Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi
diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya
bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu
menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi,
kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana
kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi di
gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponen. Seluruh
bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip ini.
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel
yang ingin di deteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan
perbedaan kepolaran. Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisika-kimia dengan
fase gerak (larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkan
pada penyangga berupa plat gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadi selama
perambatan kapiler (pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki
kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rf-nya paling
kecil. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar
perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang.
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat
langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada
pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak
tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa.

Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf
juga disebut factor referensi.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis
yang juga mempengaruhi harga Rf adalah :
Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan
molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap
akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase
bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,
 jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada)
dicampur hingga homogen.
Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal
lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula
dalam daerah yang kecil dari plat.
Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan
tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang
dipakai harus betul-betul diperhatikan.
Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena
cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).
Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda
dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan
mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
Suhu.
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk
mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan
atau perubahan-perubahan fase.
Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas,
hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala
bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran,
akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-
komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.
Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung
substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi
pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak
tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada
lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisi-
posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak
itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

Prinsip Kerja KLT

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase
diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi
dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase
diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.
Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada
proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara
adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu
pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah
jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan
relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel
silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin
terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like dissolved like.

Fase Diam dan Fase Gerak KLT

Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan
fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada
fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan
bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir
melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran.
Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.

Fase Diam
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel atau
alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel
silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis
seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra
violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH.

Fase Gerak
Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi
bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent
dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah
jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret
eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut
yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:
Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :
Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi
atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
 Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan
cara elusi 2 dimensi.
Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa
Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)
Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).
Preparasi sample yang mudah
Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin
Kebutuhan ruangan minimum

Analisis KLT banyak digunakan karena :

Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek

Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang
konstituen utama dalam sampel
Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel
Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis
kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi

Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat
diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat
paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat
atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang
dikehendaki.
Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar
ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa
dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4 dalam H2SO4 yang kemudian akan berinteraksi
dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan
membentuk warna-warna tertentu.
Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan
perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai
maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan menggunakan silika gel sebagai
fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga
Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar.
Analisis dengan KLT juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok

kandungan kimianya telah diketahui.

Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain :

1. Alkaloid

2. Antraglikosida

3. Arbutin

4. Glikosida Jantung

5. Zat pahit

6. Flavonoid

7. Saponin

8. Minyak atsiri

9. Kumarin dan asam fenol karboksilat

10. Valepotriat