LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS INSTRUMENTAL

MODUL III
ANALISIS SAMPEL FENOBARBITAL DENGAN METODE
KLT – DENSITOMETRI

Tanggal Praktikum:
17 Maret 2021
Nama/NIM Asisten :
Arif Al Iman/118260062

Kelompok 4
Nama/NIM Anggota Kelompok:
Aldila Fajar Oktriyanto 119260009
Anastya Devi Septiani 119260075
Fransiska Abella Berliana 119260033
Rahadika Kurnia Shandy 119260152
Vinna Agustiya 119260049

PROGRAM STUDI FARMASI JURUSAN SAINS

INSTITUT TEKNOLOGI SUMATERA
2020/2021
 I. Tujuan Percobaan
a. Mahasiswa mampu menjelaskan uji analisis sampel secara
Kromatografi Lapis Tipis - Densitometri
b. Mahasiswa mampu menerangkan uji analisis sampel secara
Kromatografi Lapis Tipis - Densitometri
c. Mahasiswa mampu mendemonstrasikan uji analisis sampel secara
Kromatografi Lapis Tipis - Densitometri
d. Mahasiswa mampu menganalisis sampel secara Kromatografi Lapis
Tipis - Densitometri

II. Metodologi
Pertama dilakukan standar larutan stok Phenobarbitone, disiapkan dahulu
phenobarbitone dengan melarutkan 10 mg obat dalam 100 ml metanol untuk
mendapatkankonsentrasi 100µg / ml. Lalu dari larutan stok 2, 4, 6, 8 dan 10µl
diaplikasikan pada pelat TLC, pada jarak 10mm sumbu x dan sumbu y. Kemudian
2 ml larutan stok standar Phenobarbitone diencerkan dalam 10 ml methanol untuk
mendapatkan larutan standar kerja 20 µg / ml (100ng / 5µl).
Setelah itu dilakukan solusi stok Phenobarbitone (100μg / ml) dengan
disiapkan dalam metanol. Dibuat larutan berbeda volume stok menjadi 2, 3, 4, 5
dan 6μl, terlihat pada pelat KLT untuk mendapatkan konsentrasi 200,300, 400,
500 dan 600ng / band Phenobarbitone pada masing-masing. Lalu data area antara
puncak dengan obat konsentrasi diperlakukan dengan kuadrat terkecil linier
analisis regresi. Respon untuk obat tersebut ditemukan liniernya dalam kisaran
konsentrasi 200– 600ng / band. Kemudian dibuat kurva kalibrasinya. Dimana
ketepatan metode ini ditunjukkan oleh variasi intra-day dan inter-day studi. Dalam
studi intraday, 3 berbeda konsentrasi 200, 400 dan 600ng / band standar larutan
stok terlihat dalam rangkap tiga dan dianalisis. Setelah itu dihitung presentasi
RSD nya.
Ditentukan akurasinya. Untuk memeriksa keakuratan metode, studi pemulihan
dilakukan dengan over spotting, larutan obat standar ke larutan sampel yang telah
dianalisis sebelumnya, di tiga tingkat yang berbeda 80, 100 dan 120%. Dasar
konsentrasi sampel yang dipilih adalah 300 ng / pita, Obat curah fenobarbiton
yang 240, 300 dan 360 ng / band tablet Phenobarbitone ditambahkan lebih dari
bercak. Area tersebut dicatat setelah pengembangan piring. Lalu Konsentrasi obat
Phenobarbitone dihitung dengan menggunakan persamaan regresi.
Pada Densitogram Fenobarbiton, metanol digunakan sebagai pelarut untuk
preparasi larutan. Fase diam adalah pelat aluminium HPTLC (20 × 10cm) yang
dilapisi sebelumnya silika gel F 254 . diklorometana: etil asetat: glasial, asam
