakan bahan elektrik untuk memisahkan ion tergantung dari total massa untuk
mengisi perbandingan (m/z) seperti seperti yang disampaikan di pusat axis dari empat parallel batang yang sama
jauh.
4. Collision Cell : ion muncul dari analisis massa pertama yang diakselerasi menggunakan sebuah perbedaan potensi
dan bertabrakan dengan molekul gas netral seperti H2, N2, atau Ar, menyebabkan fregmentasi analit.
5. Detector : sejak memproduksi dan memisahkan, ion butuhkan dideteksi dan ditransformasikan ke sinyal yang siap
digunakan. Electron multiplier, Dynode, Photodiode, dan Multi Channel Plate (MCP) sistem pendeteksi ion yang secara
luas digunakan pada system spectrometer massa paling modern.
6. Vacuum system : penganalisa massa memerlukan hampa udara level tinggi dalam mengoperasikan cara yang dapat
diprediksi dan efisien. System hampa udara dari sistem LC-MS yang paling modern terdiri dari 2 atau lebih ruang
pompa hampa udara yang berbeda, diseparasi oleh baffles atau pelat orifice dari desain yang bervariasi tergantung
instrumen manufaktur.