Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

secara KLT-Densitometri
 Dalam KLT-Densitometri ada 2 parameter yang penting
 By : Achmad Ridlo,S.Si., M.Sc.,
 Parameter Kualitatif dinyatakan sebagai nilai Rf, dan hRf
 Rf sampel = Rf standar
Rf (waktu retensi yang digunakan sampel untuk naik sampai batas atas plat KLT)
hRf = 100 kali dari Rf (hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h),
menghasilkan nilai berjangka 0 – 100)
 Parameter Kuantitatif dinyatakan sebagai nilai AUC (Area Under Curve)
 Semakin besar nilai AUC, semakin besar konsentrasi suatu senyawa yang teranalisis

 Luas area (y)

 Waktu muncul curva (x)
 Prosedur Pemisahan secara KLT

Pembuata Penotolan Elusi Pembacaa

n fase sampel n hasil KLT
gerak • Aktivasi dahulu • Setelah elusi,
•Ambil volume • Elusi bila
dengan plate silica gel chamber sudah keringkan
perbandingan  caranya? jenuh plate KLT
yang tepat • Totolkan • Jangan pernah • Baca dan
• Campur ad dengan volume membuka Amati hasil
homogen yang tepat chamber kecuali bercak yang
• Penjenuhan fase (kuantitatif) hanya ketika muncul
gerak di chamber • Totolan jangan menaruh dan
sangat penting  terlalu melebar mengambil plate
caranya? KLT
 Parameter Kualitatif KLT
Retention factor (Rf)

b
Bila nilai Rf sampel sama dengan Rf standar
a
maka sampel tersebut positif mengandung senyawa
sebagai standar tersebut
 Contoh perhitungan Rf

 
8 cm
6 cm 6 cm
Area Under Curve (AUC)

HPTLC alatnya
Analisis Kuantitatif
suatu analisis untuk menghitung jumlah kandungan / kadar senyawa pada suatu
sampel

Metode perhitungan
Menggunakan Calibration Curve / Linieritas
hasil pengukuran menggunakan suatu metode analisis yang berupa: abs, luas
area (AUC), atau tinggi puncak menunjukkan proporsionalitas dengan kadar zat
yang dianalisis

Y = variabel terikat
Y = bX + a X = varibel bebas (abs)
B = slope (ppm)
A= intersep (Rf)
 How to quantitative analysis by TLC ?

1. Buatlah seri konsentrasi kurva baku untuk menghitung linieritas

2. Preparasi sampel sesuai dengan metode yang sudah disiapkan
3. Lakukan analisis KLT dengan proses yang tepat dan teliti
a. Penotolan  lakukan dengan menggunakan linomat (presisi dan akurasi tinggi)
b. Elusi  elusi bila chamber sudah jenuh fase gerak
4. Lakukan pembacaan nilai AUC spot yang muncul dengan menggunakan TLC-
Scanner
5. Lakukan perhitungan kadar sampel dari persamaan regresi linier yang didapat
dengan nilai R memenuhi persyaratan.
 8
Linearitas dapat disiapkan dengan cara:

1. Minimum 5 konsentrasi zat standar

(dari pengenceran larutan induk)
atau
2. Minimum 5 konsentrasi zat standar
(dari masing-masing penimbangan zat standar)

ICH Q2R1
 Linearity = Linieritas
Syarat:
Koefisien korelasi [ r ] ≥ 0,999
Mudahkah mendapatkan r ≥ 0,999 ?
Bagaimana seandainya r ≤ 0,999 ?

Nilai r ini dibandingkan dengan nilai r tabel

untuk mengetahui validitas liniearitas.
Apabila lebih besar dari r tabel maka nilai r
cukup valid.

N ; jumlah konsentrasi kurva standar yang

akan dibuat
9
Apakah Linearitas disamping dapat digunakan?
Hasil perhitungan menunjukkan bahwa
persamaan memberikan nilai r 0,98.
Diketahui bahwa r tabel 0,7067 sehingga
persamaan regresi cukup liniear.
(Sugihartini dkk, 2012)
Latihan Perhitungan Kadar
Seorang Analis melakukan uji linieritas dengan kurva baku senyawa X secara KLT-
densitometri seperti dibawah ini :
Konsentrasi
Luas Area
(ppm)
10 3578
20 5128
30 6974
40 8450
50 12265

Buatlah regresi linier dari kurva baku tersebut !