asetat (9,5: 0,5: 0,1 v / v / v / v) digunakan. Standar larutan stok Phenobarbitone
5µl (300ng / band) diaplikasikan pada pelat TLC. Faktor retensi Fenobarbiton
adalah 0,70 ± 0,05.
Dilakukan hidrolisis asam. Untuk 6 ml larutan stok, ditambahkan 1 ml 2,5N
HCl. Volume dibuat hingga 10 mldengan metanol (0,3µg / 5µl). Campuran ini
kemudian disimpanselama 3 jam untuk 30ᵒC. Kemudian 5μl larutan resultan
(300ng / band) diaplikasikan pada pelat KLT bersama denganmasing-masing
kosong di trek yang berdekatan dan densitogram dikembangkan.
Lalu pada hidrolisis alkali, untuk 6 ml larutan stok ditambahkan 1 ml 3N
NaOH. Volume dibuat hingga 10 ml dengan metanol (0,3µg / 5µl). Kemudian 5μl
larutan resultan(300ng / band) diaplikasikan pada pelat KLT bersama dengan
masing-masing kosong di trek yang berdekatan dan densitogram. Lalu campuran
ini kemudian disimpan selama 3 jam untuk 30ᵒC.
Untuk oksidasi, 6 ml larutan stok ditambahkan 2 ml larutan 6% H2O2 tadi.
Volume dibuat hingga 10 ml dengan Metanol (0,3μg / 5μl). Campuran ini
kemudian disimpan selama 3jam di RT. 5μl larutan resultan (300 ng / band).
diaplikasikan pada pelat TLC bersama dengan blanko masing-masingtrek yang
berdekatan dan densitogram dikembangkan.
Setelah itu dilakukan degradasi di bawah panas kering. Studi panas kering
dilakukan dengan menyimpan sampel obat dalam oven (50 0 C) selama ajangka
waktu 120 jam. 10 mg obat yang terpapar tadi ditimbang secara akurat dan
dipindahkan ke 100 ml labu ukur dan dilarutkan dalam metanol, volumenya
dibuat dengan metanol untuk mendapatkan konsentrasi. Dari 100µg / ml, larutan
stok standar 6 ml Phenobarbitone tadi kemudian diencerkan dalam 10 ml
methanol hingga mendapatkan standar kerjalarutan (0,3μg / 5μl). Kemudian 5μl
larutan resultan(300ng / band) diaplikasikan pada pelat KLT bersama dengan
masing-masing kosong di trek yang berdekatan dan densitogram dikembangkan.
Dan yang terakhir dilakukan studi degradasi foto. Yang pertama Degradasi
UV panjang pada 366 nm, dengan mengencerkan 10 ml methanol untuk
mendapatkan standar kerjalarutan (0,3μg / 5μl). Kemudian timbang 10 mg obat
secara akurat 100 ml metanol untuk mendapatkan konsentrasi 100µg / ml. 6ml
larutan stok standar Phenobarbitone. Setelah itu fotokimiastabilitas obat dipelajari
dengan memaparkan obat sampel ke sinar UV panjang (366nm) selama 48 jam 10
mg setelah terpapar. Dan 5μl larutan resultan(300ng / band) kemudian
diaplikasikan pada pelat KLT. Lalu yang kedua Degradasi UV pendek pada 254
nm. Fotokimiastabilitas obat dipelajari dengan memaparkan obatsampel ke sinar
UV pendek (254nm) selama 48 jam 10 mg. Setelah terpapar, timbang 10 mg obat
secara akurat100 ml metanol untuk mendapatkan konsentrasi 100µg / ml. 6ml
larutan stok standar fenobarbiton kemudiandiencerkan dalam 10 ml methanol
untuk mendapatkan standar kerjalarutan (0,3μg / 5μl). Dan 5μl larutan
resultan(300ng / band) kemudian diaplikasikan pada pelat KLT.

