Kromatografi

A. Penggolongan kromatografi
Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering
digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis,
baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan,
industri, dan sebagainya.
Kromatografi dapat digolong atas dasar wujud fase gerak, maka dikenal kromatografi gas
dan kromatografi cair. Bila digolongkan bentuk fase diam, maka dikenal kromatografi planar
dan kromatografi kolom. Dapat juga digolongkan atas dasar cara fase gerak mengalir
menelusuri fase diam. Penggolongan atas dasar bentuk fase gerak dan fase diam, yang
selanjutnya sebagai cara menamai kromatografi secara formal, misalnya: kromatografi gas
cairan, kromatografi cairan cairan. Namun menggolongkan kromatografi secara ilmiah adalah
atas dasar mekanisme pemisahan. Sehingga dikenal: kromatografi serapan (adsorption
chromatography), kromatografi partisi (partition chromatography), kromatografi eksklusi
(exclusion chromatography), kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography) dan
kromatografi afinitas (affinity chromatography). Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam
analisa kualitatif dan kuantitatif yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian
Farmakope Indonesia adalah kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas,
Kromatografi Lapis Tipis dan KCKT,
B. Definisi istilah
Diberikan beberapa definisi untuk memahami kromatografi misalnya : fase diam, fase
gerak, fase pendukung, elusi, visualisasi, Rf, tR, derivatisasi, resolusi, faktor kapasitas, dll.
Mekanisme pemisahan
Sebelum menjelaskan mekanisme pemisahan, direview sejenak pengertian mengenai
polaritas senyawa (polar dan non polar), diawali dengan unsur elektronegatif, ikatan kovalen,
momen dipol dan interaksi terjadinya ikatan hidrogen. Konsep like dissolves like, senyawa
polar mudah larut di dalam pelarut polar dan sebaliknya senyawa non polar larut dalam
senyawa non polar. Pembahasan mekanisme pemisahan secara partisi diawali dengan

menjelaskan ekstraksi pelarut menggunakan dua pelarut yang tidak saling campur, tetapan
partisi, KD (hukum Nernst). Dilanjutkan aplikasi KD pada ekstraksi (counter current
distribution) dari Craig. Bila campuran senyawa yang masing-masing senyawa berbeda nilai
KDnya, maka senyawa akan dapat dipisahkan dengan cara ekstraksi Craig. Mekanisme
pemisahan ini adalah secara partisi. Kejadian kesetimbangan konsentrasi senyawa diantara
dua pelarut yang tidak saling campur dalam satu tabung dianalogikan kejadian
kesetimbangan dalam plat teori. Dibahas sepintas teori distilasi supaya mahiswa lebih dapat
memahami pengertian plat teori (N) pada distilasi, counter current extraction dan
kromatografi partisi. Mekanisme pemisahan secara adsorpsi dijelaskan dengan pendekatan
animasi bila fase diam bersifat polar dan fase gerak bersifat non-polar, terjadi persaingan
untuk membuat ikatan hidrogen dengan molekul sampel. Pada sistem ini senyawa sampel
polar akan ditahan fase diam polar lebih lama dibanding dengan senyawa sampel non-polar.
Mekanisme pemisahan secara eksklusi terjadi bilamana fase diam molekulnya mempunyai
pori yang seragam, sehingga molekul senyawa sampel yang ukurannya kecil akan dapat
masuk ke pori molekul fase diam, molekul sampel ini akan ditahan lebih lama oleh fase diam,
sedangkan molekul sampel yang ukurannya lebih besar tidak ditahan oleh fase diam.
Mekanisme pemisahan secara pertukaran ion, terjadi bilamana molekul fase diam adalah
senyawa polimer resin yang diberi muatan positif atau negatif yang akan berinteraksi secara
ionik dengan molekul sampel yang bermuatan. Ada dua jenis fase diam, yaitu fase diam
kationik dan fase diam anionik. Terjadi persaingan antara ion fase gerak dengan ion sampel
untuk berikatan dengan bagian ion resin. Perbedaan kekuatan interaksi diantara ion sampel
dengan fase diam resina inilah komponen dapat dipisahkan. Mekanisme pemisahan secara
afinitas terjadi bilamana interaksi yang sangat spesifik antara molekul sampel dengan
molekul yang terikat secara kovalen (immobilized) pada fase diam. Interaksi spesifik
dicontohkan seperti reaksi antigen dan antibodi, mana kala antigen diikatkan secara kovalen
pada fase diam. Contoh lain terjadinya ikatan hidrogen antara molekul sampel dengan
geometri tertentu dengan fase diam yang dimanipulasi bentuk molekulnya sehingga hanya
dapat membuat ikatan hidrogen ditempat tertentu tadi.
1. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
KLT dilakukan pada plat terbuat dari gelas atau aluminium atau plastik yang diatasnya
diratakan selapis tipis fase diam. Pada fase diam ini ditotolkan sampel yang kemudian

