BAB I

PENDAHULUAN
1. Enzim
Enzim merupakan salah satu jenis substrat biologis yang memiliki fungsi
sangat penting dalam kehidupan manusia. Selain dimanfaatkan sebagai
biokatalisator, enzim juga berperan dalam industri komersial, bidang pangan,
medis, dan farmakologi. Untuk mendapatkan suatu produk yang maksimal,
maka dalam reaksi biologis digunakan enzim. Hal tersebut dikarenakan enzim
dapat mempermudah proses pembuatan produk. Enzim yang digunakan
sebaiknya memiliki tingkat kemurnian yang tinggi. Akan tetapi, memperoleh
enzim dengan kemurnian yang tinggi tidak mudah karena dibutuhkan biaya
serta proses yang cukup besar.

2. Teknik Pemurnian
Pemurnian
Pemurnian

merupakan

enzim

dapat

tahap

yang

dilakukan

penting

dengan

setelah

beberapa

enzim
cara

diisolasi.

antara

lain

kromatografi, elektroforesis, dan imunokimia. Teknik kromatografi merupakan

teknik pemisahan berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak
dan fase diam untuk memisahkan komponen berupa molekul yang berada
pada larutan. Teknik elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau
molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik. Sedangkan imunokia adalah ilmu yang mempelajari dasar-dasar
kimia berbagai senyawa maupun proses yang berperan dalam reaksi
kekebalan baik in vivo maupun in vitro.

BAB II
PEMBAHASAN
1. KROMATOGRAFI
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen
berupa molekul yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase
gerak akan melewati kolom (fase diam). Molekul yang memiliki ikatan kuat
dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah. Setelah komponen terelusi dari kolom, dilanjutkan dengan
analisis menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih
lanjut.

Berdasarkan

bahan

dan

peralatan

yang

digunakan,

kromatografi

dibedakan menjadi 4 jenis yaitu:

1.1 Kromatografi Kertas (Paper Chromatography)

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan

distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak.
Kromatografi ini dapat digunakan untuk memisahkan suatu campuran dengan
metode analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti
kolom. Jenis kromatografi ini merupakan salah satu pengembangan dari
kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa
diam. Dalam kromatografi kertas, fasa diam juga didukung oleh suatu zat padat
berupa bubuk selulosa. Molekul H 2O yang ada nantinya akan terabsorpsi oleh
bubuk selulosa. Kertas sebagai fasa diam dapat berupa campuran pelarut yang
akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang kolom kapiler.
Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara
membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time
retention

(tR)

atau

volume

retention

(VR).

Harga

Rf

zat

baku

dapat

diidentifikasikan dari jumlah komponen campuran karena harga besaran ini

bersifat khas untuk setiap zat, asal digunakan jenis pengembang yang sama.
Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang
memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara
kromatografi kertas dua dimensi dimana letak kertas diubah sehingga arah
pemisahan juga berubah. Secara umum, kromatografi kertas dilakukan dengan
meneteskan larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1 cm
dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah
kertas dicelupkan dalam larutan pengambang (developing solution). Sistem ini
2

menyebabkan larutan terserap dan merambat di sepanjang

kertas sebagai

akibat dari adanya gaya kapiler.

Penutu
p

Kerta
s

Pelarut
tampak
depan
Pelarut

Gambar 1. Kromatografi Kertas

1.2Kromatografi Lapis Tipis

Pada dasarnya, prinsip kerja kromatografi lapis tipis sama hanya saja ia

mempunyai kelebihan yang khas jika dibandingkan dengan kromatografi kertas

yaitu keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. Kromatografi ini dapat
dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dapat digunakan sebagai metode untuk
mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, ataupun preparatif. Kedua, dipakai untuk
memprediksi sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan digunakan pada
kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi. Analisis kromatografi
lapis tipis dapat digunakan dalam menentukan pelarut terbaik yang akan dipakai
dan berapa perbandingan pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak pada
kolom. Hal tersebut akan saling berkaitan karena fasa-fasa senyawa yang
digunakan dalam teknik keduanya sama. Alumina dan silika gel merupakan fasa
diam yang biasa digunakan, sedangkan fasa geraknya menggunakan eluen yang
sama. Walaupun demikian, tetap terdapat perbedaan antara kromatografi lapis
tipis dengan kromatografi kolom. Fasa gerak (cair) di dalam kromatografi kolom
bergerak turun, sedangkan dalam kromatografi lapis tipis akan bergerak naik.
Bahan fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom digantikan dengan
suatu lapisan tipis (tebalnya 100 m), yang merata pada seluruh bagian
permukaannya. Bahan-bahan dari gelas atau lembaran plastik dapat digunakan
sebagai bahan pendukung fasa diam.
Kromatografi lapis tipis mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya waktu
yang dibutuhkan tidak lama (2 5 menit) dan sampel yang dipakai hanya sedikit
(2 20 g). Kerugian yang terjadi akibat penggunaan kromatografi ini adalah
ketidakefektifan yang terjadi di skala industri. Walaupun lembaran yang

