Analisis Instrumen

KROMATOGRAFI

D III TLM NGUDIA HUSADA MADURA

 PENDAHULUAN
• Teknik analisis yang paling sering digunakan
dalam analisis farmasi.
• Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan
campuran menjadi komponennya dengan
bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing
komponen.
 PENDAHULUAN
• Berdasarkan teknik kerja dan jenis bahan yang
digunakan, kromatografi dibedakan antara lain
menjadi:
Kromatografi Kertas
Kromatografi Kolom
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Gas
1. Kromatografi Kertas
• Kromatografi Kertas adalah kromatografi yang
menggunakan kertas selulosa murni yang
mempunyai afinitas besar terhadap air atau
pelarut polar lainnya.
• Kromatografi kertas digunakan untuk
memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponen penyusun
campuran tersebut.
 Prinsip Kerja
Pelarut bergerak lambat pada kertas,
komponen-komponen bergerak pada laju yang
berbeda, dan campuran dipisahkan berdasarkan
pada perbedaan bercak warna.
 Cara Kerja
• Kertas yang digunakan adalah Kertas
Whatman No. 1.
 Cara Kerja
• Sampel ditetaskan pada garis dasar
kromatografi kertas.
• Kertas digantungkan pada wadah yang berisi
pelarut dan terjenuhkan oleh uap pelarut.
• Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan
penguapan pelarut sama halnya dengan
pergerakan pelarut pada kertas.
a) Sampel ditetaskan pada garis dasar kromatografi kertas. Kertas digantungkan
pada wadah yang berisi pelarut dan terjenuhkan oleh uap pelarut.
b) Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan penguapan pelarut sama halnya
dengan pergerakan pelarut pada kertas.
c) Pelarut akan bergerak lambat pada kertas, dan komponen-komponen penyusun
sampel/campuran juga akan bergerak pada laju yang berbeda. Campuran
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
2. Kromatografi Kolom
• Kromatografi kolom adalah kromatografi yang
menggunakan media kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam
campuran.
 Prinsip Kerja
• Berdasarkan perbedaan absorbsi dan afinitas
komponen-komponen penyusun campuran terhadap
permukaan fase diam.
• Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase
geraknya adalah cairan yang mengalir membawa
komponen campuran sepanjang kolom.
• Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap
absorben (fase diam), akan secara selektif tertahan
dan afinitasnya paling kecil terhadap cairan (fase
gerak).
 Cara Kerja

1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas

kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben/bahan penyerap (fase
diam).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara kuantitatif oleh
bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing
komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita
yang setiap zona berisi satu macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom, dapat ditampung
dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar
kolom.
3. Kromatografi Lapis Tipis
• Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah cara pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya yang digunakan.
• Kromatografi Lapis Tipis dapat digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang
sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
• Proses pengembangan KLT sama seperti kromatografi
kertas dengan kelebihan: aliran lebih cepat,
pemisahan lebih baik, dan banyak pilihan fasa diam.
 Prinsip Kerja
• KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam
pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.
• Gel silika/ alumina merupakan fase diam.
• Fase gerak/eluen merupakan pelarut atau campuran pelarut yang
sesuai.
• Prinsip kerjanya → memisahkan sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini
biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase
geraknya biasanya berupa campuran pelarut yang disesuaikan
dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran
larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran
antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut.
 Pelaksanaan KLT
A. Fase Diam
B. Fase Gerak
C. Aplikasi (Penotolan) Sampel
D. Pengembangan
E. Deteksi Bercak
F. Perhitungan Nilai Rf
A. Fase Diam
• Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan
penyerap berukuran kecil dengan diameter partikel
antara 10-30 μm.
• Biasanya yang digunakan sebagai fase diam adalah
plat tipis yang dilapisi adsorben seperti silika gel,
alumina, ataupun selulosa
• Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan
semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka
semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan
resolusinya.
B. Fase Gerak
• Fase gerak atau sering disebut eluen, biasanya
merupakan campuran yang berbeda polaritasnya.
• Kepolaran dari fase gerak (eluen) sangat
berpengaruh terhadap nilai Rf (faktor retensi) yang
diperoleh
• Sistem atau fase gerak yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi
campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal.
B. Fase Gerak
• Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan
mengoptimasi fase gerak:
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat
tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa
sehingga harga/nilai Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk
memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar
seperti silica gel, polaritas fase gerak akan menentukan
kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan
nilai Rf.
C. Aplikasi (Penotolan) Sampel
• Untuk memperoleh hasil optimal, volume
sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl.
• Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih
besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus
dilakukan secara bertahap dengan dilakukan
pengeringan antar totolan.
D. Pengembangan
• Bila sampel telah ditotolkan maka tahap
selanjutnya adalah mengembangkan sampel
dalam bejana kromatografi yang sebelumnya
telah dijenuhi dengan uap fase gerak.
• Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah
ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak
kurang lebih 0,5-1 cm.
• Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah
lempeng yang telah berisi totolan sampel.
 E. Deteksi Bercak
• Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu
secara kimia maupun fisika.
• Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan
bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan
sehingga bercak menjadi jelas.
Contoh; Penyemprotan dengan larutan ninhidrin
• Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan
bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan
fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet
terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi,
membuat bercak akan terlihat jelas.
 F. Perhitungan Nilai Rf
• Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu
perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang
sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah
nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel.
• Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam,
sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi.
• Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya
senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis.
• Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat
dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai
Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang
berbeda.
 Perhitungan Nilai Rf