III. Pengolahan Data

Timbang secara seksama 50 mg standard fenobarbital. Masukkan ke dalam

labu takar 50 ml, tambahkan pelarut hingga batas tanda. Kemudian
ditotolkan/diaplikasikan 1, 3, 5, 7, 9 ppm dan dianalisis dengan panjang
gelombang 270 nm. Sediaan injeksi fenobarbital 50 mg/ml dengan tiap ampul
sebanyak 1 ml pada kemasan, sebanyak 10 injeksi dicampurkan, diambil sebanyak
1 ml fenobarbital dan dimasukan dalam labu takar 50 ml, ditambahkan pelarut
hingga batas tanda. Pipet 1 ml larutan stok sampel ke dalam labu takar 50 ml
ditambah dengan pelarut hingga tanda batas. Larutan sampel dan larutan baku
ditotolkan sebanyak 10 ul pada plat KLT. Kemudian diukur AUC pada panjang
gelombang 270 nm . Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.
A. Persamaan Regresi Linear Dari Konsentrasi (ppm) dan AUC
konsentrasi (ppm) AUC
1 3123,2
3 5790,6
5 7870,6
7 10493,2
9 12737,9

Gambar Kurva 1.1 Persamaan dari konsentrasi (ppm) dan AUC

B. Menghitung Rataan Sampel

Pengulangan Uji AUC

1 10317,8
2 10792,2
3 10171,4
 Rataan AUC Sampel
10317,8+ 10792,2+10171,4
X́ AUC sampel =
3
= 10427,13 (y)
 Perhitungan kadar dengan persamaan regresi linier
y = 1196,6x + 2020,1
10427,13 = 1196,6x + 2020,1
10427,13−2020,1
x =
1196,6
 x (kadar rataan) = 7,025 ppm

 Perhitungan Konsentrasi awal sampel

50 mg 50000 µg
= = 1000 ppm
50 ml 50 ml

 Perhitungan konsentrasi pengenceran akhir sampel

M1xV1 = M2xV2
1000 ppm x 1 ml = M2 x 50 ml
1000 ppm x 1ml
M2 =
50 ml
M2 = 20 ppm

 Faktor Pengenceran
konsentrasi awal sampel
Faktor pengenceran =
konsentrasi pengenceran akhir sampel
1000 ppm
=
20 ppm
= 50 x pengenceran

 Kadar Dalam Sampel Hasil Pengenceran

Kosentrasi akhir = kadar rataan (x) x faktor pengenceran
= 7,025 ppm x 50
= 351,25 ppm

 Perhitungan faktor massa

massa sampel
Faktor massa =
konsentrasi larutan stok sampel
50 mg
=
1000 ppm
mg
= 0,05
ppm

 Perhitungan massa sampel

 Massa sampel = konsentrasi akhir x faktor massa
mg
= 351,25 ppm x 0,05
ppm
= 17,5625 mg
 Sampel yang dimasukkan 50 mg standard fenobarbital
massa sampel ( percobaan)
% Kadar Zat Aktif dalam sediaan = x
massa fenobarbital
100%
17,5625mg
= x 100%
50 mg
= 35,125 %

IV. Pembahasan

Pada praktikum kali ini membahas mengenai Analisis Sampel Fenobarbital

Dengan Metode KLT – Densitometri, yang dimana memiliki tujuan dapat
menjelaskan, menerangkan, dan mendemonstrasikan uji analisis sampel, serta
mampu menganalisis sampel secara Kromatografi Lapis Tipis – Densitometri.

Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan

interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT.
Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda KLT yang ditentukan adalah
absorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor
dari radiasi semula. Densitometri lebih dititik beratkan untuk analisis kuantitatif
analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan
terlebih dahulu dengan KLT. Densitometri merupakan metode penetapan kadar
suatu senyawa pada lempeng kromatografi , menggunakan instrumen TLC
scanner, pengukuran dilakukan dengan cara mengukur serapan analit (cahaya
yang diukur dapat berupa cahaya yang dipantulkan atau yang diteruskan),
pemadaman fluoresensi untuk lapisan yang mengandung bahan berfluorsensi
analit atau hasil eaksi analit. (gandjar dan rohman, 2007)
 Metode KLT – Densitometri ialah metode analisis instrumental yang
berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda
pada KLT. Alat ini dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai radiasi
sinar pada panjang gelombang nm, metode ini dapat menganalisis uji kualitatif
dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi).
(Rohman, 2009)
Komponen – komponen densitometer terdiri dari sumber cahaya yang
stabil, lalu rangkaian komponen optik yang berfungsi untuk memfokuskan sinar
agar sinar jatuh tepat pada sampel, lalu ada penyaring untuk menentukan respon
spectral unit, detector untuk membaca sinar yang direfleksikan, kemudian ada
Logarithmic Amplifier yang berguna sebagai penguat yang dihasilkan tegangan
output logaritmik yang sebanding dengan logaritmik input, dan juga ada Layar
display yang berfungsi untuk menampilkan data agar pengguna dapat melihat data
yg dihasilkan. (Rohman, 2009)

Photomultiflier yang terdapat di

densitometri berfungsi untuk memperbesar
tenaga potensial listrik sehingga mampu
menggerakan integrator. Integrator dengan
sistem mikrokomputer secara langsung dapat
menghitung luas puncak atau tinggi puncak secara otomatik. Selain itu mencatat
nomer urut, kedudukan puncak pada ordinal Y, atau waktu retensinya. Letak
sumbu Y dan X dari lempeng akan mempengaruhi hasil yang diperoleh. Kalau Y
disesuaikan dengan arah gerak eluen dan sumbu X tegak lurus padanya atau
merupakan deretan penotolan sampel pada lempeng. Dengan cara itu mereka akan
mendekati kepastian. (Skoog, 1985)
Cara kerja densitometer ialah; Langkah pertama yaitu menyalakan tombol
on pada densitometer. Perlu diingat sebelum menggunakan alat ukur ini pastikan
untuk melakukan kalibrasi terlebih dahulu pada densitometer. Untuk kalibrasinya
sendiri, sebaiknya menggunakan kalibrasi reference yang ada. Selanjutnya diatur
beberapa warna yang ingin dipakai dengan cara mengubah nilai pada tombol
densitometer. Jika Anda sudah selesai mengalibrasi, Anda bisa menempatkan
densitometer di atas warna yang akan dilakukan pengukuran. Kemudian langkah
berikutnya tekan densitometer dan jika bunyi sudah selesai maka densitas warna
akan langsung muncul di bagian layarnya (Sherma, and Fried, 1999)
Densitometer mempunyai Lempeng yang berfungsi sebagai pemisahan,
dengan cara diuji terlebih dahulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X,Y), agar
sinar dapat tepat mengenai pusat bercak. Setelah itu, tombol dihidupkan lalu
lempeng ditempat kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur, dan gerakan
lempeng diatur sesuai kedudukan bercak, menggunakan mikrokomputer.
Kemudian, Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan secara maksimum,
bila belum diketahui dilakukan scanning terlebih dahulu. (Sherma, and Fried,
1999)
Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara, yaitu cara memanjang, dan
system zig zag. Untuk cara memanjang, Sinar dilewatkan pada tengah bercak,
sehingga bercak hanya dideteksi sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,
(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat semetris. Sementara
untuk Sistem zig-zag, Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi
berbelok -belok sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-
Y2, dan X1-X2. ( Fried, B., and J. Sherma, 1999)
Kelebihan KLT Densitometri Penentuan kadar analit yang dikorelasikan
dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode
KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair)
sebab area noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zigzag" menyeluruh.
Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak
menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati
parabola 52, sedangkan kelemahannya ialah membutuhkan waktu lebih lama,
tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan metode
pengamatan lurus. (wulandari dkk, 2013).
Pada praktikum ini menggunakan sampel fanobarbital yang dimana
fenobarbital merupakan obat golongan barbiturat yang berkhasiat sebagai hipnotik
sedatif yang berefek utama depresi susunan saraf pusat. Fenobarbital memiliki
rumus C12H12N2O3, dan struktur kimia sebagai berikut;
 Gambar Struktur Fenobarbtal

