Prinsip Dasar,

Instrumentasi, Analisis
Kualitatif dan
Kuantitatif dengan
HPLC dan LC-MS
beserta Aplikasinya
A Hafizh Arif Arafi (M0318001)
Annisa Rochmah Watika (M0318019)
Hudzaifah Anafifi (M0318031)
Millenia Anggie Wangsa Putri (M0318041)
Priscilla Inez Gerard (M0318051)
Tara Amelia Pratiwi (M0318063)
 PENDAHULUAN (Mangunara dkk., 2019)
( Ardianingsih, 2009) Selain menggunakan metode HPLC,
pemisahan komponen senyawa juga dapat
Prinsip pemisahan kromatografi yaitu menggunakan LC-MS. Liquid
adanya distribusi komponen-komponen Chromatography Mass Spectrometry
dalam fase diam dan fase gerak (LC/MS-MS) adalah teknik analisis yang
berdasarkan perbedaan sifat fisik menggabungkan kemampuan pemisahan
komponen yang akan dipisahkan. fisik dari kromatografi cair dengan
Kromatografi dapat digunakan untuk spesifisitas deteksi spektrometri massa.
01 analisa kualitatif dan kuantitatif. 03

(Rizalina dkk., 2018) (Annisa dkk., 2019)

02 Salah satu metode kromatografi yaitu High 04
Kromatografi merupakan metode atau
teknik pemisahan campuran yang Performance Liquid Chromatography
didasarkan pada perbedaan distribusi dari (HPLC) merupakan teknik kromatografi cair
komponen–komponen dalam fasa gerak (LC) yang digunakan untuk pemisahan
yang dapat berupa gas atau cairan dan berbagai komponen dalam campuran. HPLC
fasa gerak yang dapat berupa cairan atau juga digunakan untuk identifikasi dan
padatan kuantifikasi suatu senyawa.
02

01
HPLC
(High Perfomance Liquid Chromatograhy)
 Prinsip
● Berdasarkan pemisahan dengan menggunakan teknik kromatografi.
● Kromatografi berasal dari kata Yunani yaitu, chromos (warna) dan
graphein (menulis).
● Kromatografi merupakan cara pemisahan yang mendasarkan partisi
cuplikan (sampel) antara fase bergerak dan fasa diam.
● Pada HPLC sistem kromatografi yang digunakan adalah cair-padat,
fasa bergerak (mobile phase) berupa cairan yaitu pelarut dan fasa
diam (stationary phase) berupa padatan yaitu adsorben yang
terdapat dalam kolom analitik.
● Dengan demikian, kromatografi dapat didefinisikan sebagai suatu
proses migrasi diferensial di mana komponen-komponen cuplikan
(sampel) ditahan secara selektif oleh fase diam (adsorben).
Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
HPLC
Analisis Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif

didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.
Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi
sampel dibandingkan dengan larutan standar. Waktu
retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa
untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak
maksimum pada grafik dari senyawa itu.
Analisis Kuantitatif

Analisis kuantitatif menggunakan luas puncak.

Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk
signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat
puncak-puncak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sampel. Beberapa hal yang harus
diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
a. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
b. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan
standar yang sama
c. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan
(korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri
pada waktu retensi tertentu.
d. Berdasarkan area kromatogram
e. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Instrumen
Fungsi masing-masing bagian HPLC adalah sebagai berikut :

1) Microprocessor control

Bagian ini merupakan mikro komputer, suatu bagian yang sangat penting untuk
mengontrol atau membuat program mengatur kecepatan aliran pelarut (flow rate)
sebagaimana yang diinginkan, mengatur tekanan (pressure), mengatur komposisi
(perbandingan) pelarut, mengatur suhu injektor dan jumlah sampel yang akan
diinjeksikan bila menggunakan "automatic injection", mengatur suhu oven
termasuk suhu kolom, mengatur panjang gelombang pada detektor dan
memprogram waktu analisa yang diperlukan apabila menggunakan HPLC sistem
gradien.
2) Pompa

Alat ini dibutuhkan untuk memompakan pelarut dari reservoir ke kolom dengan
tekanan paling sedikit 100 arm (1500 psi, pound per square inch) dan paling
tinggi 400 arm (6000 psi) sesuai dengan besar aliran ("flow rate" berkisar antara
0,5-2 ml/min), tipe dari kolom, ukuran partikel adsorben dalam kolom (mesh) dan
panjang kolom yang digunakan. Pompa akan bekerja memompakan pelarut
secara terus menerus dengan kecepatan aliran yang tetap, sambil membawa
sampel dari injektor melewati kolom analitik terus ke detektor dan akhirnya ke
pembuangan.
3) Injektor

