Dasar Teori

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola

pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen berupa molekul yang
berada pada larutan. teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen komponen campuran diantara dua fase, yaitu fase diam / tetap ( padat atau cair ).
Fase diam bersifat menahan komponen, sedangkan fase gerak akan melarutkan komponen. Pada
kromatografi kertas, fase diam berupa selulosa yang terdapat dalam kertas sedangkan fase gerak
berupa pelarut yang sesuai dan fase gerak ( cair atau gas ). Dalam hal ini kromatografi juga
merupakan cara untuk memisahkan dan mengidentifikasi campuran. Dan pada kromtografi
kolom Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian rupa
sehingga faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan
waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom
dipilih supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Eluen yang digunakan
dapat dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen
yang sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom. Sedangkan Fasa diam yang
digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya berupa silika gel
atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk
microporous untuk meningkatkan luas permukaan.
Ada beberapa cara kromatografi, diantaranya adalah kromatografi kertas dan kromatografi
kolom. Salah satu penggunaan kromatografi kertas adalah pemisahan zat warna dalam tinta.
Metode ini sesuai dengan kromatografi serapan dan sekarang kromatografi kertas dipandang
sebagai sistem partisi. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong fase tetap yaitu
bubuk selulosa ( kertas saring ) dan sebagai pelarut dan fase gerak adalah zat cair yang sesuai,
misalkan air, etanol, asam asetat.
Pada kromatografi kertas jika setetes cuplikan diteteskan pada sepotong kerrtas saring
maka akan meluas dengan membentuk noda bulat. Kertas saring dimasukkan dalam bejana
tertutup yang berisi pelarut, maka pelarut akan bergerak melalui serat serat kertas saring. Bila
daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari
senyawa.
Metode identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan kedudukan dari noda relatif
terhadap permukaan relatif , menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan
migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran
karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak
senyawa dari titik awal dan jarak pelarut dari titik awal.
Kromatografi kolom umumnya digunakan sebagi teknik pemurnian untuk mengisolasi
komponen yang diinginkan dai sutu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (adsorben

padat) ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak 9cairan) ditempatkan pada
bagian atas kolom dan begerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan
eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimsukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke
dalam kolom dan bergerak ke bawah melewtikolom. Keseimbangan terjadi antara komponen
yang teradsopsi pda adorben dengan pelarut yang terelusi mengalir melewati kolom.
Klasifikasi Kromatografi Kolom
1. Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben
a. Kromatografi adsorbsi
Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada
permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom.
b. Kromatografi partisi
Dalm kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara
lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dn eluen yang
bertindak sebagai fase gerak.
c. Komatografi petukaran ion
Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen
tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi oleh
fase gerak.
d. Komatogrfi filtrasi gel

Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam.
Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari
komponen yang dipisahkan.
2. Berdasarkan gatya yang bekerja pada kolom
Kromatografi kolom kategori ini tergantung pada bagaimana eluen bergerak melewati kolom,
terdiri dari kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi kolom tekanan.
a. Kromatografi kolom gravitasi
Dalm komatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau perkolasi.
b. Kromatografi kolom tekanan
Adsorben
Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian tekanan pada
kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi.
Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum disunakan untuk
kromatografi kolom. Jika ukuran mesh lebih besar, maka ukuran silika tersebut lebih kecil.
Ukuran partikel dari adsorben sngat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom.
Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan
sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi
kolom gravitasi.
Alumina lebih sering digunakan dalam komtografin kolom dibanding kromtografi lapis tipis.
Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. CAranya ialah

dengan mengeringkan alumina pada suhu 360OC selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina
kering tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dri kadar irnya
dan dinyatakan dalam skala Brockman.
Pelarut
Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan
keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi
terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang
terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama.
Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi
kolom. Dalm hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk
mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polah ditambahkan untuk mengelusi
komponen yang lebih polar juga.

Kromatografi kertas
Percobaaan kromatografi kertas bertujuan untuk mengenal salah satu pemisahan zat
dengan kromatografi kertas, mengidentifikasi klorofil, karoten, xautin dalam hijau daun dengan
kromatografi kertas, mengidentifikasi komponen penyusun tinta dengan kromatografi kertas.
.