digunakan lebih lebar dan tebal, pemisahannya sering dibatasi hanya sampai
beberapa milligram saja.
Cara kerja dari kromatografi lapis tipis adalah yang pertama larutan sampel
ditotolkan pada plat dengan pipet mikro atau injektor pada jarak 12 cm dari
batas plat. Setelah kering, plat siap untuk dikembangkan dengan fasa gerak
sampai pada batas tertentu. Proses pengembangan dikerjakan dalam wadah
tertutup yang diisi eluen dan telah dijenuhi uap eluen agar dihasilkan pemisahan
yang baik. Langkah selanjutnya yaitu mengeringkan sisa eluen dalam plat,
kemudian dilakukan identifikasi dengan beberapa cara, yaitu

pengamatan

langsung (untuk noda/bercak yang tampak), dengan lampu ultraviolet, dan

menggunakan pereaksi semprot penimbul warna. Dalam penelitian ini, pereaksi
yang digunakan adalah Dragendorff.

Ruang
TLC
Plat TLC
Bercak baris

Fase gerak

Gambar 2. Kromatografi Lapis Tipis

1.3 Kromatografi Cair
Teknik kromatografi cair dibagi menjadi 4, yaitu :
1.3.1 Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan metode pemisahan berdasarkan
muatan molekul di bawah kondisi pH dan kekuatan ion tertentu. Interaksi
elektrostatik dari berbagai jenis ligan bermuatan pada matriks dengan
gugus

yang

dapat

berionisasi

pada

protein.

Hal

tersebut

akan

menimbulkan mekanisme pemisahan. Penukar anion yang bermuatan

positif dipilih untuk mengikat molekul asam, sedangkan penukar kation
yang

bermuatan

negatif

memberikan

mekanisme

pemisahan

untuk

molekul bersifat basa. Karena enzim memiliki aktivitas, maka sebelum

dilakukan pemisahan dengan metode tersebut terlebih dahulu diketahui pH
optimum enzim, sehingga aktivitas enzim tetap dapat dipertahankan.
Muatan

positif

dan

negatif

pada

protein

disebabkan

oleh

rantai

penyusunnya. Muatan positif disumbangkan oleh asam amino histidin,

lisin, arginin dan gugus amino dari N-terminal, sedangkan muatan negatif
4

disumbangkan oleh aspartat, glutamat dan gugus karboksil pada Cterminal.

Tingkat keasaman protein atau enzim dengan jumlah muatan positif
dan negatif sama dikenal sebagai pH isoelektrik atau titik isoelektrik (pl).
Pada umumnya protein memiliki nilai pH sekitar 5,0-9,0. Protein yang
memiliki pH di atas nilai pl akan bermuatan negatif, sedangkan pH
dibawah nilai pl akan bermuatan positif.

Kromatografi Penukar Ion

Sampel
pada
kolom

Protein Bermuatan
Negatif
Protein bermuatan
positif
Pengumpulan
protein muatan
positif

Butiran gel bermuatan positif

Gambar 3. Prinsip Kerja Kromatografi Penukar Ion

Prinsip kromatografi penukar ion adalah digunakannya matriks yang

mengikat secara kovalen gugus fungsi bermuatan negatif pada penukar
kation, atau gugus fungsi yang bermuatan positif pada penukar anion
seperti yang terlihat pada gambar 3. Matriks berupa polimer elastis yang
mengandung senyawa resin sintetik dan terbuat dari bahan dekstran
(selulosa

atau

sefadeks).

