MODUL 3

ANALISA BAHAN ALAM DENGAN KLT

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai :
Mahasiswa mampu melakukan standardisasi kandungan kimia dalam
ekstrak dengan pemeriksaan profil KLT
1.2 Tujuan Praktikum :
Memantau profil kromatogram bahan uji berupa simplisia atau ekstrak
untuk memberikan gambaran awal komposisi kandungan kimia
berdasarkan pola kromatogram lapis tipis

2. Prinsip
Pemisahan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak akan
terdisitribusi diantara fase diam dan fase geraknya membentuk pola
kromatogram yang khas dengan metode Kromatografi lapis tipis. Pemisahan
terjadi dengan karena perbedaan migrasi senyawa dalam sistem kromatografi.

3. Pendahuluan/ dasar teori

Kromatografi merupakan teknik pemisahan solut oleh suatu proses migrasi
diferensial dinamis dalam suatu sistem yang terdiri dari dua fase yaitu fase
yang tetap tinggal dalam sistem (fase diam) dan fase yang bergerak melalui
celah-celah fase diam (fase gerak). Pemisahan terjadi karena adanya
perbedaan distribusi senyawa dan kecepatan migrasi senyawa. Perbedaan
distribusi dapat terdeskripsikan dengan nilai koefisien distribusi yang
berbeda-beda. Koefisien distribusi suatu senyawa didefinisikan sebagai rasio
konsentrasi senyawa tersebut didalam fase diam terhadap konsentrasi dalam
fase gerak. Senyawa yang memiliki koefisien distribusi lebih besar
menunjukkan konsentrasi senyawa tersebut pada fase diam lebih besar
dibanding fase geraknya sehingga lebih tertahan lama di dalam fase diam.
Gerakan fase gerak menyebabkan perbedaan migrasi senyawa-senyawa yang
akan dipisahkan. Kecepatan migrasi suatu senyawa tergantung afinitas
 senyawa dalam fase diam yang dapat terjadi melalui mekanisme adsorbsi,
partisi, pertukaran ion, atau ekslusi ukuran.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan kromatografi planar, yang fase
diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar
yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya
(Sastrohamidjojo, 1991). Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang
memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT
dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan
dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen
untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi
kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni
skala kecil
Pemisahan senyawa-senyawa yang terkandung dalam suatu bahan alam
dengan metode KLT ini akan memberikan pola kromatogram yang khas. Oleh
karena itu, profil kromatogram ekstrak merupakan salah satu parameter
spesifik ekstrak dari suatu bahan alam.

4. Alat dan bahan

Alat :
 Chamber
 Gelas ukur
 Detektor Lampu UV 254nm dan UV 365nm

Bahan :
 Simplisia dan ekstrak : Alpiniae galanga rhizome, Foeniculi vulgaris
fructus, Curcuma longae rhizome, Psidii folium
 Plat KLT Silica gel GF 254
 Pembanding : eugenol,trans-anetol, kurkumin, kuersetin,
 Pipa kapiler
 Kertas saring
 Etanol P
  Toluen P
 Aseton P
 Etil asetat P
 Kloroform P
 Metanol P
 Asam format P
 Penampak bercak : Anisaldehid-asam sulfat LP, Aluminium klorida LP

5. Prosedur kerja
Prosedur :
Penyiapan larutan uji :
Timbang seksama lebih kurang 1 g serbuk simplisia/ sampel uji, rendam
sambil dikocok di atas tangas air dengan 10 mL pelarut yang sesuai yang
tertera dalam monografi selama 10 menit. Masukkan filtrat ke dalam labu
tentukur 10-mL tambahkan pelarut sampai tanda.
Prosedur :
1) Totolkan larutan uji, larutan pembanding (sesuai monografi), serta
campuran larutan uji dan larutan pembanding, menurut cara yang tertera
pada masing-masing monografi dengan jarak antara 1,5 sampai 2 cm dari
tepi bawah lempeng, dan biarkan mengering. Gunakan Alat sablon untuk
menentukan tempat penotolan dan jarak rambat, beri tanda pada jarak
rambat.
2) Siapkan fase gerak sesuai dengan monografi
3) Lakukan penjenuhan bejana KLT (chamber) dengan cara menempatkan
kertas saring dalam bejana kromatografi. Tinggi kertas saring 18 cm dan
lebarnya sama dengan lebar bejana. Masukkan sejumlah fase gerak ke
dalam bejana kromatografi, hingga tingginya 0,5 sampai 1 cm dari dasar
bejana. Tutup kedap dan biarkan hingga kertas saring basah seluruhnya.
Kertas saring harus selalu tercelup ke dalam fase gerak pada dasar bejana.
Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, prosedur KLT
dilakukan dalam bejana jenuh
4) Tempatkan plat KLT pada rak penyangga, hingga tempat penotolan
terletak di sebelah bawah, dan masukkan rak ke dalam bejana
 kromatografi (chamber). Fase gerak dalam bejana harus mencapai tepi
bawah lapisan penjerap, totolan jangan sampai terendam.

Fase gerak
Gambar 3.1 Penotolan senyawa pada plat KLT
(Sumber https://www.academia.edu/5087478/Kromatograf)
5) Letakkan tutup bejana pada tempatnya dan biarkan fase gerak merambat
sampai batas jarak rambat.

Gambar 3.2 Fase gerak merambat sampai tanda batas atas

Sumber:(http://antonchemical.blogspot.co.id/2013/01/kromatografi_24.html)
6) Keluarkan lempeng dan keringkan di udara, dan amati bercak dengan
sinar tampak, ultraviolet gelombang pendek (254 nm) kemudian dengan
ultraviolet gelombang panjang (366 nm).
7) Ukur dan catat jarak tiap bercak dari titik penotolan serta catat panjang
gelombang untuk tiap bercak yang diamati.
8) Tentukan nilai Rf (Retordation Factor) dari bercak yang terpantau.

9) Jika diperlukan, semprot bercak dengan pereaksi penampak bercak,

amati dan bandingkan kromatogram bahan uji dengan kromatogram
pembanding.
Bagan Kerja :
6. Hasil Praktikum
Nama Sampel Uji :
Hasil pengamatan :
7. Diskusi dan pembahasan
8. Kesimpulan

9. Pustaka
1. Kemenkes RI (2017) Farmakope Herbal Indonesia. 2nd ed. Jakarta:
Kementrian Kesehatan RI
2. Depkes RI (2000) Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat.
1st ed. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan-Depkes RI.
3. Hardjono Sastrohamidjojo, Dr., 1991, Kromatografi, Penerbit Liberty,
UGM, Yogyakarta.
4. https://www.academia.edu/5087478/Kromatografi, Diakses tanggal 1
Maret 2023