BAB I

DEFINISI DAN PENJELASAN PRINSIP METODE ANALISIS

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau yang biasa disebut High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) adalah teknik yang paling umum yang digunakan untuk
kuantisasi obat dalam formulasi. Uji farmakope masih sangat bergantung pada spektroskopi
UV langsung, akan tetapi dalam industri deteksi oleh spektroskopi UV biasanya dikombinasi
dengan pemisahan awal oleh HPLC (Watson, 2012). HPLC merupakan salah satu teknik
kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan
untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu
(Christian et al, 2014).

Dalam HPLC, analit dipisahkan berdasarkan afinitas diferensial antara fase diam
padat dan fase gerak cair. Kinetika distribusi zat terlarut antara fase diam dan fase gerak
sebagian besar dikendalikan oleh difusi. Beragam komponen dalam sampel akan terpisah
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap fase diam. Komponen yang dapat berinteraksi
secara kuat dengan fase diam akan bergerak lebih lambat sehingga dapat terpisah dari
komponen lain dengan interaksi yang lemah (Christian et al, 2014).

Sesuai namanya, prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur

sampel. Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat
sampel bergerak melewati fase diam (dapat berupa zat padat atau cair) karena terbawa
oleh fase gerak (dapat berupa zat cair atau gas).  Dalam HPLC, pelarutnya menetes melalui
kolom menuju detektor dibawa pengaruh gravitasi yang mana terdapat pompa yang dapat
memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran
fase gerak dengan cara penyuntikkan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara  solut-solut terhadap
fase diam. Solut-solut yang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom
terlebih dahulu. Sebalikya, solute-solut yang kuat berinteraksinya dengan fase diam maka
solute tersebut akan keluar kolom, dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol
kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah hasil data pengukuran HPLC
(Mardiana et al, 2014).
 BAB II

KOMPONEN INSTRUMEN

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: Wadah fase gerak (Reservoir),

Pompa, Injector loop (tempat injeksi), Kolom, Detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem
kromatografi cair seperti dibawah ini:

(Watson, 2012)
Gambar 1. Skema Instrumen HPLC

a. Wadah fase gerak (Reservoir)

Keadaan wadah fasa gerak harus bersih dan lembam ( inert ). Wadah fasa gerak ini
biasanya dapat menampung 1 hingga 2 liter pelarut. Fasa gerak yang akan digunakan harus
dideggasing ( penghilangan gas ) yang ada pada fasa gerak. Karena dengan adanya gas pada
fasa gerak akan menyebabkan detektor terganggu maka akkan mengacaukan hasil analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fasa gerak berubah ubah selama elusi) (Corradini, 2011).

b. Pompa
Pompa yang digunakan sama halnya seperti wadah fasa gerak yaitu harus inert
terhadap fasa gerak. Biasanya bahan yang digunakan untuk pompa adalah gelas, baja tahan
karat, teflon, dan batu nilam. Tekanan dari pompa sebaiknya bertekanan  5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan dari pompa ini agar
fasa gerak dapat berlangsung secara tepat, konstan, dan bebas dari gangguan.  Ada dua
jenis pompa dalam HPLC : 1.      Pompa dengan tekanan konstan
2.      Pompa dengan aliran fasa gerak yang konstan (Corradini, 2011).

c. Injector loop (tempat injeksi)

 Sampel yang akan dimasukan dalam kolom akan disuntikan melalui injektor. Volume
sampel yang diinjeksi 20-500 µL. Ada tiga tipe injector yaitu Stop-flow, Septum, Loop Valve.
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

Gambar 2. Posisi pada saat memuat Gambar 3.  Posisi pada saat menyuntik
sampel sampel

Syarat-syarat injektor yang baik:

1.      Dapat memasukan sampel kedalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
2.      Mudah digunakan
3.      Keberulangan tinggi
4.      Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik (Corradini, 2011).

d. Kolom
Kolom merupakan tempat dimana fasa diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solute. Kolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus ang panjangnya antara 3 dan
15 cm dan pada dinding b glan dalam kadang-kadang dilapisi dengan material inert seperti
kaca. Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik disebut cartridge, atau terbuat dari stainless
steel.
Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) merupakan bagian yang
sangat penting, sebab pernisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam
kolom.
Mekanisme Kerja di Dalam Kolom 
Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang
kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu,
sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih
lama.
Penggunaan Kolom
 Banyak faktor harus diperhatikan di menggunakan kolom, agar kolom dapat
berfungsi dengan baik dalam waktu yang relatif panjang. Faktor-faktor yang harus
diperhatikan tersebut seperti:
1. Kualitas Pelarut
2. Larutan Pencuci Kolom
3. Pelarut untuk menyimpan kolom
4. Penggunaan pre kolom (Corradini, 2011).

e. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel didalam
kolom ( analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).
Karakteristik Detektor HPLC :
1.      Absorbsi UV maksimum sensitifitasnya 2 x 10-16
2.      Absorbsi IR maksimum sensitifitasnya 10-6
3.      Flourometri maksimum sensitifitasnya 10-11
4.      Indek Bias maksimum sensitifitasnya 1 x 10-7
5.      Konduktometri maksimum sensitifitasnya 10-8
6.      Spektrometri Massa maksimum sensitifitasnya 10-10
7.      Elektrokimia maksium sensitifitasnya 10-1
Detektor yang paling sering digunakan adalah detektor UV, meskipun dalam spesialis
aplikasi berbagai macam detektor tersedia (Corradini, 2011).
 BAB III
PROSEDUR PREPARASI SAMPEL

Sampel yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh
karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sampel yang lebih
rumit agar sampel yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample
farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif.
Sampel ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja (Mardiana et al, 2014).
Syarat dari sampel yang akan diuji harus dalam bentuk larutan. Untuk skala analisis
sampel dalam mikro Liter, konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat
karena dapat menyumbat kolom dengan konsentrasi maksimal adalah 40 ppm. Oleh karena
itu sampel sebelumnya dapat dilakuan pengenceran agar memperkecil konsentrasinya.
Keunggulan HPLC dibandingkan kromatografi gas yang terletak pada kemampuannya untuk
menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas
pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis
cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang
mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer sehingga tidak dibutuhkan
preparasi sampel khusus dalam HPLC (Dachriyanus, 2015).
DAPUS :
Christian et al. 2014. Analytical Chemistry Seventh Edition. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken
Dachriyanus, Meri Susanti. 2015. KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI. Lembaga
Pengembangan Teknologi Informasi dan Komunikasi (LPTIK) Universitas Andalas,
Padang
Mardiana et al. 2014. Pengaruh Penyiapan Sampel pada Pengembangan Metode Analisis
Laktosa dalam Susu Formula Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Acta
Pharmaceutica Indonesia, Vol XXXIX, No. 1 & 2
Watson, David G. 2012. Pharmaceutical Analysis. Elsevier. China
Corradini, Danilo & Terry M. Phillips. 2011. HandBook of HPLC Second Edition. CRC Press.
New York