dikembangkan (elusi) menggunakan fase gerak tertentu. Elusi dilakukan di dalam bejana
gelas dan selanjutnya bercak diamati (visualisasi).
Fase diam
Sesuai dengan namanya, fase diam selama proses pemisahan harus tetap ditempat,
oleh karena disebut stationary phase. Fase diam yang umum digunakan pada KLT adalah
Silika gel, dalam perdagangan silika gel dijual dengan bermacam spesifikasi. Pilihan fase
diam berikutnya setelah silika gel, adalah alumina. Seperti halnya silika gel, alumina dikenal
dengan atau tanpa pengikat dan bahan indikator. Fase diam lain adalah selulosa. Selulosa
untuk KLT terdapat dalam bentuk selulosa serat asli (contohnya MN 300) dan selulosa
mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan
senyawa yang bersifat polar.
Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik, dapat digunakan
satu macam pelarut organik saja ataupun campuran dari beberapa pelarut, oleh karena itu
fase gerak kadang-kadang disebut pelarut atau solven. Namun sebutan yang paling tepat
pelarut yang digunakan sebagai fase gerak pada kromatografi adalah eluen (eluent)
Cara-cara elusi
Setelah sampel ditotolkan pada fase diam, plat dimasukkan ke dalam bejana yang
berisi fase gerak. Fase gerak akan merambat naik menelusuri fase diam. Ada beberapa cara
pengembangan: secara ascendent, descendent, mendatar, pengembangan berulang, dua
dimensi, dan sirkular.
Pengamatan (mendeteksi) bercak / visualisasi
Untuk keperluan analisis maka bercak pada plat perlu ditentukan letak, bentuk dan
warnanya. Cara mengamati bercak pada KLT dapat dilakukan dengan melihat secara
langsung bercak dan cara tidak langsung. Cara tidak langsung dapat digolongkan menjadi dua
: pertama dengan mereaksikan komponen sampel /senyawa yang ada di bercak itu dengan
pereaksi semprot. Diberikan beberapa contoh pereaksi semprot dan warna yang terjadi dari
beberapa golongan senyawa.

Kedua memberikan perlakuan tetapi tanpa merusakkan

senyawa komponen sampel, yaitu menyinari dengan lampu ultraviolet.

Analisis Kualitatif

Pada analisis kualitatif diperlukan senyawa murni pembanding. Sampel dielusi pada
sistem yang sama dengan senyawa pembanding, bila sampel dan senyawa pembanding selalu
memberikan bercak dengan nilai Rf yang sama pada walaupun sistem yang berbeda, maka
senyawa sampel identik dengan senyawa pembanding. Dipelajari hubungan struktur molekul
senyawa dengan polaritas, sehingga dapat diprediksi Rf suatau senyawa.
Analisis Kuantitatif
Berdasarkan adanya hubungan antara luas bercak dengan berat senyawa yang
terkandung pada bercak, maka senyawa di dalam sampel dapat diukur kadarnya dengan
membuat persamaan regresi senyawa baku pembanding.
KLT preparatif
Untuk mendapatkan bobot sampel yang cukup untuk pemeriksaan selanjutnya,
digunakan KLT preparatif. Pada dasarnya sama antara KLT analitik dan KLT preparafif.
Hanya fase diam pada KLT preparatif lebih tebal dari fase diam pada KLT analitik, dan
sampel ditotolkan sebagai garis.
Kromatografi Lapisan Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT)
KLTKT adalah KLT menggunakan fase diam berukuran lebih halus dengan ukuran
diameter fase diam berdistribusi sempit (5-10m). KLT ini memberikan harga (N) yang
tinggi, lebih efisien.
Bioautografi
Diberikan contoh kepada mahasiswa suatu teknik KLT yang diaplikasikan untuk
memisahkan senyawa dari campurannya yang kemudian diikuti secara langsung uji bioaktif
pada plat hasil elusi. Menggunakan teknik ini dapat diketahui bercak yang biologis aktif, oleh
karena itu teknik ini disebut bioautografi.