Apakah kurva baku tersebut dapat dikatakan valid untuk digunakan
dalam membantu perhitungan kadar sampel ?
 Latihan
Kemudian, Analis tersebut ingin menghitung kadar senyawa A dengan data berikut :

Replikasi
Luas Area
sampel
1 7840
2 7825
3 7798

Taraf kepercayaan 95%

 Berapa % rata-rata kadar senyawa A bila sampel masing-masing ditimbang 10 mg dilarutkan

dalam 10 ml, kemudian diencerkan 500 µl ad 10 ml?
 Hitung SD, CV ?
• Pertama, hidupkan kalkulator yang anda pegang, yaitu dengan menekan tombol ON di pojok kanan atas.
Untuk mereset data-data yang telah tersimpan sebelumnya, tekan SHIFT » MODE » tekan angka 2 » Prosedur Regresi Linier
tekan tombol = » AC  dengan kalkulator
• Kedua, tekan MODE sebanyak 1 kali, hingga muncul "COMP 1, SD 2, REG 3" pada layar. kemudian (model seperti gambar)
pilih REG (regresi) dengan menekan angka 3
• Ketiga, pada layar akan muncul "Lin 1, Log 2 Exp 3, dst " pilih Lin (linear) dengan menekan angka 1
• Keempat, saat ini anda sudah berada pada mode Regresi Linear. Langkah selanjutnya adalah meng-input
data yang biasanya berbentuk X,Y 
• Kelima, untuk memasukkan angka-angka X,Y kita dapat mengetikkan angka pertama yaitu untuk
variabel X lalu tekan tombol koma (,) letaknya di atas tombol DEL di bawah tombol cos, kemudian kita
masukkan angka kedua yaitu untuk variabel Y
• Keenam, setelah melakukan langkah kelima di atas, kita harus men-save datanya, yaitu dengan menekan
tombol M+, letaknya di atas tombol AC
• Ketujuh, masukkan semua data dengan cara ulangi langkah 5 dan langkah 6
• Kesembilan, jika semua data telah dimasukkan, kita perlu menampilkan hasil data yang telah kita input
dalam bentuk A, B, X rata-rata, korelasi (r), dst, dengan cara menekan tombol SHIFT » tekan tombol 2,
geser panah kekanan sebanyak 2 kali sehingga muncul "A 1, B 2, r 3" pada layar.
• Kesepuluh, nah hasil yang telah kita dapat di kalkulator bisa kita masukkan ke dalam rumus yang telah
tersedia. 
 Hasil kalkulasi menggunakan Microsoft Excel
Regression Statistics
Multiple R 0,97945 R hitung
R Square 0,959322
Adjusted R Square 0,945763
Standard Error 778,0793
Observations 5

Standard Lower Upper Lower Upper

  Coefficients Error t Stat P-value 95% 95% 95,0% 95,0%
Intercept 1070,2 816,0565 1,311429 0,281052 -1526,86 3667,256 -1526,86 3667,256
Konsentrasi (ppm) 206,96 24,60503 8,411289 0,003525 128,6558 285,2642 128,6558 285,2642

Sehingga didapatkan persamaan regresi linier

a b Y = 206,96 x + 1070,2 dengan r = 0,9795
 Grafik regresi linier
14000

12000
f(x) = 206.96 x + 1070.2
10000 R² = 0.96
8000
AUC
AUC

6000 Linear (AUC)

4000

2000

0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Konsentrasi (ppm)

r hitung > r tabel (0, 9795 > 0,878) , sehingga kurva baku yang diperoleh
valid untuk menggambarkan korelasi yang signifikan antara konsentrasi
dengan luas area.
 Konsentrasi
Replikasi sampel Luas Area
ppm mg/ml Kadar % berat sampel 10 mg
1 7840 32,7107 0,03271 65,4213 Vol. sampel 10 ml
2 7825 32,6382 0,03264 65,2764 fp 10 ml /0,5 ml = 20x
3 7798 32,5077 0,03251 65,0155

Kadar % Mean X-mean (X-mean)2 SD CV

(X)
65,42133746 65,2377271 0,18361 0,03371 0,21 0,32
65,27638191 65,2377271 0,03865 0,00149
65,01546193 65,2377271 -0,2223 0,0494
Jumlah 0,08461

Koefisien variasi dinyatakan sebagai CV

 dimana CV semakin kecil semakin baik (variasi kesalahan minimal).
Nilai maksimal CV < 2% (98%), < 5% (95%) fp (factor pengenceran)
Thank You
Ada pertanyaan dipersilahkan ….