Ada beberapa cara kromatografi, salah satu diantaranya adalah kromatografi kertas. Salah
satu penggunaan kromatografi kertas adalah pemisahan zat warna dalam tinta. Metode ini sesuai
dengan kromatografi serapan dan sekarang kromatografi kertas dipandang sebagai sistem partisi.
Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong fase tetap yaitu bubuk selulosa ( kertas
saring ) dan sebagai pelarut dan fase gerak adalah zat cair yang sesuai, misalkan air, etanol, asam
asetat.
Pada kromatografi kertas jika setetes cuplikan diteteskan pada sepotong kerrtas saring
maka akan meluas dengan membentuk noda bulat. Kertas saring dimasukkan dalam bejana
tertutup yang berisi pelarut, maka pelarut akan bergerak melalui serat serat kertas saring. Bila
daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari
senyawa.
Metode identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan kedudukan dari noda relatif
terhadap permukaan relatif , menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan
migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran
karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak
senyawa dari titik awal dan jarak pelarut dari titik awal.
Kromatografi kolom
Molekul yang terlarut dalam fase gerak akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat
dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat
dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom,
komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk
analisis lebih lanjut (Anonim, 2012).
Kromatografi pertukaran ion biasa digunakan untuk pemurnian materi biologis seperti
asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom
maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation dan
pertukaran anion. Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif sedangkan pada
pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase
cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul
tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka
molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang
menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu.
Pemisahan dengan metode ini sangat selektif karena biaya untuk menjalankan metode ini murah

serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan
(Anonim, 2012)
Berdasarkan penjabaran di atas maka untuk memperdalam pengetahuan tentang resin
pertukaran ion maka dilakukanlah percobaan tentang teknik pemisahan kromatografi kolom.

Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari
campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparatif.

Peralatan Kromatografi Kolom

Alat utama yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 5 cm - 1
m. Pada bagian dasar tabung diberi semacam penyaring dari glass wool untuk menghindari
hilangnya fasa diam.
Fasa gerak
Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian rupa sehingga
faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan waktu dan
jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom dipilih
supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Eluen yang digunakan dapat
dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen yang
sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.
Fasa diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya
berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam
berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas permukaan.

Metode
Dua metode utama yang digunakan yaitu metode kering dan metode basah:
Metode kering
Pada metode kering, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan fasa gerak
yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.
Metode basah

Pada metode basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa
diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benar-benar hati-hati
supaya tidak ada gelumbung udara. Larutan senyawa organik dipipet di bagian atas fasa diam,
kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.

Cara Kerja Kromatografi Kolom

Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika eluen
dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian
kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda
dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masingmasing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil
kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip,
kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan
spektroskopi.

Kromatografi kolom umumnya digunakan sebagi teknik pemurnian untuk mengisolasi

komponen yang diinginkan dai sutu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (adsorben
padat) ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak 9cairan) ditempatkan pada
bagian atas kolom dan begerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan
eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimsukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke
dalam kolom dan bergerak ke bawah melewtikolom. Keseimbangan terjadi antara komponen
yang teradsopsi pda adorben dengan pelarut yang terelusi mengalir melewati kolom.
Klasifikasi Kromatografi Kolom
2. Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben
b. Kromatografi adsorbsi
Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada
permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom.
c. Kromatografi partisi

Dalm kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara
lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dn eluen yang
bertindak sebagai fase gerak.
d. Komatografi petukaran ion
Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen
tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi oleh
fase gerak.
e. Komatogrfi filtrasi gel
Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam.
Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari
komponen yang dipisahkan.
3. Berdasarkan gatya yang bekerja pada kolom
Kromatografi kolom kategori ini tergantung pada bagaimana eluen bergerak melewati kolom,
terdiri dari kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi kolom tekanan.
b. Kromatografi kolom gravitasi
Dalm komatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau perkolasi.
c. Kromatografi kolom tekanan
Adsorben

Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian tekanan pada
kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi.
Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum disunakan untuk
kromatografi kolom. Jika ukuran mesh lebih besar, maka ukuran silika tersebut lebih kecil.
Ukuran partikel dari adsorben sngat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom.
Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan
sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi
kolom gravitasi.
Alumina lebih sering digunakan dalam komtografin kolom dibanding kromtografi lapis tipis.
Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. CAranya ialah
dengan mengeringkan alumina pada suhu 360OC selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina
kering tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dri kadar irnya
dan dinyatakan dalam skala Brockman.
Pelarut
Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan
keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi
terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang
terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama.
Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi
kolom. Dalm hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk
mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polah ditambahkan untuk mengelusi
komponen yang lebih polar juga.