Contoh

matriks

penukar

kation

yaitu

karboksimetil selulosa (CMC) dan matriks penukar kation yaitu dietil

aminoetil (DEAE)-selulosa dan DEAE-sefadeks.
1.3.2 Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro
molekul biologi lain berdasarkan ukurannya, jadi kerjanya hampir mirip
sebagai suatu penyaring. Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu
dekstran (polimer gula yang larut dalam air) yang mengalami reaksi ikatan
silang (cross linkage) sehingga dekstran menjadi tidak larut dalam air tetapi
masih dapat menyerap air dalam molekulnya. Daya serap matriks
bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi di dalamnya. Matriks
atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks, Gel atau matriks ini
berpori dan dikemas di dalam kolom serta di elusi dengan fase cair. Molekul
5

yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih
lambat, sedangkan molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat
karena

tidak

tertahan

di

dalam

pori

matriks.

Dengan

demikian

kromatogram molekul-molekul yang lebih besar akan muncul sebagai

komponen awal seperti terlihat pada gambar.

Butira
n gel

Jumlah
yang
terlaru
t

Matriks
gel

Molekul
kecil

Butiran
gel

Volume effluent

Moleku
l besar

Gambar 4. Prinsip Kerja Kromatografi Filtrasi Gel

1.3.3 Kromatografi Interaksi Hidrofobik
Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan
berdasarkan perbedaan hidrofobisitas pada permukaan protein. Pada
kondisi kekuatan ion yang tinggi, protein atau enzim akan terikat kuat pada
matriks melalui interaksi hidrofobik. Matriks yang umum digunakan
bersifat nonpolar dan dapat berupa turunan jenis sefarosa yaitu fenil
sefarosa atau butil sefarosa.
mengikat

mencuci

elusi

Gambar 5. Prinsip Kerja Kromatografi Interaksi Hidrofobik

Suatu campuran protein dimasukkan ke kolom interaksi hidrofobik

dalam kondisi ionik yang tinggi. Pada kekuatan ion yang tinggi, protein
terikat kuat pada matriks melalui interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik
suatu protein, maka semakin kuat ikatannya. Protein yang terikat pada
matriks dapat terlepas jika di elusi dengan eluen yang kekuatan ionnya
semakin menurun yaitu dengan konsentrasi garam dari tinggi ke yang
lebih rendah.
1.3.4 Kromatografi Afinitas
Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan
reseptor. Jadi, dalam kromatografi ini harus ada dua senyawa yang
berikatan

spesifik.

Tujuan

dari

kromatografi

afinitas

adalah

untuk

memisahkan suatu molekul tertentu dari keseluruhan molekul dalam

campuran.

Pemurnian

dengan

teknik

kromatografi

afinitas

disebut

pemurnian satu tahap (one step purification). Dalam proses pemurnian

satu tahap diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan
suatu ligan. Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus molekul
yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi terkait dengan
muatan dan sterik pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi
antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks. Skema paling unum untuk
melakukan kromatografi afinitas adalah melalui tahap elusi gradien. Skema
tersebut melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom disertai adanya fase
gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solutligan. Pelarut ini, menggambarkan fase gerak lemah pada kolom yang
disebut dengan bufer aplikasi. Selama proses pemisahan, senyawa yang
komplemen dengan ligan akan berikatan karena sampel melalui kolom
dengan

bufer

aplikasi.

Selektifitas

interaksi

solut-Iigan

yang

tinggi

menyebabkan sampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa
tertahan, Solut yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut
yang mampu memecah kompleks ligan-solut. Pelarut ini merupakan fase
gerak yang kuat dan seringkali dikenal sebagai buffer elusi.
Buffer pengelusi ini dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat,
sehingga protein lepas dan akan keluar bersamaan dengan eluen.
Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi protein hasil pemurnian
tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk
memutuskan ikatan antara ligan dengan protein, maka akan terjadi tailing,
7

yaitu puncak yang melebar. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi
lebarnya. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak
serapan sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak.
Kromatografi Afinitas
Antibodi antix
terikat pada butiran
tidak terlarut

Tambahkan solute
dengan campuran
antigen

Melepaskan antigens
(unbound antigens)

