LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

UJI KLT DENGAN BERBAGAI ELUEN

FARMASI F

KELOMPOK 2

AGUSTIN AYUN WULANDARI

201410410311061

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG

2017
 I. Tujuan :

Mahasiswa mampu menjelaskan tentang kaitan antara polaritas eluen dengan harga Rf.
II. Tinjauan Pustaka
A. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
KLT merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sempel yang ingin
dideteksi dengan memisahkan komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran,
metode pemisahan fisika kimia dengan fase gerak dan fase diam yang diletakkan pada
penyangga berapa plat atau lapisan yang cocok zat yang memiliki kepolaran yang
sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rfnya paling kecil pada
identifikasi noda atau penampak noda. Jika noda sudah berwarna dapat langsung
diperiksa dan ditentukan Rf. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh
komponen dibagi dengan jarak tempuh eluen untuk setiap sneyawa.
Faktor yang mempengaruhi harga Rf :
- Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
- Sifat dan penyerap derajat aktifitasnya
- Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
- Pelarut fase gerak
- Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembang yang digunakan
- Suhu
- Jumlah campuran yang digunakan
Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi
senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari
senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh
senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal..
Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.
Pada kromatografi lapisan tipis, terdapat lapisan tipis ( tebal 0.1-2 mm ) yang
terdiri atas bahan padat yang dilapiskan kepada permukaan penyangga datar ( plat ),
yang biasanya terbuat dari kaca, tetapi dapat pula terbuat dari plat polimer atau
logam. Lapisan yang melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat,
biasanya kalsium sulfat dan kromatografi lapisan tipis dapat digunakan untuk
keperluan yang luas dalam pemisahan-pemisahan.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
 kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk
kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,
identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa
yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak
bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.

B. Pelaksanaan KLT
1.Fase Gerak
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut
ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara
optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak
:
 Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknik yang sensitif.
 Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara
0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
 Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai
Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut
non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
 Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai
fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan tertentu.
Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan meningkatkan
solute-solut yang bersifat basa dan asam.
2.Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran ratarata partikel fase
diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT
 dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah
silica dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah
adsorpsi dan partisi. Berikut ini adalah beberapa penjerap fase diam yang digunkanan
pada KLT
3.Aplikasi (Penotolan) Sampel
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling
sedikit 0,5 µl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 µl, maka
penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.
4.Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan
sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase
gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam
fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah
lempeng yang telah berisi totolan sampel.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian
lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya
bejana dilapisi dengan kertas saring . Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas
saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. (Created by Rahma G).
5.Deteksi Bercak
Deteksi bercak pada KLt dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia
yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui
cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan
untuk menampakkan bercak adalah dengan denagan cara pencacahan radioaktif dan
fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang
dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Berikut adalah cara-cara
kimiawi untuk mendeteksi bercak :
 Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara
kimia dengan solute yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak
menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat
reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak.
 Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang gelombang
emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solute sebagai bercak yang gelap atau bercak
yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluorosensi seragam. Lempeng yag
diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa
fliorosen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan
dasar fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen
fluorosensi setelah dilakukan pengembangan.
 Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan
untuk mengoksidasi solute-solut organic yang akan Nampak sebagai bercak hitam
sampai kecoklat-coklatan.
 Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.
 Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrument
yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng
ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu
menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatatan (recorder)
6.Perhitungan Nilai Rf
jarak yang ditempuh oleh komponen
Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :Rf= jarak yang ditempuh oleh pelarut

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang baik
yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8.
7.Altertatif Prosedur KLT
Adanya variasi prosedur pengembangan KLT dilakukan untuk meningkatkan
resolusi, sensitifitas, kecepatan, reprosudibilitas dan selektifitas. Beberapa
pengembangan ini meliputi KLT 2 dimensi, Pengembangan kontinyu dan
Pengembangan gradient. KLT 2 dimensi atau KLT 2 arah ini bertujuan untuk
meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai
karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama
sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, system 2 fase gerak yang sangat
berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas
yang berbeda.
 Pengembangan kontinyu dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara
terus menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki) melalui
suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan. Pengembangan
gradient dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak yang berbeda-beda.
Tujuan utama system ini adalah untuk mengubah polaritas fase gerak. Meskipun
demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit.
(Gandjar,2007).

