KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan
perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Berdasarkan teknik kerja dan jenis bahan yang
digunakan, kromatografi dibedakan antara lain menjadi:

Kromatografi Kertas
Kromatografi Kolom
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Gas
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Kromatografi Kertas
Kromatografi Kertas adalah kromatografi yang menggunakan kertas selulosa murni yang
mempunyai afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lainnya.
Kromatografi kertas digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi
komponen-komponen penyusun campuran tersebut
a) Prinsip
Pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju yang
berbeda, dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
b) Cara Kerja
- Kertas yang digunakan adalah Kertas Whatman No. 1.
- Sampel ditetaskan pada garis dasar kromatografi kertas.
- Kertas digantungkan pada wadah yang berisi pelarut dan terjenuhkan oleh uap
pelarut.
- Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan
pergerakan pelarut pada kertas.

- Sampel ditetaskan pada garis dasar kromatografi kertas. Kertas digantungkan pada
wadah yang berisi pelarut dan terjenuhkan oleh uap pelarut.
- Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan
pergerakan pelarut pada kertas.
- Pelarut akan bergerak lambat pada kertas, dan komponen-komponen penyusun
sampel/campuran juga akan bergerak pada laju yang berbeda. Campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
 2. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan media kolom sebagai alat
untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
a) Prinsip
Berdasarkan perbedaan absorbsi dan afinitas komponen-komponen penyusun campuran
terhadap permukaan fase diam.
Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir
membawa komponen campuran sepanjang kolom.
Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben (fase diam), akan secara
selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil terhadap cairan (fase gerak).
b) Cara Kerja

a. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas kolom dan
dibiarkan mengalir ke dalam adsorben/bahan penyerap (fase diam).
b. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom.
c. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing komponen akan
bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu
macam komponen.
d. Setiap zona yang keluar kolom, dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona
yang lain keluar kolom.

3. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT ) adalah cara pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang digunakan.
Kromatografi Lapis Tipis dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas.
Proses pengembangan KLT sama seperti kromatografi kertas dengan kelebihan: aliran lebih
cepat, pemisahan lebih baik, dan banyak pilihan fasa diam.
a) Prinsip
KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras.
Gel silika/ alumina merupakan fase diam.
Fase gerak/eluen merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Prinsip kerjanya → memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel
dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat
silika dan fase geraknya biasanya berupa campuran pelarut yang disesuaikan dengan jenis
 sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan
eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin
terbawa oleh fase gerak tersebut.
 Fase diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penyerap berukuran kecil dengan diameter
partikel antara 10-30 μm.
- Biasanya yang digunakan sebagai fase diam adalah plat tipis yang dilapisi adsorben seperti
silika gel, alumina, ataupun selulosa
- Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase
diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.
 Fase Gerak
- Fase gerak atau sering disebut eluen, biasanya merupakan campuran yang berbeda polaritasnya.
- Kepolaran dari fase gerak (eluen) sangat berpengaruh terhadap nilai Rf (faktor retensi) yang
diperoleh
- Sistem atau fase gerak yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya
elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan
dapat terjadi secara optimal.
- Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
- Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik
yang sensitif.
- Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga/nilai Rf terletak antara 0,2-
0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
- Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase gerak
akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai Rf.
-
b) Cara Kerja
 Penotolan sampel
- Untuk memperoleh hasil optimal, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl.
- Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus
dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.
 Pengembangan
- Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam
bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak.
- Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak
kurang lebih 0,5-1 cm.
- Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
 Deteksi Bercak
- Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu secara kimia maupun fisika.
- Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi
melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas.
Contoh; Penyemprotan dengan larutan ninhidrin
- Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan
radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk
senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas.
 Perhitungan nilai RF
- Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan
tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran
jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai
nilai perbandingan relatif antar sampel.
- Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam, sehingga nilai Rf
sering juga disebut faktor retensi.
- Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat kromatografi lapis tipis.
- Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan
memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa
tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda.
- Untuk identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis menggunakan harga
Rf (Racing factor / Faktor Retensi).
- Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh komponen, dibagi dengan jarak yang ditempuh eluen.
- Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :

 Cara kerja pada KLT hampir sama dengan penggunaan kromatografi kertas, hanya saja pada
KLT fase diamnya menggunakan plat tipis berupa gelas/ logam/alumunium foil, sedangkan
pada kromatografi kertas menggunakan kertas saring.
 Sejumlah kecil spot larutan yang mengandung sampel diaplikasikan/ditotolkan pada pelat,
sekitar 1,5 cm dari dasar pelat. Pelarut sampel diuapkan hingga habis, karena dapat
mengganggu pemisahan. Jika digunakan pelarut yang tidak volatil untuk melarutkan sampel,
pelat harus dikeringkan dalam bejana vakum.
 Pelarut/eluen yang sesuai dituangkan ke dalam gelas piala atau wadah transparan yang sesuai
dengan kedalaman paling tinggi 1 cm. Kemudian setelah itu biasanya dilakukan penjenuhan
bejana dengan cara selembar kertas saring diletakkan ke dalam bejana sehingga dasarnya
menyentuh pelarut dan kertas bersandar pada dinding bejana. Bejana ditutup dengan penutup
kaca atau lainnya dan biarkan selama beberapa menit untuk menaiki kertas saring dan
menjenuhi ruang udara bejana. Kegagalan dalam penjenuhan bejana akan menghasilkan
pemisahan yang buruk dan hasil yang tidak optimal.
 Pelat KLT kemudian diletakkan di dalam bejana sedemikian rupa sehingga spot sampel tidak
mengenai permukaan eluen di dalam bejana, kemudian bejana ditutup. Pelarut akan mendaki
pelat berdasarkan gaya kapilaritas, bertemu dengan campuran sampel dan membawanya naik
 mendaki pelat (mengelusi sampel). Pelat harus dikeluarkan dari dalam bejana sebelum pelarut
menyentuh bagian atas dari fasa diam, kemudian dikeringkan.
 Pemisahan senyawa terjadi berdasarkan kompetisi pengikatan solut dan solven pada fasa diam.
Misalnya, jika digunakan silika gel sebagai fasa diam, maka fasa diam bersifat polar. Jika dua
senyawa yang berbeda kepolarannya melintas, maka senyawa yang lebih polar akan memiliki
interaksi dengan silika gel lebih kuat daripada senyawa penyusun campuran lainnya, sehingga
senyawa tersebut akan tertahan di fase diam dan sedikit bergerak oleh fase gerak (nilai Rf nya
kecil). Sedangkan senyawa yang kurang polar akan bergerak lebih tinggi pada pelat
(menghasilkan nilai Rf yang lebih besar).
 Kegunaan
- Untuk penentuan jumlah komponen dalam campuran.
- Untuk penentuan identitas antara dua campuran.
- Untuk memonitor perkembangan reaksi.
- Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
- Untuk penentuan kondisi yang sesuai untuk pemisahan pada kromatografi kolom.
- Untuk memonitor kromatografi kolom .

4. Kromatografi Gas

Kromatografi Gas adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dengan

menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam.

a) Prinsip
- Gas pembawa (biasanya menggunakan helium, argon/ nitrogen) dengan tekanan
tertentu dialirkan secara konstan melalui kolom yang berisi fase diam.
- Komponen sampel akan terabsorbsi oleh fase diam dengan kecepatan berbeda.
b) Cara Kerja
- Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah diatur.
- Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh aliran gas pembawa menuju kolom.
- Kemudian didalam kolom, komponen akan terabsorbsi oleh fase diam sampai terjadi
pemisahan.
- Komponen yang terpisah menuju detektor akan menghasilkan sinyal listrik yang
besarnya proporsional.
- Sinyal listrik akan diperkuat oleh amplifier.
- Kromatogram akan dicatat oleh recorder berupa puncak.
5. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
a) Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan salah satu metode kimia dan
fisikokimia. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi termasuk metode analisis terbaru yaitu
suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
b) Prinsip Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1) Fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor dengan bantuan pompa.
2) Sampel dimasukkan ke dalam fase gerak .
3) Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen campuran berdasarkan kekuatan
interaksi solut dengan fasa diam. Solut yang berinteraksi lemah akan keluar lebih
dulu .
4) Setiap komponen yang keluar akan dideteksi oleh detektor lalu direkam dalam
bentuk kromatogram.
c) Cara Kerja
- Mula-mula solven diambil melalui pompa.
- Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat
pada sampel loop
- Sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan
solven masuk kedalam kolom.
- Hasil pemisahan dideteksi oleh detektor, yang penampakannya ditunjukan oleh
perekam (pencatat = recorder).
d) Kelebihan
- Cepat
- Kolom dapat digunakan kembali
- Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik
- Mudah rekoveri sampel
e) Kekurangan
- Memerlukan biaya yang banyak untuk proses pemisahannya
- Memerlukan orang yang trampil dalam pemisahannya