Injektor adalah alat untuk memasukkan sampel ke dalam kolom yang dapat
dilakukan secara otomatis maupun manual. Bila alat HPLC dilengkapi dengan
"automatic sample injector" maka pemasukan sampel dapat dilakukan secara
otomatis yaitu dengan memprogram pada "microprocessor control" jumlah sampel
(uL) dan jumlah macam sampel (misalnya ada 10 macam sampel yang berbeda)
yang akan dianalisa. Bisa juga dilakukan secara manual dengan cara
menggunakan jarum suntik khusus, diukur volume tertentu biasanya antara 10- 20
uL. Injektor harus mampu bekerja pada tekanan 470 arm dengan kesalahan (error)
kurang dari 0,2 % dan dapat ditempatkan dalam suatu oven agar temperatur
injektor dapat terkontrol. Untuk sistem ini biasanya temperatur yang dipergunakan
lebih kurang 150 °C.
4) Kolom

Kolom terbuat dari logam berat, kaca dan logam stainless berbentuk
tabung yang mampu menahan tekanan (setinggi 680 atm) dan tidak
bereaksi dengan pelarut (fase bergerak). Fase diam (adsorben) dalam
kolom harus halus dengan keseragaman diameter yang sama (uniform
bore diameter). Kolom berbentuk tabung harus lurus dan diletakkan
pada posisi vertikal serta diperlengkapi dengan fitting dan konektor
yang didesain sedemikian rupa agar tidak memberikan kehampaan pada
ujung kolom.
5) Detektor

Detektor adalah alat untuk mendeteksi komponen-komponen kimia yang

telah terpisah setelah melewati kolom. Detektor yang sensitif untuk
HPLC tidak bisa ditentukan. Jadi perlu dilakukan pemilihan detektor
yang sesuai dengan persoalan yang dihadapi saat itu. Untuk melakukan
berbagai pemisahan atau analisis mungkin diperlukan lebih dari satu
detektor yang dipergunakan secara berhubungan (seri).
6) Recorder dan Data Processing

Recorder adalah alat yang paling sederhana untuk mencatat setiap sinyal yang
muncul pada detektor untuk diubah dalam bentuk kurva atau lebih dikenal
dengan kromatogram. Tinggi rendahnya kurva didasarkan pada pulsa listrik yang
diterima rekorder dari detektor dan tergantung pada sensitivitas detektor yang
digunakan. Terkadang recorder digabungkan dengan suatu sistem komputer
untuk analisa data atau data prosesor dalam bentuk yang kompak dan dikenal
sebagai "data processor". Ini memudahkan bagi sipemakai untuk menganalisa
data hasil pekerjaannya. Informasi yang disajikan dari hasil proses data antara
lain, waktu retensi, peak area, persentase (%) dan jumlah total dari setiap kurva
yang dihasilkan.
Tahapan Analisis Dengan HPLC

Preparasi Alat Preparasi Fase Gerak

Penginjeksian Penyalaan Alat HPLC

Hasil Analisis HPLC

 Preparasi Fase Gerak :
- Fase gerak (eluen) yang digunakan harus
Preparasi Alat : dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC.
- Sampel harus dalam Untuk air, digunakan aquabidest.
bentuk larutan. - Sebelum digunakan, eluen harus disaring
- Untuk skala analisis dengan millipore kemudian diawagaskan
sampel dalam μL, (di-digest) dengan sonikator sekitar 30 menit
konsentrasi sampel yang untuk menghilangkan udara terlarut.
diinjeksikan tidak boleh - Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung
terlalu pekat karena eluen sebelum alat dinyalakan, untuk
dapat menyumbat menghindari adanya gelembung pada selang
kolom. Konsentrasi penghubung.
maksimal adalah sekitar - Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi
40 ppm. label sesuai dengan eluen yang digunakan.
Penyalaan Alat Penginjeksian :
HPLC:
Sampel diinjeksikan
Sebelum alat menggunakan syringe. Hasil Analisis HPLC :
dinyalakan, pastikan syringe dibilas dengan zat
dalam selang yang sama dengan fase Didapatkan hasil
penghubung antara gerak utama. Kemudian
berupa kromatogram
syringe dibilas dengan
tabung eluen dengan dan waktu retensi dari
sampel. Selanjutnya
pompa tidak terdapat setiap puncak pada
sampel diisikan ke dalam
gelembung udara. jarum syringe dan kromatogram.
dimasukkan ke dalam
injektor.
Sistem Elusi HPLC
Sistem elusi isokratik (isocratic
elution)
Sampel diinjeksikan ke dalam
kolom yang komposisi fase
geraknya tidak berubah selama
analisis dilakukan sampai
sampel terelusi dari kolom,
sistem isokratik yang memiliki
nilai k’ (rasio atau koefisien
partisi yang bervariasi) akan
menghasilkan resolusi yang
buruk dan sukar mendeteksi
pita elusinya.
Sistem elusi gradien (gradient elution)
Ada perubahan fase gerak baik secara
bertahap atau berkesinambungan selama
proses berlangsung. Pada mula-mula
elusi, seluruh komponen sampel ditahan
di bagian atas kolom, setelah gradien
mulai, kekuatan elusi fase gerak akan
meningkat. Pada akhirnya harga k’ akan
menjadi cukup kecil sehingga komponen
zat tersebut akan bermigrasi sepanjang
kolom secara cepat sampai keluar dari
kolom.
 Sistem elusi bertahap