C. Tinjauan Pustaka Tentang Eluen

 Eluen
Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam
membawa komponen-komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam
dan membawa komponen-komponen senyawa yang akan dipisahkan.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel (Johnson, 1991).
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel
yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase gerak yang
digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan
yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus:
• Murni; tidak ada pencemar/kontaminan
• Tidak bereaksi dengan pengemas
• Sesuai dengan detektor
• Melarutkan cuplikan
• Mempunyai viskositas rendah
• Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
• Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
PELARUT INDEK POLARITAS
Pentana 0
1,1,2-Triklorotrifluoroetana 0
Siklopentana 0,1
Heptana 0,1
Heksana 0,1
Iso oktana 0,1
Petroleum eter 0,1
Sikloheksana 0,2
N-butiklorida 1,0
Toluena 2,4
Metal t-butil eter 2,5
o-xylene 2,5
Klorobenzena 2,7
O-diklorobenzena 2,7
Etil eter 2,8
Dikolrometana 3,1
Etilen diklorida 3,5
n-butil alcohol 3,9
Isopropil alcohol 3,9
n-butil asetat 4,0
Isobutyl alkohol 4,0
Metal isoamil keton 4,0
n-propil alkohol 4,0
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Metal isobutyl keton 4,2
Etil asetat 4,4
Metal n-propil ketone 4,5
Metal etil ketone 4,7
1,4- dioxana 4,8
Aseton 5,1
Methanol 5,1
Piridin 5,3
2-metoksiatenol 5,5
Asetonitrit 5,8
Propilen karbonat 6,1
N-n dimetilformamida 6,4
Dimetil asetamida 6,5
N-metilpirolidon 6,7
Dimetilsulfoksida 7,2
Air 10,2

 Etil Asetat

Etil asetat adalah senyawa organic dengan rumus CH3CH2OC(O)CH3. Senyawa ini
merupakan ester dan etanol dan asam asetat. Senyawa ini berwujud cair, tidak berwarna, dan
memiliki bau aroma khas. Etil asetat merupakan pelarut polar menengah yang mudah
menguap, tidak beracun dan tidak higroskopis. Etil asetat dapat melarutkan air hingga 30% dan
larut dalam air hingga kelarutan 8%. Etil asetat merupakan penerimaan ikatan hydrogen yang
lemah dan bukan suatu donor ikatan hydrogen karena tidak adanya proton yang bersifat asam.
Senyawa yang tidak stabil dalam air yang mengandung asam atau basa. Etil asetat dapat
dihirdolisis pada keadaan asam atau basa yang menghasilkan asam asetat dan etanol kembali
Katalis yang digunakan adalah asam sulfat (H2SO4), karena berlangsungnya reaksi.
Reaksi kebalikan hidrolisis yaitu, esterifikasi ficher. Untuk memperoleh hasil rasio yang tinggi
 biasanya digunakan asam kuat dengan proposi stoiklometris, misalnya natrium hidroksida.
Reaksi ini menghasilkan etanol dan natrium asetat yang tidak dapat di reaksi lagi dengan
etanol. Sifat fisika dan kimia etil asetat dapat dilihat pada tabel dibawah ini:
Sifat Fisika Sifat Kimia
Berbau Khas Rumus molekul
Titik didih : 77,1 0C Mudah menguap
Densitas : 0,89 gr/cm3 Tidak Beracun
Berat Molekul : 88,12 gr/mol Tidak Higroskopis
Tidak berwarna
Tabel 1. Sifat fisika dan sifat kimia etil asetat

 Kloroform

Kloroform memiliki rumus molekul CHCL3 merupakan larutan yang mudah menguap,
tidak berwarna, memiliki bau tajam dan merusak, serta bila terhirup dapat menimbulkan
kantuk, kloroform dapat disintesis dengan cara mencampur etil alcohol dengan etanol dengan
kalsium hipokrit. Kalsium hipokrit merupakan donor unsure ester. Etil alcohol dipanaskan dan
dicampur dengan kalsium hipokrit. Untuk mendapatkan kloroform dari reaksi pencampuran ini
terdapat 3 reakso yang terjadi yaitu reaksi oksidasi, klorinasi, dan hidrolisis.
Klorofom dapat digunakan untuk mengeskraksi komponen yang tidak larut dalam air
seperti lipid alam proses isolasi DNA. Kloroform juga dapat digunakan untuk
mengkuantifikasi secara kasar kandungan lipid dalam suatu sampel.
 Sifat Fisika Kloroform
1. Berat molekul : 119,38 gr/mol
2. Titik didih : 61,20 C
3. Titik lebur : - 63,50 C
4. Massa jenis : 1,49 gr/cm3 (200 C)
5. Kelarutan dalam air : 0,82 gr/l (200 C)
6. Viskositas : 0,542 cP

 Methanol

Methanol diproduksi secara alami oleh metabolism anaerobic oleh bakteri. Hasil proses
tersebut adalah uap methanol (dalam jumlah kecil) di udara. Setelah itu, uap methanol tersebut
akan teroksidasi oleh oksigen dengan bantuan sinar matahari menjadi karbon dioksida dan air.
Methanol adalah senyawa kimia dengan rumus kimia CH3OH. Dia merupakan bentuk
alcohol paling sederhana. Pada keadaan atmosfer ia berbentuk cairan yang ringan, mudah
menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau khas. Methanol digunakan
sebgai pendingin, anti beku, pelarut, bahan bakar dan sebagai bahan additive bagi etanol
industry.
 nama resmi : Metil alcohol
 Berat molekul : 32.04 g/mol
 Pemerian : mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, beracun dengan bau
khas
 Kegunaan :sebagai bahan pendingin anti beku, pelarut, bahan bakar, dan sebagai
bahan additive bagi etanol industry.
 n-Heksana
 Heksana adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus kimia C6H14.
Awalan heks- merujuk pada enam atom karbon yang terdapat pada heksana dan akhiran -ana
berasal dari alkana, yang merujuk pada ikatan tunggal yang menghubungkan atom-atom karbon
tersebut. N-heksana merupakan jenis pelarut organik. Fungsi dari heksana adalah untuk
mengekstraksi lemak atau untuk melarutkan lemak, sehingga merubah warna dari kuning
menjadi jernih (Mahmudi 1997). n-heksana merupakan cairan tak berwarna dan dapat dibakar.
Heksana juga umum terdapat pada bensin dan lem sepatu, kulit dan tekstil. Dalam keadaan
standar senyawa ini merupakan cairan tak berwarna yang tidak larut dalam air.