Obat fenobarbital yang tersedia mengandung alkohol dalam jumlah tinggi

dapat meningkatkan kemungkinan Efek yang tidak menyenangkan. Survei lebih
lanjut mengungkapkan bahwa metode analitik tersedia untuk penentuan
fenobarbiton obat oleh Analisis konduktometri yang dimodifikasi. (Isadiartuti,
2005).
Metode percobaan ini diawali dengan dilakukannya standar larutan stok
Phenobarbitone, sebelumnya Fenobarbital merupakan obat sedatif dan hipnotik
yang tersedia dalam bentuk sediaan tablet, eliksir dan injeksi. Kelarutannya dalam
air 1 : 1000. Kelarutan fenobarbital yang kecil merupakan masalah dalam
pembuatan sediaan injeksi khususnya untuk pemakaian secara intravena.
(Isadiartuti, 2005). Pada farmakope edisi VI juga dijelaskan bahwa kelarutan dari
fenobarbital ini yaitu Sangat sukar larut dalam air; larut dalam etanol, eter, larutan
alkali hidroksida dan alkali karbonat; agak sukar larut dalam kloroform. Maka
dari literature diatas tersebut pelarut yang digunakan untuk standar larutan stok
Phenobarbitone ini adalah methanol. Setelah itu dilakukan solusi stok
Phenobarbitone untuk mendapatkan %RSD sehingga bisa memeriksa akurasi
Metode. untuk memeriksa keakuratan metode, studi pemulihan dilakukan dengan
over spotting. Pada Densitogram Fenobarbiton, metanol digunakan sebagai
pelarut untuk preparasi larutan. Standar larutan stok Phenobarbitone 5µl (300ng /
band) diaplikasikan pada pelat TLC. Faktor retensi Fenobarbiton adalah 0,70 ±
0,05. Dilakukan hidrolisis asam. kemudian hidrolisis alkal dan oksidasi.
Dilakukan penjenuhan 3 macam eluen yaitu etil-asetat,metanol dan asam
asetat dengan perbandingan 17:2:1. Menggunakan 3 macam eluen untuk
menentukan eluen mana yang paling baik yg akan digunakan untuk melarutkan
zat aktif. Kedua, menyiapkan silica gel, silica gel digunakan untuk menotolkan
sampel dengan ketentuan jarak bagian bawah 1,5cm dan jarak atas 0,5 cm.
Sedangkan jarak masing-masing totolan 1cm. Saat eluasi mulai dari bagian bawah
atau bagian yang lebih lebar sehingga totolan diberikan pada bagian bawah.
Kemudian dilakukan analisis fenobarbital dengan cara KLT-Densitometri
yang memiliki cara kerja sebagai berikut; ditimbang secara seksama 50 mg
standard fenobarbital. Masukkan ke dalam labu takar 50 ml, tambahkan pelarut
hingga batas tanda. Kemudian ditotolkan/diaplikasikan 1, 3, 5, 7, 9 ppm dan
dianalisis dengan panjang gelombang 270 nm. Untuk sediaan injeksi fenobarbital
50 mg/ml dengan tiap ampul sebanyak 1 ml pada kemasan, sebanyak 10 injeksi
dicampurkan, diambil sebanyak 1 ml fenobarbital dan dimasukan dalam labu takar
50 ml, lalu ditambahkan pelarut hingga batas tanda. Pipet 1 ml larutan stok
sampel ke dalam labu takar 50 ml, lalu ditambah dengan pelarut hingga tanda
batas. Larutan sampel dan larutan baku ditotolkan sebanyak 10 ul pada plat KLT,
setelah itu diukur AUC pada panjang gelombang 270 nm . Percobaan dilakukan
sebanyak 3 kali pengulangan. Dilakukan 3 kali pengulangan agar mendapatkan
hasil yang presisi.
Pada analisis kuantitatif dilakukan perhitungan kadar Fenobarbital dengan
cara menghitung rata rata sampel terlebih dahulu kemudian didapat rata rata
sampel sebesar 10427,13(y), lalu dilakukan perhitungan kadar dengan persamaan
regresi linear dengan hasil 7.025ppm, lalu didapat perhitungan konsentrasi awal
sampel yaitu 1000ppm, lalu didapat juga perhitungan konsentrasi pengenceran
akhir sampel dengan nilai M2 20 ppm, lalu dilakukan pengenceran dengan factor
pengenceran sebanyak 50 kali, sehingga didapat kadar dalam sampel hasil
pengenceran sebesar 351,25ppm. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan
konsentrasi yang kecil sehingga semakin memudahkan hasil yang di dapat.
Setelah itu dilakukan perhitungan factor massa dan didapat factor massa
0,05mg/ppm, kemudian didapat perhitungan massa sampel dengan mengalikan
konsentrasi akhir dengan factor massa, dan didapat hasilnya sebanyak 17,5625mg,
dan didapat %kadar zat aktif sebanyak 35,125%.
 Metode yang diusulkan tepat,spesifik, akurat, kuat, dan menunjukkan
stabilitas fenobarbiral, sehingga dapat ditentukan secara keseluruhan formulasi
dan persentase farmasi degradasi. Kadar analit dapat ditentukan dengan
menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan garis y = bx + a yang
diperoleh dari kurva kalibrasi larutan deret standar. Didapatkan grafik persamaan
konsentrasi (ppm) dengan AUC yang cendeung meningkat, hal ini membuktikan
bahwa semakin besar konsentrasi yang didapatkan, maka semakin besar AUC
yang dihasilkan. Berdasarkan data pengamatan diperoleh kadar fenobarbital
sebesar 35,125 % dimana hasil ini tidak sesuai dengan persyaratan yang tercantum
dalam farmakope Indonesia edisi IV karena tidak masuk dalam rentang <90% dan
>110%.