Baik digunakan untuk sampel yang mengandung

komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti
senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak
mengandung senyawa dengan nilai k’ setelah sampai
diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara bertahap
diganti. Hasil sistem HPLC dan optimasinya sangat
tergantung pada beberapa hal, antara lain temperatur,
tekanan, diameter partikel fase diam, viskositas, dan
panjang kolom
Macam-macam HPLC

01 Kromatografi 02 Kromatografi
Partisi pertukaran ion

03 Kromatografi 04 Kromatografi
adsorbsi ekslusi
Kromatografi Partisi
Kromatografi partisi dapat dibedakan ke dalam dua
kategori yaitu kromatografi partisi cair-cair dan
kromatografi fase terikat. Perbedaan kedua teknik ini
terletak pada metode pengikatan fase diam pada
partikel penyangga kemasan kolom. Kromatografi
partisi cair-cair, fase diam diikatkan pada permukaan
kemasan secara fisika, sedangkan pada kromatografi
partisi fase terikat (bonded phase) fase diam terikat
secara kimia. Berdasarkan kepolaran relatif fase diam
dan fase geraknya, kromatografi partisi dibagi menjadi
2 yaitu fase normal dan fase terbalik.
 a. Fase Normal

Pada masa awal, penggunaan kromatografi cair menggunakan fase diam yang sangat polar seperti air
atau trietilen glikol yang terikat pada partikel silika atau alumina; fase gerak adalah pelarut yang
relatif kurang polar seperti heksan atau isopropil eter. Tipe kromatografi ini dikenal sebagai
kromatografi fase normal. Pada kromatografi fase normal, senyawa yang kurang polar dielusi lebih
awal karena senyawa non polar paling baik kelarutannya dalam fase gerak. Peningkatan kepolaran
fase gerak dapat memperpendek waktu elusi.

b. Fase terbalik

Pada kromatografi fase terbalik, fase diam adalah senyawa non polar (biasanya suatu hidrokarbon)
dan fase gerak pelarut yang relatif lebih polar seperti air, metanol atau asetonitril. Pada kromatografi
fase terbalik senyawa-senyawa polar akan terelusi lebih awal, dan peningkatan kepolaran fase gerak
akan memperbesar waktu elusi. Sebagian besar penggunaan kromatografi fase terbalik menggunakan
fase gerak sangat polar seperti larutan air yang mengandung beberapa pelarut organic dengan
konsentrasi tertentu seperti metanol, asetonitril, atau tetrahydrofuran.
 Kromatografi Adsorpsi
Kromatografi adsorpsi telah diadaptasi dan menjadi bagian yang
penting dari metode HPLC. Fase diam yang digunakan pada HPLC cair-
padat adalah silika dan alumina. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksil yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mempunyai reaktivitas yang berbeda, karenanya solute dapat terikat
secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. Fase
gerak yang digunakan untuk fase diam silika atau alumina berupa pelarut
non polar yang ditambah dengan pelarut polar seperti air atau alkohol
rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak
timbul pengekoran puncak. Secara umum, kromatografi adsorpsi sangat
cocok digunakan untuk pemisahan sampel yang larut dalam pelarut non
polar dan sukar larut dalam pelarut air. Suatu kelebihan utama dari
kromatografi adsorpsi yang tidak diberikan oleh metoda lainnya adalah
kemampuannya membedakan antara campuran isomer struktur dan analit
dengan gugus fungsi berbeda.
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi Pertukaran ion adalah suatu metode
pemurnian menggunakan fase diam yang dapat menukar
kation atau anion dengan suatu fase gerak. Fase diam
tersebut merupakan suatu matriks yang kuat (rigid), yang
permukaannya mempunyai muatan, dapat berupa muatan
positif maupun negatif.
Pemisahan ion sederhana berdasarkan pada perbedaan
kekuatan interaksi ion terlarut dengan resin. Jika senyawa
terlarut berinteraksi lemah dengan adanya ion fasa gerak,
ion terlarut keluar lebih awal pada kromatogram, sedangkan
senyawa terlarut yang berinteraksi kuat dengan resin, akan
keluar berikutnya pada kromatogram.
 Kromatografi Eksklusi
Kromatografi eksklusi adalah suatu kromatografi kolom yang proses
pemisahannya didasarkan atas ukuran partikel solute. Kromatografi
eksklusi dapat digunakan untuk memisahkan suatu senyawa dari
senyawa lain yang mempunyai berat molekul lebih rendah atau tinggi,
atau untuk memisahkan molekul-molekul yang mempunyai berat
molekul sama tetapi diameter berbeda. Kromatografi eksklusi dapat
dibedakan menjadi dua berdasarkan pada fase geraknya yaitu
kromatografi gel filtrasi (bila fase gerak air) dan kromatografi
permeasi gel (bila fase gerak adalah pelarut organik). Sedangkan fase
diam pada kromatografi eksklusi digunakan partikel-partikel yang
mempunyai pori dengan berbagai macam ukuran. Dua tipe bahan
sebagai fase diam yang digunakan dalam kromatografi ini ialah gel
dari senyawa organik (polimer, dan silika gel yang mudah berinteraksi
dengan polimer). Berikut adalah beberapa fase diam yang dapat
digunakan pada kromatografi eksklusi, antara lain Sephadex, Bio-Gel,
Agarosa, dan Stiragel.
 Kelebihan dan Kekurangan HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan
dari alat HPLC antara lain:

a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.

b. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi kerusakan bahan analisis.

c. Dapat digunakan bermacam-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

d. Kolom dapat digunakan kembali.

e. Waktu analisa cukup singkat.

f. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

g. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

h. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu ruang.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

a. Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

b. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

c. Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor.

d. Hanya bisa digunakan untuk asam organik.

e. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut,

analit dan gradien elusi

F. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam

dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah
tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan
harus dijaga.
 APLIKASI PADA
1. Bidang farmasi digunakan untuk menguji stabilitas obat, uji
disolusi, quality control. HPLC
2. Bidang industri makanan dan minuman digunakan untuk
analisis keberadaan senyawa polisiklik, analisis kadar gula dan pengawet,
dan pengukuran kualitas minuman ringan dan air.
3. Bidang kedokteran digunakan untuk analisis antibiotik dalam
darah, analisis kokain pada urin.
4. HPLC digunakan untuk memisahkan minyak atsiri
5. HPLC digunakan untuk analisis anion nitrat (NO 3-)

6. HPLC digunakan untuk menentukan berat molekul polimer

dan masalah-masalah biokimia.
7. HPLC digunakan untuk memisahkan dan menganalisis
vitamin yang larut dalam air
02
LC-MS
Pengertian LC-MS
Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) secara umum juga
disebut sebagai kromatografi cair-spektroskopi massa. LC-MS merupakan suatu
teknik analitik yang mengombinasikan kemampuan pemisahan fisik dari
kromatografi cair (HPLC) dengan kemampuan analisis massa dari spektroskopi
massa. Kombinasi ini dilakukan dengan menggunakan instrumen HPLC pada
umumnya, namun ditambahkan dengan keberadaan MS. Hibrida atau
penggabungan metode ini memungkinkan pemisahan senyawa dan penentuan
massa molekul atau molekul relatif dilakukan secara simultan.

Analisis identifikasi senyawa yang dilakukan dengan instrumen LC-MS

cenderung lebih baik dibanding dengan instrumen HPLC biasa. Hal ini
dikarenakan adanya tambahan informasi mengenai fragmentasi ion yang berasal
dari MS, yang selain digunakan untuk menentukan massa senyawa, juga dapat
digunakan untuk memperkirakan struktur dari senyawa yang dianalisis. Instrumen
ini memiliki tingkat kepekaan dan spesifisitas yang tinggi. Oleh karena itu,
terdapat banyak aplikasi dari instrumen ini.
Prinsip LC-MS
Prinsip: penggabungan teknik LC dan MS. HPLC (LC) digunakan
untuk memisahkan komponen campuran dengan melewatkan kolom
kromatografi. Spektrometri Massa juga digunakan untuk identifikasi senyawa
yang tidak diketahui, senyawa yang diketahui dan untuk menjelaskan
strukturnya. Antarmuka digunakan untuk mentransfer eluen cair dari LC ke
MS.
Prinsip kerja: sampel yang dipisahkan oleh LC, dan spesies sampel
yang dipisahkan disemprotkan ke sumber ion tekanan atmosfer, di mana
mereka diubah menjadi ion dalam fasa gas. Mass analyzer kemudian
digunakan untuk mengurutkan ion menurut rasio massa terhadap muatannya
dan detektor digunakan untuk menghitung ion yang muncul dari penganalisis
massa dan juga dapat memperkuat sinyal yang dihasilkan dari setiap ion.
Instrumentasi LC-MS

Gambar Bagian-bagian LC-MS

 Instrumentasi LC-MS
Instrumentasi Kromatografi Cair
01. Pompa
Pompa terdiri dari bahan yang inert terhadap pelarut atau komposisi campuran
penyangga berair dan pelarut organik. Terdapat tiga jenis pompa utama yang
digunakan, yaitu pompa reciprocating, pompa syringe dan pompa tekanan konstan.

02. Injektor Sampel

Injektor digunakan untuk memasukkan larutan sampel ke dalam sistem
kromatografi. Terdapat dua jenis utama injektor yang digunakan, yaitu injektor
otomatis dan injektor manual. Injektor otomatis lebih nyaman dan ramah
pengguna serta lebih akurat dan presisi dibandingkan dengan injektor manual
 Instrumentasi LC-MS
Instrumentasi Kromatografi Cair
03. Kolom
Kolom merupakan fase diam dari LC yang terdiri dari bahan silika yang
dikombinasikan dengan rantai karbon. Kolom yang digunakan dalam HPLC terdiri
dari oktadesil (C18), oktil (C8), siano, amino, pengemasan fenil. Kolom digunakan
berdasarkan dari sifat senyawa yang akan dipisahkan.