D. Tinjauan Kolesterol
 kolesterol
Kolesterol ( C27H45OH ) adalah alkohol steroid yang ditemukan dalam lemak hewani /
minyak, empedu, susu, kuning telur. Kolesterol sebagian besar disintesiskan oleh hati dan
sebagian kecil diserap dari diet. Keberadaan kolesterol dalam pembuluh darah yang kadarnya
tinggi akan membuat endapan / kristal lempengan yang akan mempersempit / menyumbat
pembuluh darah. Kolesterol merupakan komponen penting untuk pembentukan membran sel dan
disintesis di seluruh jaringan, tetapi 90% disintesis dalam sel mukosa usus dan hepatosit. Dalam
hati kolesterol merupakan precursor dari asam empedu, dalam gonad dan kelenjar, anak ginjal
sebagai precursor dari hormon steroid. Asam lemak bebas ( free fatty acids ) dibebaskan ke
dalam plasma oleh lemak jaringan, diantara waktu-waktu makan dan selama berpuasa digunakan
sebagai bahan bakar terutama oleh jaringan otot dan jantung
Kolesterol dalam tubuh mempunyai fungsi yang penting, diantaranya adalah
a. Sebagai pelindung otak, 11 % dari berat otak adalah kolesterol.
b. Bersama zat gizi lainnya kolesterol dan sinar matahari membentuk vitamin D.
c. Merupakan zat esensial untuk membran sel.
d. Merupakan bahan pokok untuk pembuatan garam empedu yang diperlukan untuk pencernaan
makanan.
e. Bahan baku pembentukan hormon steroid, misalnya progesterone dan estrogen pada wanita,
testosteron pada laki-laki.
f. Untuk mencegah penguapan air pada kulit
g. Membawa lemak keseluruh tubuh melalui peredaran darah.
Penyimpanan kolesterol Secara umum sampel dimana kolesterol diperiksa seharusnya tidak
dibekukan, siklus beku cair akan merusak struktur lipoprotein dan menurunkan resolusi
lipoprotein. Pemeriksaan kolesterol sebaiknya dianalisa segera. Metode pemeriksaan kolesterol
adalah dengan Metode Lieberman – Burchad yang mempunyai prinsip kolesterol dengan asam
asetat anhidrida dan asam sulfat pekat membentuk warna hijau kecoklatan. Absorben warna ini
sebanding dengan kolestrol dalam sampel. Metode kolorimetri langsung dengan reagen
Lieberman – Burchad penyerapan chromaphores yang dihasilkan dari kolesterol dan ester
kolestrol berbeda. Ester kolesterol menghasilkan warna yang lebih benyak dibandingkan dengan
kolesterol non ester dan mempunyai bias 10 – 15 % ketika analisa dilakukan berdasarkan standart
kolesterol non ester. Metode ini memerlukan kerja keras disebabkan karena ester kolesterol harus
dihidrolisa dan kolestrol diekstraksi. Tujuan ekstrsksi ini mencegah adanya zat-zat pengganggu
yang akan mempengaruhi hasil, contohnya hemoglobin dan billirubin.
III. Prosedur Kerja
Larutkan sedikit kolesterol kedalam kloroform

Totolkan pada 4 plat KLT (Kiesel gel 254)

Siapkan 4 macam eluen (fase gerak) yaitu

n-heksan-etil asetat (1:1)
n-heksan-etil asetat (4:1)
Kloroform-metanol (4:1)
Kloroform-etil asetat (4:1)

Eluasi 4 plat KLT tersebut dengan eluen yang dibuat

Semprot dengan penampak noda anisaldehid asam asam sulfat

Panaskan 100˚C samapi timbul noda berwarna merah ungu/ungu

Hitung harga Rf pada masing-masih plat KLT

Diskusikan mengapa harga Rf pada masing-masing berbeda

IV. Skema kerja
 Daftar Pustaka

 Harborne. J.B.,1987. Metode Fitokimia , terjemahan K. Radmawinata dan I.

Soediso, 69-94, 142-158, 234-238. Bandung : ITB Press
 Teyler.V.E.et.al.1988.Pharmacognosy Edition 9th. 187 – 188. Phiadelphia : Lea
& Febiger
 Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman., 2007,Kimia Farmasi Analisis,
pustaka pelajar, Yogyakarta
 www.ilmukimia.org › Ikatan Kimia › Kimia Anorganik diakses pada tanggal 15
april 2017 jam 10.52 WIB
 repository.usu.ac.id/bitstream/.../4/Chapter%20II.pdf diakses pada tanggal 15
april 2017 jam 10.52 WIB