Antigen elut X

Antigen X murni

Gambar 6. Prinsip Kerja Kromatografi Anfinitas

1.4Kromatografi Gas

Kromatografi gas adalah suatu metode yang didasarkan pada pemisahan

fisik zat organik dan anorganik yang stabil pada pemanasan dan mudah
diatsirikan. Kromatografi gas sebagai instrument untuk analisis fisika kimia
menduduki posisi yang sangat penting dan banyak dipakai, hal ini disebabkan
oleh :
1. Aliran fase gerak (gas) sangat terkontrol dan kecepatannya tetap
2. Sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel ke dalam aliran fase
gerak
3. Pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya banyak sekali,
panjang dan suhunya dapat diatur
4. Banyak detektor yang dapat dipakai
5. Mudah digabung dengan instrumen
Pada kromatografi gas, sampel diuapkan di dalam gerbang suntik
(injection port) yang selanjutnya mengalami pemisahan fisik pada kolom
setelah dielusi dengan fase gerak (gas pembawa) yang inert (lembam). Ada
dua metode kromatografi gas, yaitu:
1.4.1

Kromatografi Gas Padat (KGP)

Fase diam pada kromatografi ini adalah butiran-butiran adsorben padat

dan fase geraknya adalah gas. Mekanisme pemisahan komponen sampel

adalah dengan prinsip perbedaan fisik adsorpsi oleh fase diam. Ada
beberapa kelemahan kromatografi ini adalah adsorpsi fase diam terhadap
komponen-komponen sampel bersifat semipermanen terutama terhadap
molekul yang aktif atau molekul yang polar dan efektivitas pemisahan
komponen sangat dipengaruhi oleh bobot molekul. Disamping itu, sering
kali memberikan bentuk grafik berekor dari kromatogram. Kromatografi
8

ini lebih efektif untuk pemisahan komponen dengan massa relative (Mr)
rendah.
1.4.2

Kromatografi Gas Cair (KGC)

Pertama kali dikemukakan oleh Martin dan Synge. Fase diam pada

kromatografi ini adalah cairan tipis pada permukaan butiran padat

sebagai pendukung, sedangkan fase geraknya adalah gas yang lembam.
Mekanisme pemisahannya adalah perbedaaan partisi komponen sample
diantara fase diam dan fase geraknya.

Terminal
injeksi

Perekam

Gas

Gambar 7. Kromatografi Gas

2. ELEKTROFORESIS
Elektroforesis

adalah

suatu

teknik

pemisahan

yang

didasarkan

pada

pergerakan molekul dengan kemampuan berpindah melalui medium konduktif,

biasanya berupa larutan bufer atau pada suatu medium penyangga yang telah
berisi protein plasma. Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Pemisahan
dilakukakan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik
yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Secara teknis, elektroforesis
merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat
diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Pergerakan ini dapat
dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris
bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Gaya lorentz = qE
F= gaya Lorentz
q= muatan yang dibawa oleh objek
E= adalah medan listrik
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,
dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung pada
muatan yang ada di permukaan partikel. Tanda dan besarnya muatan pembawa
oleh variasi group ionogenik tergantung pada kekuatan molekul listrik dan pH

dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi

karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

2.1 Prinsip Kerja Elektroforesis

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen
bermuatan

positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan

negatif

pada

(-)

"elektrokinetik".

kutub
Hasil

positif
yang

(+).

Pegerakan

didapatkan

dari

yang

terjadi

disebut

elektroforesis

adalah

elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat

perpindahan komponen atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran yang
digunakan sama dengan pada proses kromatografi.
Komponen yang bermuatan positif akan bergerak searah dengan medan
listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam campuran terdapat dua jenis
komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2) komponen netral (N), maka
komponen negatif akan bergerak menuju kutub

positif (+) sedangkan

komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis secara
sederhana dapat dilihat pada gambar yang ada di bawah. Dapat dilihat
komponen yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub negatif,
sedangkan komponen bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub positif.

2.2 Teknik Elektroforesis

Umumnya

teknik

dari

cikal-

bakal

elektroforesis

digunakan

untuk

menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis

10

ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik.
Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik
(Rouessac 2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan
menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan
terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002). Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya
DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan
melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub
yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada
nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait
dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan.
Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada
permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group
ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium
dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek
seleksi dan medium yang sesuai.

2.3 Jenis Elektroforesis

Jenis - jenis elektroforesis di bagi menjadi 3 :
1. Elektroforesis kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan
yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorpsivitas zat terlarut.