• Untuk identifikasi dari senyawa-senyawa yang

terpisah dari lapisan tipis menggunakan harga Rf
(Racing factor / Faktor Retensi).
• Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh komponen,
dibagi dengan jarak yang ditempuh eluen.
• Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :
 Cara Kerja
Cara kerja pada KLT hampir sama dengan
penggunaan kromatografi kertas, hanya saja
pada KLT fase diamnya menggunakan plat tipis
berupa gelas/ logam/alumunium foil, sedangkan
pada kromatografi kertas menggunakan kertas
saring.
 Prosedur yang sering dilakukan pada saat KLT :
• Sejumlah kecil spot larutan yang mengandung sampel diaplikasikan/ditotolkan
pada pelat, sekitar 1,5 cm dari dasar pelat. Pelarut sampel diuapkan hingga
habis, karena dapat mengganggu pemisahan. Jika digunakan pelarut yang tidak
volatil untuk melarutkan sampel, pelat harus dikeringkan dalam bejana vakum.
• Pelarut/eluen yang sesuai dituangkan ke dalam gelas piala atau wadah
transparan yang sesuai dengan kedalaman paling tinggi 1 cm. Kemudian
setelah itu biasanya dilakukan penjenuhan bejana dengan cara selembar kertas
saring diletakkan ke dalam bejana sehingga dasarnya menyentuh pelarut dan
kertas bersandar pada dinding bejana. Bejana ditutup dengan penutup kaca
atau lainnya dan biarkan selama beberapa menit untuk menaiki kertas saring
dan menjenuhi ruang udara bejana. Kegagalan dalam penjenuhan bejana akan
menghasilkan pemisahan yang buruk dan hasil yang tidak optimal.
• Pelat KLT kemudian diletakkan di dalam bejana sedemikian rupa sehingga spot
sampel tidak mengenai permukaan eluen di dalam bejana, kemudian bejana
ditutup. Pelarut akan mendaki pelat berdasarkan gaya kapilaritas, bertemu
dengan campuran sampel dan membawanya naik mendaki pelat (mengelusi
sampel). Pelat harus dikeluarkan dari dalam bejana sebelum pelarut
menyentuh bagian atas dari fasa diam, kemudian dikeringkan.
Pemisahan senyawa terjadi
berdasarkan kompetisi pengikatan
solut dan solven pada fasa diam.
Misalnya, jika digunakan silika gel
sebagai fasa diam, maka fasa diam
bersifat polar. Jika dua senyawa yang
berbeda kepolarannya melintas,
maka senyawa yang lebih polar akan
memiliki interaksi dengan silika gel
lebih kuat daripada senyawa
penyusun campuran lainnya,
sehingga senyawa tersebut akan
tertahan di fase diam dan sedikit
bergerak oleh fase gerak (nilai Rf nya
kecil). Sedangkan senyawa yang
kurang polar akan bergerak lebih
tinggi pada pelat (menghasilkan nilai
Rf yang lebih besar).
4. Kromatografi Gas
• Kromatografi Gas adalah proses pemisahan
campuran menjadi komponen-komponennya
dengan menggunakan gas sebagai fase
bergerak yang melewati suatu lapisan serapan
(sorben) yang diam.
 Prinsip Kerja
• Gas pembawa (biasanya menggunakan
helium, argon/ nitrogen) dengan tekanan
tertentu dialirkan secara konstan melalui
kolom yang berisi fase diam.
• Komponen sampel akan terabsorbsi oleh fase
diam dengan kecepatan berbeda.
 Cara Kerja
• Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah diatur.
• Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh aliran gas pembawa menuju kolom.
• Kemudian didalam kolom, komponen akan terabsorbsi oleh fase diam sampai
terjadi pemisahan.
• Komponen yang terpisah menuju detektor akan menghasilkan sinyal listrik yang
besarnya proporsional.
• Sinyal listrik akan diperkuat oleh amplifier.
• Kromatogram akan dicatat oleh recorder berupa puncak.
 Prinsip Kromatografi
 Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja
berdasarkan prinsip ini.
 Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan (kapilaritas) komponen dalam medium tertentu
 Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua
buah fase yaitu fase diam dan fase gerak
 Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan
melarutkan zat komponen campuran
 Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal,
sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak
lebih cepat
 Semua kromatografi memiliki fase diam dan fase gerak. Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang
terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak
pada laju yang berbeda