04. Detektor
Detektor merupakan bagian terpenting dari LC. Terdapat berbagai jenis
detektor yang digunakan yaitu detektor UV-Visible, Detektor PDA, Detektor
Indeks Refraktif (RI), Detektor Elektrokimia, Detektor Fluoresensi dan
Detektor Konduktivitas. Sinyal yang diterima oleh detektor direkam sebagai
puncak dan data masing-masing dapat disimpan dalam perangkat lunak.
 Instrumentasi LC-MS
Instrumentasi Spektrometri Massa
Sumber dan Antarmuka Ionisasi
01.
Campuran komponen yang mengandung cairan ini dipindahkan ke sumber ion
spektrometer massa. Karena sumber ion berada di bawah vakum tinggi,
perbedaan tekanan massa sulit untuk menguapkan tetesan cairan tanpa
kehilangan campuran komponen. Oleh karena itu, antarmuka digunakan untuk
menyelesaikan masalah ini.

Jenis sumber dan antarmuka ionisasi pada Spektrometri Massa:

1. Direct liquid Introduction
2. Atmospheric-Pressure Ionization
3. Particle Beam Ionization
4. Thermo Spray and Plasma Spray
Ionization
5. Electrospray Ionization
6. Atmospheric Pressure Photoionization
7. Atmospheric Pressure Ionization
8. Continuous Flow Fast Atom
Bombardment
 Instrumentasi LC-MS
Instrumentasi Spektrometri Massa
Mass Analyzer
02.
Setelah dilakukan ionisasi, ion dipindahkan ke mass analyzer atau penganalisis massa
dimana pemisahan ion dilakukan sesuai dengan rasio massa terhadap muatan (m/z).
Umumnya penganalisis massa yang digunakan adalah pada kecepatan, waktu, kecepatan
dan reaksinya.

Jenis mass analyzer pada Spektrometri Massa:

1. Quadrupole Mass Analyzer
2. Time of Flight Analyzer
3. Ion Trap Mass Analyzer
4. Fourier Transfer Ion Cyclotron Resonance
 Instrumentasi LC-MS
Instrumentasi Spektrometri Massa
Detektor
03.
Detektor merupakan alat penting pada spektrometer massa (MS) yang menghasilkan
arus sebanding dengan jumlah ion yang menerjangnya. Setelah ion-ion yang terbentuk
melewati penganalisis, harus dilakukan deteksi dan diubah menjadi sinyal.

Jenis detektor pada Spektrometri Massa:

1. Point Ion Collectors Detector
2. Array Detector
 Analisi
s
Kualitatif & Kuantitatif
LC-MS
 Analisis Kualitatif
Analisis Kualitatif LC-MS didasarkan pada parameter waktu
retensi (tR). Pada analisis kualitatif, waktu retensi merupakan
identitas yang menunjukkan adanya komponen dalam campuran.

Waktu Retensi (tR) merupakan selang waktu yang

diperlukan oleh analit mulai saat injeksi hingga
keluar dari kolom dan secara maksimal sinyalnya
ditangkap oleh detektor.

★ Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi komponen

sampel yang dipisahkan dengan waktu retensi senyawa standar.
★ Apabila dua senyawa yang memiliki tR yang sama atau mirip maka dapat
dikatakan kedua senyawa tersebut adalah sama.
 Analisis Kualitatif
Uji konfirmasi merupakan uji kualitatif pada LC-MS dengan mengetahui
fragmentasi ion dari senyawa, dilakukan sebelum uji kesesuaian sistem
untuk memperkuat identifikasi kualitatif dari sampel dengan melihat
perbandingan massa terhadap muatan, sampel pada kromatogram dapat
diketahui dari terbentuknya fragmen-fragmen ion pada perbandingan massa
terhadap muatan (m/z)
 Analisis Kuantitatif
Analisis Kuantitatif LC-MS dilakukan dengan cara membandingkan
luas puncak standar senyawa murni dengan sampel, yang didasarkan
pada pengukuran luas puncak analit dalam kromatogram yang
dibandingkan dengan luas area senyawa standar

Uji linieritas, untuk mengetahui kemampuan metode analisis memberikan

respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel.
Linearitas biasanya dinyatakan sebagai variasi sekitar kemiringan (slope)
dari garis regresi yang diperhitungkan sesuai dengan rumus matematika,
yang didapat dari hasil pengujian sampel dengan berbagai konsentrasi.
Kelinieran suatu metode perlu diuji untuk membuktikan adanya hubungan
linierr antara konsentrasi analit dengan respon instrumen.
 Analisis Kuantitatif

Linieritas konsentrasi melamin versus luas area kromatogram

 Analisis Massa LC-MS
Quadrupole

Analisis massa quadrupole terdiri dari empat batang paralel diatur dalam persegi. Ion
analit diarahkan ke bagian tengah persegi. Tegangan yang dialirkan pada batang
menghasilkan bidang elektromagnetik. Bidang ini menentukan rasio massa yang dapat
melewati filter pada waktu tertentu. Quadrupoles cenderung merupakan analisis massa
yang paling sederhana dan paling murah.