11

Dua plat

elektrolit

Garis pensil

Filter kertas

Sesuai dengan perkembangan ilmu bahan, elektroforesis kertas menjadi

fasa pertama dari perkembangan elektroforesis zona. Dengan menggunakan
medium kertas,

pemisahan dan analisis terhadap asam amino, peptida,

nukleotida, dan ion-ion logam yang kecil dapat dilakukan. Kelemahan

penggunaan kertas selulosa asetat adalah: adanya gangguan yang disebabkan
oleh adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi
dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan
menjadi lebih rendah (Harjadi 1993). Kelemahan ini dapat diatasi dengan cara
asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang
tidak polar. Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu,
resolusi lebih baik, dan

proses pemisahan berlangsung lebih cepat.

Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah:

1.
2.
3.
4.

proses migrasi lebih cepat

pemisahan spot menjadi lebih kecil
mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri
mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit. Pada elektroforesis
kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan dengan
cara kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan
spotnya lebih kecil daripada cara basah.

2. Elektroforesis gel
Elektroforesis gel adalah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan
dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul
yang

lebih

besar

seperti

protein-protein.

Kemudian

elektroforesis

gel

berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel

media. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase
diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang
12

akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan
dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk
menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif
diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel. Zat yang akan
dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif.
Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan
bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif.
Berikut adalah bentuk macam-macam elektroforesis gel teenage, yaitu:
a. Elektroforesis gel poliakrilamida
Elektroforesis gel poliakrilamida sodium dodesil sulfat digunakan secara luas
untuk menganalisis protein karena memiliki pemisahan yang lebih baik di
banding dengan kertas selulosa asetat. Medium penyangga yang digunakan
adalah hasil polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida, dengan Natalia
ammonium

perulfat

(APS)

dan

tetrametilendiamin

(TEMED).

Pemisahan

molekular didasarkan pada perbedaan berat molekul. Selain itu, makin rendah
konsentrasi akrilamida yang digunakan semakin besar ukuran pori gel, serta
gel akan bersifat lunak dan mudah rapuh.
b. Elektroforesis gel agarosa
Gel agarose dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari
100 bp, sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukuran lebih pendek dapat
digunakan gel poliakrilamid (Wilson dan John, 1994). Gel agarose merupakan
fase diam dalam pemisahan fragmen DNA, konsentrasi agarose yang
digunakan dalam pemisahan fragmen DNA sangat mempengaruhi mobilitas
fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang digunakan maka
semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka
semakin besar pori-pori gel.
3. Elektroforesis kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai
digunakan secara luas pada akhir tahun 1940 untuk aplikasi dalam berbagai
bidang

seperti

Elektroforesis

bioteknologi,
kapiler

kimia,

menggunakan

lingkungan,
listrik

dan

analisis

bertegangan

farmasi.

tinggi

yang

menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda.

Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau
elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien
difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode
13

ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros listrik karena
menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal. Elektroforesis kapiler
(CE), juga dikenal sebagai zona elektroforesis kapiler, dapat digunakan untuk
memisahkan spesies ion oleh muatan mereka dan gesekan kekuatan dan
radius hidrodinamika. Elektroforesis , bermuatan listrik bergerak analit dalam
konduktif

cairan

Diperkenalkan

menengah

pada

tahun

bawah
1960-an,

pengaruh
teknik

suatu

medan

elektroforesis

listrik

kapiler

(CE)

dirancang untuk spesies terpisah berdasarkan ukuran mereka untuk mengisi

rasio dalam interior sebuah kapiler kecil penuh dengan elektrolit.

2.4 Medium Pendukung

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan. Gel

poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung

yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek
penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di
medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan
sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun
medium

pendukung

menyebabkan
penyaringan

relatif

penyerapan,
berdasarkan

stabil

(inert),

komposisinya

migrasi

elektron

(elektro

ukuran

molekulnya,

yang

mungkin

akan

osmosis)

atau

kesemuanya

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa :

1. Selulosa asetat
2. Larutan Buffer
Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer
juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal,
yaitu :
a. larutan Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan
mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan
karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik
dengan karbohidrat.
b. Konsentrasi Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang
terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga
memperlambat

geraknya.

Kekuatan

ion

tinggi

dalam

buffer

akan

meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya

dipilih 0,05 -0,10M.