V. Kesimpulan

VI. Daftar Pustaka

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia

Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia

Edisi VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Fried, B., and J. Sherma, 1999, Thin-Layer Chromatography, Marcel

Dekker, New York, 1-7.

Rohman, A. 2009. Kromatografi Untuk Analisis. Cetakan I. Graha Ilmu.

Sherma, J., and B. Fried, 1999, Thin Layer Chromatography. 4rd edition.
Marcel Dekker, Inc., New York, 1-9.
Skoog , D. A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, Saunders College Publ,
Philadelphia, 5, 842- 845.

Gandjar, I.G.dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis Farmasi, Yogyakarta:

Pustaka Pelajar, hal 353-368

Wulandari, L., Retnaningtyas, Y., dan Mustafidah, D. 2013. Pengembangan Dan

Validasi Kromatografi Lapis Tipis Densitometri Untuk Penetapan Kadar Teofilin
Dan Eferdin Hidroklorida secara Stimulan Pada Sediaan tablet, Jurnal Kimia
Terapan Indonesia, Vol. 15, No.1, ISSN 0853 - 2788: 15-21.

Isadiartuti, D. dan Suwaldi, 2005, Pembentukan kompleks inklusi fenobarbital

dengan hidroksipropil-β-siklodekstrin. Majalah Farmasi Indonesia, 16 (1), 28 –
37, 2005

VII. Tabel Pengerjaan

N
o Nama NIM Kontribusi
- Metodologi
1 Aldila Fajar Oktriyanto 119260009 - Daftar Pustaka
2 Anastya Devi Septiani 119260075 -Pembahasan
Fransiska Abella -Pengolahan Data
3 Berliana 119260033 - Tabel Pengerjaan
Rahadika Kurnia - Pembahasan
4 Shandy 119260152 - Tujuan Percobaan
- Cover
5 Vinna Agustiya 119260049 - Kesimpulan