2. KROMATOGRAFI KERTAS
Pada hakekatnya kromatografi kertas adalah KLT yang menggunakan kertas.
Kromatografi kertas sebenarnya adalah kromatografi planar, bila digunakan campuran fase
gerak yang mengandung air, maka air akan terserap kertas menjadi lapisan tipis dipermukaan
selulose. Air berfungsi sebagai fase diam dan selulose berfungsi sebagai pendukung,
sedangkan cairan lain berfungsi sebagai fase gerak, oleh karena itu dapat digolongkan

kromatografi cairan-cairan dan mekanisme pemisahannya adalah partisi. Kertas yang

digunakan biasanya kertas saring Whatman No.1. Metoda ini sesuai untuk memisahkan
senyawa yang polar misalnya senyawa-senyawa biologi, namun senyawa ksantin dapat
dipisahkan dengan baik menggunakan kromatografi kertas. Mahasiswa dapat mempelajari
hubungan struktur dan nilai Rf dari senyawa turunan ksantin, menjelaskan terjadinya transisi
keto-enol. Visualisasi pada kromatografi kertas sama dengan visualisasi pada KLT, hanya
penggunaan pereaksi semprot yang mengandung asam kuat tidak dapat digunakan pada
kromatografi kertas.

3.

KROMATOGRAFI KOLOM
Bila kromatografi kertas dikelompokkan sebagai kromatografi planar, karena fase

diam nampak planar, maka pada kromatografi kolom, fase diam diletakkan didalam tabung
silindris, kolom. Umumnya digunakan fase diam silika gel, dengan ukuran partikel lebih
besar dari ukuran partikel silika gel untuk KLT, ukuran yang digunakan antara 63-250m.
Bila ukuran partikel lebih kecil 63 m maka fase gerak akan mengalir lebih lambat,
sehingga perlu ditekan atau hisap untuk mempercepat laju alir. Fase diam lain adalah
alumina, selulose, dan sephadex.
Membuat kolom (packing column)
Teknik preparasi kolom dibedakan menjadi dua yaitu cara basah dan cara kering. Teknik cara
basah lebih disukai karena dapat dihindari adanya gelembung udara yang terjebak di dalam
kolom. Membuat kolom secara basah adalah sbb, fase diam yang digunakan dibuat suspensi
dengan fase geraknya, kemudian dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit ke dalam
kolom yang sudah berisi fase gerak. Fase diam akan turun perlahan (gravitasi) mengisi
kolom, sersusun teratur homogen. Sedangkan teknik cara kering adalah meletakkan fase diam
kering ke dalam kolom, bila perlu secara mekanik fase diam yang berada di kolom ditekan
dengan alat supaya lebih mampat.
Elusi (pengembangan)
Fase gerak yang digunakan sama seperti kromatografi lainnya (KLT, Kromatografi kertas),
dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit demi sedikit atau dialirkan dari
bejana yang diletakkan diatas kolom. Fase gerak mengalir menelusuri kolom dengan
sendirinya (gravitasi) atau dengan bantuan tekanan. Dibedakan dua jenis cara elusi yaitu
pertama : Elusi secara isokratik, adalah selama proses elusi menggunakan fase gerak dengan