14

c. pH Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH

bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat
kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi
pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa.
3. Medan elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh
tahanan dalam medium:
a. Voltage
Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial
antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m.
Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
b. Aliran listrik
Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya
oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan
jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang
ditempuh

ion

akan

sebanding

dengan

waktunya.

c.tahanan

Medium

elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium,

jenis

buffer

dan

bertambahnya

konsentrasinya.

jarak

antara

Tahanan

elektroda,

akan

namun

meningkat

dengan

berkurang

dengan

bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

3. IMUNOKIMIA
Imunokimia adalah suatu ilmu yang mempelajari sistem imun atau kekebalan
tubuh pada makhluk hidup yang berhubungan dengan reaksi kimia dalam tubuh
makhluk hidup itu sendiri. Peran Imunokimia :
1. Antibodi adalah imunoglobulin, suatu glikoprotein. dalam biokimia, gena
adalah DNA, suatu polinukleotida.
2.

Interaksi

antigen

antibodi

merupakan

interaksi

kimiawi

yang

dapat

dianalogikan dengan interaksi enzim dengan substratnya. Spesifitas kerja

antibodi mirip dengan enzim.
3. Pemberian transfusi darah yang tidak sesuai akan menimbulkan hemolisis dan
koagulasi.

3.1 Tiga Jajaran Utama Pertahanan Tubuh

1. Kulit dan berbagai epitel pelapis alat tubuh, berfungsi sebagai pelindung
terhadap kontak dengan lingkungan.

15

2. Mekanisme non spesifik pada tiap inang, yaitu untuk mengatasi

mikroorganisme patogen seperti pelepesan sel, pengaturan pH, bersin,
dsb.
3. Sistem kekebalan tubuh itu sendiri.

3.2 Penolakan Bahan Asing/Antigen

Antigen yang masuk akan ditolak oleh tubuh melalui 2 cara, yaitu:
1. Dengan membuat suatu protein khusus (antibodi) yang akan melekat
pada bahan asing (antigen), tanggapan ini disebut Respon Kekebalan
Humoral.
2. Dengan peran sel limfosit khusus, yaitu sel T. Limfosit yang punya
kemampuan untuk mengikat antigen dan akan dimusnahkan, tanggapan
ini disebut Respon Kekebalan Selular.
Perbedaan masing-masing molekul antibodi terutama ditentukan oleh urutan
asam amino yang menyusun bagian dan memiliki fungsi mengikat antigen.

3.3 Klasifikasi Imunoglobulin ( IG )

Imunoglobulin

adalah

sekelompok

protein

yang

berperan

dalam

menghantarkan tanggapan kekebalan pada organisme tingkat tinggi.

1.Imunoglobulin G
IGG mempunyai struktur dasar imunoglobulin yang terdiri dari 2 rantai berat h
dan 2 rantai ringan L. IGG manusia mempunyai koefisien sedimentasi 7 s
dengan berat molekul sekitar 150.000. Pada orang normal, jumlah igg adalah
75% dari seluruh jumlah imunoglobulin. Imunoglobulin g terdiri dari 4 subkelas,
masing-masing

mempunyai

perbedaan

yang

tidak

banyak,

dengan

perbandingan jumlahnya sebagai berikut: igg1 40-70%, igg2 4-20%, igg3 48%, dan igg4 2-6%. Masa paruh igg adalah 3 minggu. IGG merupakan antibodi
dominan pada respon sekunder dan menyusun pertahanan yang penting
melawan bakteti dan virus. Ini merupakan satu-satunya antibodi yang mampu
melintasi plasenta, oleh karena itu merupakan imunoglobulin yang paling
banyak ditemukan pada bayi yang baru lahir. IGG lebih mudah menyebar ke
dalam celah-celah ekstravaskuler dan mempunyai peranan utama menetralisis
toksin kuman dan melekat pada kuman sebagai persiapan fagosistosis.
2. Imunoglobulin m
IGM umumnya mengindikasikan adanya infeksi baru. IGM berfungsi sebagai
reseptor permukaan sel beta untuk tempat pelekatan antigen dan disekresikan
dalam tahap-tahap awal respons sel plasma. Igm sangat efisien untuk reaksi
aglutinasi dan reaksi sitolitik, karena timbulnya cepat setelah infeksi dan tetap
tinggal dalam darah maka igm merupakan daya tahan tubuh penting pada
bakterimia.

