KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Tujuan Praktikum :
Praktikan diharapkan mampu menjelaskan dan melakukan identifikasi senyawa kimia dengan
KLT.
Dasar Teori
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen yang dipisahkan
terdistribusi dalam 2 fase. Salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan
permukaan yang luas yang lainnya seperti fluida yang mengalir lembut disepanjang landasan
stasioner. Kromatografi lapis tipis atau TLC(Thin layer chromatography) seperti halnya
kromatografi kertas, murah dan mudah dilakukan. Kromatografi ini mempunyai satu keunggulan
dari segi kecepatan dari kromatografi kertas. Kromatografi lapis tipis membutuhkan hanya
setengah jam saja, sedangkan pemisahan yang umum pada kertas membutuhkan waktu beberapa
jam. Media pemisahannya adalah lapisan dengan ketebalan sekitar 0,1-0,3 mm zat padat
adsorben pada lempeng kaca, plastic dan aluminium.
KLT merupakan contoh dari kromatografi adsorpsi. Fase diam berupa padatan dan fase
geraknya dapat berupa cairan dan gas. Zat terlarut yang diadsorpsi oleh permukaan partikel
padat. Kromatografi adsorpsi memiliki beberapa kekurangan, yaitu : a. pemilihan fase
diam(adsorben), b. koefisien distribusi untuk seringkali tergantung pada kadar total, sehingga
pemisahannya kurang sempurna. Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi
dengan adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben
tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut
dengan eluen.
Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran
beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT
dipilih dengan cara trial and error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor
retensi) yang diperoleh. Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi
dengan jarak yang ditempuh oleh eluen. Rumus faktor retensi adalah: Nilai Rf sangat
karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk
mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih
besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut
dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa
diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8.
Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya.
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam
campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektivitas
pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta memantau
kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat. Analisa kualitatif dengan KLT
dapat dilakukan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk
identifikasi adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak
langsung pada lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometry dan
cara berikutnya dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam
bercak dengan metode analisis yang lain, misalnya dengan metode spektrofotometri. Dan untuk
analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu
dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non- dekstruktif. Bercak yang mengandung analit
yang dituju selanjutnya dikerok dan dilakukan analisis lanjutan.

Cara Kerja:
A. Pengaktifan Plat
Plat KLT dimasukkan kedalam oven pada suhu 105-110C selama 30 menit.

B. Pembuatan Eluen
Eluen non polar = n-Heksan : Etil Asetat dengan perbandingan 6 : 4, 7 : 3, dan 8 : 2
Eluen polar = Kloroform : Metanol : Air dengan perbandingan 6 : 2 : 1, 8 : 2 : 1,
dan 15 : 2 : 1

C. Penjenuhan Chamber
Eluen dimasukkan kedalam chamber hingga tingginya kira-kira 0,5 cm. Kertas saring
dengan panjang melebihi chamber dimasukkan. Tutup chamber, biarkan hingga kertas saring
basah hingga keluar.

D. Penotolan
1. Plat KLT dibuat pola pada sebuah kertas dengan batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5
cm lalu diletakkan plat di atas pola tersebut.
2. Fraksi ditotolkan menggunakan pipa kalpiler pada bagian kanan setipis mungkin.
3. Ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada bagian kiri setipis mungkin.

E. Proses Elusi
Plat KLT yang sudah ditotolkan sampel kemudian dimasukkan kedalam chamber yang
sudah jenuh. Kemudian tutup dan biarkan terelusi sampai batas atas.

F. Pengamatan
Diamati noda yang terpisah dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm. Diamati jarak noda yang
terpisah dan menggambarnya. Dihitung nilai Rf (Retardasi factor) dari tiap noda pada plat.