Analisis massa quadrupole dapat beroperasi dengan dua mode:

• Memindai (scan) modus
• Pemantauan ion terpilih (selected ion monitoring / SIM) modus
 Analisis Massa LC-MS
Time-of-flight (TOF)
Analisis massa time-of-flight (TOF), memiliki sebuah gaya elektromagnetik yang seragam
diterapkan untuk semua ion pada waktu yang sama. Hal ini menyebabkan ion akan dipercepat
menyusuri tabung penerbangan. Ion yang lebih ringan berjalan lebih cepat dan tiba pada detektor
paling awal, sehingga rasio fragmentasi ion ditentukan oleh waktu kedatangan mereka. Analisis
massa (TOF) memiliki kisaran massa yang luas dan sangat akurat pada pengukuran massa suatu
senyawa
Perangkap Ion
Analisis massa perangkap ion terdiri dari elektrode melingkar cincin dua penutup di kedua
ujungnya yang bersama-sama membentuk sebuah ruang. Ion memasuki ruang dan terjebak oleh
medan elektromagnetik. Bidang lain digunakan untuk mengeluarkan dengan selektif dari dalam
perangkap. Perangkap ion memiliki kelebihan dapat melakukan beberapa tahapan pengukuran
spektrometer massa tanpa analisis massa tambahan
 Analisis Massa LC-MS
Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR)

Analisis massa FT-ICR merupakan jenis lain dari analisis massa perangkap ion. Ion
memasuki ruangan dan terjebak dalam lingkaran orbit oleh medan listrik dan medan
magnet yang kuat. Ketika terjadi eksitasi oleh frekuensi radio (RF) pada medan listrik, ion
menghasilkan arus yang bergantung pada waktu. Arus ini dikonversi oleh fourier menjadi
frekuensi orbital dari ion yang sesuai dengan rasio muatan massa senyawa.

Analisis massa FT-ICR memiliki ciri:

• Analisis massa FT-ICR dapat melakukan beberapa tahapan spektrometri massa tanpa
analisis massa tambahan
• Memiliki rentang massa yang lebar dan resolusi massa yang sangat baik
• Merupakan analisis massa termahal diantara yang lain
 Aplikasi LC-MS

Terdapat berbagai jenis aplikasi dari LC-MS dalam berbagai

bidang, antara lain bidang forensik, uji doping, farmakokinetik,
penelitian bioavailabilitas dan bioekivalensi, penentuan obat,
narkoba, dan intermedietnya, industri pestisida dan agrokimia, serta
bidang lingkungan. Selain itu, terdapat juga aplikasi pada bidang
toksikologi, kimia klinis, dan farmakognosi molekuler, dan lain
sebagainya.
 Aplikasi LC-MS
a. Analisis sidik jari dari Psoralea corylifolia L. untuk
penentuan komponen-komponennya (Zhao dkk., 2005).
b. Penentuan keberadaan primaquine, yang merupakan obat
antimalaria, dalam sampel darah segar dan darah kering
manusia (Na-Bangchang dkk., 2014).
c. Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa-senyawa flavonoid
dalam Sophora tonkinensis (He dkk., 2013).
d. Pengembangan sidik jari kromatografis untuk ekstrak
kloroform dari Ganoderma lucidum (Chen dkk., 2008).
e. Analisis campuran rasemat dalam farmasi dengan
menggunakan turunan tris(klorometilfenilkarbamat) dari
selulosa dan amilosa sebagai fase diam kiral (Peng dkk.,
2010).
KESIMPULAN
HPLC
Prinsip kerja HPLC yaitu pemisahan dengan menggunakan teknik
kromatografi. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan
pada waktu retensi untuk identifikasi. Sedangkan analisis kuantitatif
menggunakan luas puncak. Instrumen HPLC meliputi
microprocessor control, pompa, injektor, kolom, detektor, recorder
dan data processing. Aplikasi pada HPLC meliputi bidang farmasi
digunakan untuk menguji stabilitas obat, uji disolusi, quality control.
Bidang industri makanan dan minuman digunakan untuk analisis
keberadaan senyawa polisiklik, analisis kadar gula dan pengawet, dan
pengukuran kualitas minuman ringan dan air. Bidang kedokteran
digunakan untuk analisis antibiotik dalam darah, analisis kokain pada
urin. HPLC juga digunakan untuk memisahkan minyak atsiri, analisis
anion nitrat (NO3-), menentukan berat molekul polimer dan masalah-
masalah biokimia, memisahkan dan menganalisis vitamin yang larut
dalam air
KESIMPULAN
LC-MS
LC-MS berprinsip pada penggabungan teknik LC dan MS. HPLC (LC)
digunakan untuk memisahkan komponen campuran dengan
melewatkan kolom kromatografi. Spektrometri Massa juga digunakan
untuk identifikasi senyawa yang tidak diketahui, senyawa yang
diketahui dan untuk menjelaskan strukturnya. Antarmuka digunakan
untuk mentransfer eluen cair dari LC ke MS. Instrumentasi pada LC
meliputi pompa, injektor sampel, kolom, detektor dan perekam dan
pada MS meliputi sumber dan antarmuka ionisasi, penganalisis massa,
dan detektor. Aplikasi pada LC-MS meliputi berbagai bidang, antara
lain bidang forensik, uji doping, farmakokinetik, penelitian
bioavailabilitas dan bioekivalensi, penentuan obat, narkoba, dan
intermedietnya, industri pestisida dan agrokimia, bidang lingkungan,
bidang toksikologi, kimia klinis, dan farmakognosi molekuler, dan lain
sebagainya.
 SARAN
Karena aplikasi dari HPLC dan LC-MS sangat
luas untuk kemajuan ilmu teknologi,
pengetahuan, dan kehidupan, sangat
diperlukan pendalaman dan pengembangan
lebih jauh mengenai metode dan instrumen ini.
Disarankan untuk mengetahui prinsip dasar,
instrumentasi, analisis data kualitatif dan
kuantitatif HPLC dan LC-MS beserta contoh
aplikasinya dan mempertimbangkan
instrumentasi apa yang lebih efisien untuk
mengidentifikasi suatu senyawa menggunakan
HPLC atau LC-MS.
 Daftar Pustaka
Annissa, S., Musfiroh, I., dan Indriati, L. 2019. Perbandingan Metode Analisis Instrumen HPLC Dan UHPLC: Article Review.
Farmaka, 17(3): 189-197.