Imunoglobulin

merupakan

10%

dari

seluruh

jumlah
16

imunoglobulin, dengan koefisien sedimen 19 s dan berat molekul 850.000l.000.000. 12% dari beratnya adalah karbohidrat. Antibodi igm adalah antibodi
yang pertama kali timbul pada respon imun terhadap antigen dan antibodi
yang utama pada golongan darah secara alami. Gabungan antigen dengan
satu molekul igm cukup untuk memulai reaksi kaskade komplemen.
3. Imunoglobulin a (iga)
IGA adalah imunoglobulin utama dalam sekresi selektif, misalnya pada susu,
air liur, air mata dan dalam sekresi pernapasan, saluran genital serta saluran
pencernaan atau usus (corpo antibodies). Imunoglobulin ini melindungi selaput
mukosa dari serangan bakteri dan virus. IGA dihasilkan paling banyak dalam
bentuk dimer yang tahan terhadap proteolisis berkat kombinasi dengan suatu
zat

protein

khusus,

disebut

secretory

component,

oleh

sel-sel

dalam

membrane mukosa. Fungsi utama iga adalah untuk mencegah perluasan virus
dan bakteri ke permukaan epitel.
4. Imunoglobulin d
Konsentrasi igd dalam serum sangat sedikit (0,03 mg/ml), sangat labil
terhadap pemanasan dan sensitif terhadap proteolisis. Berat molekulnya
adalah 180.000. Rantai mempunyai berat molekul 60.000 70.000 dan l2%
terdiri dari karbohidrat. Fungsi utama igd belum diketahui tetapi merupakan
imunoglobulin permukaan sel limfosit b bersama igm dan diduga berperan
dalam diferensiasi sel ini. Imunoglobulin ini tidak mengaktifkan sistem
komplemen dan tidak dapat menembus plasenta. Igd terutama ditemukan
pada permukaan sel b, yang kemungkinan berfungsi sebagai suatu reseptor
antigen yang diperlukan untuk memulai diferensiasi sel-sel b menjadi plasma
dan sel b memori.
5.

Imunoglobulin e (ige)

Di dalam serum ditemukan dalam konsentrasi sangat rendah. Ige apabila

disuntikkan ke dalam kulit akan terikat pada mast cells dan basofil. Kontak
dengan antigen akan menyebabkan degranulasi dari mast cells dengan
pengeluaran zat amin yang vasoaktif. Ige yang terikat ini berlaku sebagai
reseptor yang merangsang produksinya dan kompleks antigen-antibodi yang
dihasilkan memicu respon alergi anafilaktik melalui pelepasan zat perantara.
Pada orang dengan hipersensitivitas alergi berperantara antibodi, konsentrasi
ige akan meningkat dan dapat muncul pada sekresi luar. Ige serum secara
khas juga meningkat selama infeksi parasit cacing. Dihasilkan pada saat
respon alergi seperti asma dan biduran. Peranan ige belum terlalu jelas. Di
dalam serum, konsentrasinya sangat rendah, tetapi kadarnya akan naik jika
17

terkena infeksi parasit tertentu, terutama yang disebabkan oleh cacing. Ige
berukuran sedikit lebih besar dibandingkan dengan molekul igg.

3.4 Fungsi Imunoglobulin

1. Mengikat antigen, yang dilakuakan lewat perantaraan fragmen fab,
khususnya pada daerah variabel dari rantai h dan L.
2. Dua ciri utama imunoglobulin (ig) adalah specifitiy (kekhususan/ spesifitas)
dan diversity (keanekaragaman). Spesifitas berkaitan dengan kemampuan ig
tertentu untuk berinteraksi dengan antigen tertentu. Karena terdapat antigen
dalam jumlah banyak dan beraneka ragam, diperlukan juga ig dalam jumlah
banyak dan beranekaragam.
3. Fungsi biologis lain yang dilakukan lewat perantaraan fc. Fungsi biologis ini
antara lain adalah pengikatan komplemen, fasilitas fagositosis, fiksasi pada
kulit dan pengangkutan melewati barier plasenta.

DAFTAR PUSTAKA

Arsyita,W.,2013,makalahelektroforesis,http://www.academia.edu/9068128/makala
h_elektroforesis, diakses 30 September 2016.

18

Irma,I.,2013,Teknik Pemurnian Enzim, http://www.academia.edu/8033387/Teknik

Pemurnian Enzim, diakses 18 September 2016.
Iswari,R.S,2006,Biokimia,Graha Ilmu,Yogyakarta, hal 115-119.
Mujizat,A.,

2013,Imunologi,

http://www.academia.edu/11289457/radioimmunoassay,diakses 18 September
2016.
Yulia,I.,2014,elektroforesis1,https://www.scribd.com/mobile/doc/62958679/ELEKTR
OFORESIS-1, diakses 30 September 2016.

19