polaritas tetap. Kedua elusi secara gradien disebut juga solvent programming yaitu selama
proses elusi polaritas fase gerak berubah-ubah. Fase gerak yang masuk ke dalam kolom
seperti kromatografi yang lain disebut eluen, sedang yang keluar dari kolom disebut eluat
atau efluen, Eluat dengan volume tertentu ditampung ke dalam wadah, disebut fraksi.
Mendeteksi komponen yang dipisahkan
Kromatografi kolom yang konvensional tidak dilengkapi detektor, namun sekarang dapat
digunakan dengan mengalirkan eluate(efluen) pada detektor untuk mendeteksi komponen.
Umumnya digunakan dan mudah dikerjakan adalah dengan memonitor fraksi menggunakan
KLT. Fraksi yang mempunyai profil bercak KLT yang mirip digabungkan. Selanjutnya
gabungan fraksi ini dapat dilakukan kromatografi kolom lagi, demikian seterusnya hingga
diperoleh senya wa tunggal (murni).
Bioactive guided isolation
Bilamana pada kegiatan fraksinasi bertingkat diatas, dilakukan pemeriksaan aktivitas biologi
terhadap setiap hasil fraksinasi, kemudian kepada hasil fraksinasi yang mempunyai aktivitas
terkuat dilakukan fraksinasi dan seterusnya dilakukan pemeriksaan aktivitas biologi maka
kegiatan itu disebut Bioactive guided isolation.

4. KROMATOGRAFI GAS (KG)

[Pengampu : Ibnu Gholib Gandjar, 3 kali Pertemuan]
Pendahuluan
Kromatografi gas (KG) merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan dan
deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-senyawa gas
anorganik dalam suatu campuran. KG merupakan teknik instrumental yang dikenalkan
pertama kali pada tahun 1950-an, dan saat ini merupakan alat utama yang digunakan oleh
laboratorium untuk melakukan analisis. Perkembangan teknologi yang signifikan dalam
bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah
serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi yang
meningkat.
KG merupakan teknik analisis yang telah digunakan dalam bidang-bidang: industri,
lingkungan, farmasi, minyak, kimia, klinik, forensik, makanan, dll.
Kegunaan umum KG adalah untuk: melakukan pemisahan dinamis dan identifikasi
semua jenis senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan juga untuk melakukan

analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa dalam suatu campuran. KG dapat bersifat destruktif
dan dapat bersifat non-destruktif tergantung pada detektor yang digunakan.
KG dapat diotomatisasi untuk analisis sampel-sampel padat, cair, dan gas. Sampel
padat dapat diekstraksi atau dilarutkan dalam suatu pelarut sehingga dapat diinjeksikan ke
dalam sistem KG; demikian juga sampel gas dapat langsung diambil dengan penyuntik
(syringe) yang ketat terhadap gas.
Prinsip Kromatografi Gas
KG merupakan teknik pemisahan yang mana solut-solut yang mudah menguap (dan
stabil terhadap panas) bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam dengan suatu
kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya. Pada umumnya solut akan terelusi
berdasarkan pada peningkatan titik didihnya, kecuali jika ada interaksi khusus antara solut
dengan fase diam. Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase
diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu
menghantarkannya ke detektor. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 503500C) bertujuan untuk menjamin bahwa solut akan menguap dan karenanya akan cepat
terelusi.
Ada 2 jenis kromatografi gas:
1. Kromatografi gascair (KGC)
Pada KGC ini, fase diam yang digunakan adalah cairan yang diikatkan pada suatu
pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam sehingga mekanisme sorpsi-nya
adalah partisi.
2. Kromatografi gas-padat (KGP)
Pada KGP ini, digunakan fase diam padatan (kadang-kadang polimerik). Mekanisme
sorpsi-nya adalah adsorpsi permukaan.
Sistem Peralatan KG
Diagram skematik peralatan KG ditunjukkan pada gambar 16.1. dengan komponen
utama adalah: kontrol dan penyedia gas pembawa; ruang suntik sampel; kolom yang
diletakkan dalam oven yang dikontrol secara termostatik; sistem deteksi dan pencatat
(detektor dan recorder); serta komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data.

Gambar. Diagram skematik pada KG.

Fase Gerak pada KG
Fase gerak pada KG juga disebut dengan gas pembawa karena tujuan awalnya adalah
untuk membawa solut ke kolom, karenanya gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas.
Syarat gas pembawa adalah: tidak reaktif; murni/kering karena kalau tidak murni akan
berpengaruh pada detektor; dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (biasanya merah
untuk hidrogen, dan abu-abu untuk nitrogen).
Gas pembawa biasanya mengandung helium, nitrogen, hidrogen, atau campuran argon
dan metana. Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis detektor
yang digunakan.