Ardianingsih, R. 2010. Penggunaan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dalam Proses Analisa Deteksi Ion. Berita
Dirgantara, 10(4): 101-104.

Babu, A. V. S. 2017. HPLC and LCMS - A Review and A Recent Update. International Journal of Pharmacy and Analytical
Research, 6(3): 555-567.
Chen, Y., Yan, Y., Xie, M. Y., Nie, S. P., Liu, W., Gong, X. F., Wang., Y. X. 2008. Development of A Chromatographic Fingerprint
for the Chloroform Extracts of Ganoderma lucidum by HPLC and LC–MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 47: 469-447.
He, C. M., Cheng, Z. H., dan Chen, D. F.. 2013. Qualitative and Quantitative Analysis of Flavonoids in Sophora tonkinensis by
LC/MS and HPLC. Chinese Journal of Natural Medicines, 11(6): 690-698.
Hendayana, S. 2006. KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya.
Ho, C.S., Lam, C.W.K., Chan, M.H.M., Cheung, R.C.K., Law, L.K., Lit, L.C.W., Ng, K.F., Suen, M.W.M. dan Tai, H.L., 2003.
Electrospray ionisation mass spectrometry: principles and clinical applications. The Clinical Biochemist Reviews, 24(1): 3-
12.
 Daftar Pustaka
Lestari, W. S. 2014. Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam Plasma darah secara In Vitro Menggunakan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah.
Mangurana, W.O.I., Yusnaini, Y. dan Sahidin, S., 2019. Analisis LC-MS/MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) dan
Metabolit Sekunder serta Potensi Antibakteri Ekstrak n-Heksana Spons Callyspongia aerizusa yang diambil pada kondisi
tutupan Terumbu Karang yang berbeda di Perairan Teluk Staring. Jurnal Biologi Tropis, 19(2): 131-141.
Murningsih, T. dan Chairul, C. 2000. Di Sela-Sela Laboratorium dan Plot Eksperimen Mengenal HPLC: Peranannya dalam
Analisa dan Proses Isolasi Bahan Kimia Alam. Berita Biologi, 5(2): 261-271.
Na-Bangchang, K., Guirou, E. A., Cheomung, A., dan Karbwang, J. 2014. Determination of Primaquine in Whole Blood and
Finger-Pricked Capillary Blood Dried on Filter Paper Using HPLC and LCMS/MS. Chromatographia, 77: 561-569.
Parasuraman, S., Anish, R., Balamurugan, S., Muralidharan, S., Kumar, K. J., dan Vijayan, V. 2014. Overview of Liquid
Chromatography-Mass Spectroscopy Instrumentation. Pharmaceutical Methods, 5(2): 47-55.
Peng, L., Jayapalan, S., Chankvetadze, B., dan Farkas, T. 2010. Reversed-phase Chiral HPLC and LC/MS Analysis with
Tris(chloromethylphenylcarbamate) Derivatives of Cellulose and Amylose as Chiral Stationary Phases. Journal of
Chromatography A, 1217: 6942-6955.
Pratima, N. A. dan Gadikar, R. 2018. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Its Applications: A Brief Review. Archives
of Organic and Inorganic Chemical Sciences, 1(1): 26-34.
 Daftar Pustaka
Rizalina, H., Cahyono, E., Mursiti, S., Nurcahyo, B., dan Supartono. 2018. Optimasi Penentuan Kadar Metanol Dalam Darah
Menggunakan Gas Chromatography. Indonesian Journal of Chemical Science, 7(3): 254-261.
Susanti, M. dan Dachriyanus. 2017. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang: Lembaga Pengembangan Teknologi Informasi dan
Komunikasi (LPTIK) Universitas Andalas.
Syenina, A. 2011. “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik pada Penetapan Kadar Nikotin
dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau”. Skripsi. Fakultas Farmasi. Program Studi Farmasi. Universitas Sanata Dharma.
Yogyakarta.
Veronika, R. M. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography FOURTH EDITION. Switzerland: Swiss Federal
Laboratories for Materials Testing and Research (EMPA).
Wahid, R. A. H. 2020. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Tanin Ekstrak Kulit Buah Delima Putih (Punica Granatum L.)
Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Indonesian Journal of Pharmacy and Natural Product,
3(2): 11-21.
Zhao, L., Huang, C., Shan, Z., Xiang, B., dan Mei, L. Fingerprint Analysis of Psoralea coryfolia L. by HPLC and LC-MS. Journal
of Chromatography B, 821: 67-74.
Terima Kasih
SOAL
1. Berikut ini yang bukan merupakan jenis antarmuka yang biasa digunakan dalam spektrometer
massa adalah…
a. Direct liquid Introduction
b. Atmospheric Pressure Ionization
c. Particle Beam Ionization
d. Fourier Transfer Ion Cyclotron Resonance
e. Thermo Spray and Plasma Spray Ionization
1. Perbedaan HPLC dan LC-MS adalah pada:
a. metode injeksinya
b. wujud fase diamnya
c. detektornya
d. wujud fase geraknya
e. kolomnya
3. Analisis campuran rasemat pada obat merupakan contoh aplikasi LC-MS pada bidang:

a. Pertanian
b. Farmasi
c. Forensik
d. Lingkungan
e. Politik

4. Analisis kualitatif pada LC-MS didasarkan pada parameter...

a. Luas Area Puncak
b. Waktu Retensi (tR)
c. Konsentrasi Sampel
d. Jumlah Peak
e. Semua benar
5. Berikut ini yang bukan merupakan prinsip kerja dari LC-MS adalah…
a. Pemisahan LC
b. Titrasi
c. Sumber ion tekanan atmosfer
d. Injeksi sampel
e. Penganalisis Massa

6. Berikut mode analisis massa pada LC-MS:

1. Memindai (scan) modus
2. Penyeragam semua ion pada waktu yang sama
3. Perbandingan fragmentasi ion sampel dan standar
4. Pemantauan ion terpilih (selected ion monitoring/ SIM) modus
Analisis massa quadrupole dapat beroperasi dengan dua mode, yakni...
a. 1 dan 2
b. 2 dan 3
c. 1 dan 4
d. 1 dan 3
e. 2 dan 4
7. Analisis massa yang terdiri dari elektroda melingkar cincin dua penutup di kedua ujungnya
yang bersama-sama membentuk sebuah ruang, disebut dengan analisis masa...
a. Quadrupole
b. Time-of-flight (TOF)
c. Perangkap ion
d. Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR)
e. Semua salah

8. Kepanjangan dari analisis massa perangkap ion FT-ICR adalah...

a. Fourier transform-ion cyclotron resonance
b. Fourier transform-ion cyclotron resistance
c. First transform-ion cyclotron resonance
d. Fourier transfer-ion cyclotron resonance
e. Fourier transform-atoms cyclotron resonance
9. Berikut merupakan tahapan analisis dengan menggunakan HPLC, yang tidak termasuk dalam
tahapan analisis dengan HPLC adalah .....
a. Preparasi alat
b. Preparasi sampel
c. Penginjeksian
d. Penyalaan alat HPLC
e. Preparasi fase gerak

10. Analisis kualitatif pada HPLC didasarkan pada ....

a. Waktu elusi
b. Luas puncak
c. Kromatogram
d. Waktu retensi
e. Kolom
11. Macam-macam dari HPLC adalah, kecuali…
a. Kromatografi partisi
b. Kromatografi adsorpsi
c. pertukaran ion
d. kromatografi eksklusi
e. kromatografi kolom
12. Berdasarkan kepolaran relatif fase diam dan fase geraknya, kromatografi partisi dibagi
menjadi 2 yaitu fase terbalik dan fase ...
a. fase tidak normal
b. fase normal
c. fase diam
d. fase gerak
e. fase tunggal
13. Berikut adalah beberapa fase diam yang dapat digunakan pada kromatografi eksklusi,
kecuali ...
a. Air
b. Sephadex
c. Bio-Gel
d. Agarosa
e. Stiragel
14. Berikut adalah kelebihan dari HPLC, kecuali ...
a. Kolom dapat digunakan kembali.
b. Waktu analisa cukup singkat.
c. Digunakan untuk asam organik.
d. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
e. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
15. Pada HPLC fase bergerak (mobile phase) berupa cairan yaitu pelarut dan fasa
diam (stationary phase) berupa padatan yaitu adsorben yang terdapat dalam
kolom analitik. Sistem kromatografi yang digunakan adalah…
a. Padat-padat
b. Cair-padat
c. Cair-cair
d. Gas-padat
e. Gas-cair
 Esai

1. Mengapa analisis menggunakan instrumen LC-MS cenderung lebih baik dari

instrumen HPLC biasa?
2. Sebutkan instrumentasi pada LC-MS!
3. Jelaskan prinsip kerja HPLC!
4. Sebutkan minimal 3 hal-hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat digunakan
untuk penentuan secara kuantitatif!
5. Sebutkan aplikasi pada HPLC!