APLIKASI KCKT & GC

UNTUK ANALISIS
ANALISIS KUALITATIF
ANALISIS KUANTITATIF
Analisis Kualitatif dengan HPLC dan GC

‘What’ is in the sample?

 Sample Spiking

Teknik ‘spiking’ suatu sampel adalah

dengan menambahkan baku
pembanding (standar) yang diketahui ke
dalam sampel. Tujuannya untuk
mengkonfirmasi/ memastikan identitas
suatu analit daari puncak-puncak
sampel
Spectral Peak Identification
• Penggunaan detektor yang selektif dan
spektrometer dapat meningkatkan
kemampuan identifikasi dari suatu peak.
• Detektor seperti Diode Array UV atau
Spektrometer Massa dapat menghasilkan
spektra yang unik dari tiap peak pada
kromatogram sampel.
Quantitative Analysis
 Persyaratan kromatogram untuk
Kuantitatif

 Resolusi baik
 Respon analit berada dalam rentang linier detektor
 Good peak performance
 Tidak ada peak shoulders atau tailing (jika
memungkinkan)
 Peak symmetry sekitar 1
Berapa banyak suatu analit dalam suatu sampel ditunjukkan oleh
AREA under the peak, yang mana besarnya berkorelasi dengan
berapa banyak analit dalam sampel.
Pada gambar di atas, kedua sampel mengandung acrylamide tetapi
sampel B mengandung acrylamid sebesar 1/10 dari sampel A
Kedua sampel mengandung senyawa yang belum diketahui
(unknown) dengan kadar yang sama
Peak Integration
Integration Events
 Peak Height atau Peak Area
• Untuk kebanyakan analisis KCKT, peak area (luas
puncak) digunakan untuk perhitungan kuantitatif,
meskipun dalam beberapa kasus hasil yang
ekivalen diperoleh dengan menggunakan
peritungan berdasar tinggi puncak (peak height).
• Luas puncak lebih bermanfaat untuk perhitungan,
sebab puncak KCKT kadangkala tailing. Pada
kondisi ini, tinggi puncak akan bervariasi
sementara luas puncak akan konstan, sehingga
perhitungan dengan luas puncak lebih baik
keterulangannnya.
Peak Height atau Peak Area
 Pengaruh Kecepatan alir terhadap
Peak Height dan Peak Area

Gambar di atas mengilustrasikan bahwa area dari peak

kromatografik akan berubah jika kecepatan alir berubah.
Peak height dan area akan berubah jika volume injeksi bervariasi
Metodologi Utama untuk Analisis
Kuantitatif
1. Area %/ Height % (Normalization)
 Latihan perhitungan kadar dengan : Area %/
Height % (Normalization):
Channel A
levofloxacin

17.142
presisi B5.190606
0.050 Retention Time 0.050
Volts

Volts
0.025 0.025

14.983
0.000 0.000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Minutes

Detector A (295nm)
Pk # Retention Area Area % Height Height %
Time
1 14.983 1.389.609 57.607 57.085 60.594
2 17.142 1.022.633 42.393 37.124 39.406

Totals 2.412.242 100.000 94.209 100.000

Jika puncak dengan waktu retensi 14,983 adalah levofloxacin dan
puncak dengan waktu retensi 17,142 adalah ciprofloxacin,
berapakah persen kadar levofloxacin dalam campuran kedua obat
tersebut?
 Jawab
Detector A (295nm)
Pk # Retention Area Area % Height Height %
Time
1 14.983 1.389.609 57.607 57.085 60.594
2 17.142 1.022.633 42.393 37.124 39.406

Totals 2.412.242 100.000 94.209 100.000

Dihitung menggunakan data luas puncak

1.389.609
% Levofloxacin = = 57,607 %
1.389.609 + 1.022.633
Dihitung menggunakan data tinggi puncak
57.085
% Levofloxacin = = 60,594 %
57.085 + 37.124
• Prosedur perhitungan % Area menunjukkan luas dari
masing-masing puncak dalam kromatogram sebagai
persentase terhadap total luas seluruh puncak yang
ada.
• Cara perhitungan % Area tidak membutuhkan
pembuatan kurva baku (kalibrasi) terlebih dahulu
dan tidak tergantung pada jumlah sampel yang
diinjeksikan dalam batas detektor.
• Tidak digunakan response factor dalam perhitungan.
• Jika semua komponen memberikan respon yang
ekual pada detektor dan elusi, maka % Area
memberikan pendekatana jumlah relatif dari suatu
komponen dalam sampel.
 Batasan yang berkaitan dengan
metodologi kuantitatif
• Metode ini memiliki asumsi bahwa semua analit
memberikan respon detektor yang ekual

• Metode ini memiliki asumsi bahwa semua komponen

dalam sampel semuanya muncul pada kromatogram
(yaitu semua komponen terelusi keluar dari kolom dan
menghasilkan sinyak detektor)

• Puncak pada kromatogram yang disebabkan oleh

adalanya analytical artefacts (pelarut, carry-over, dll),
mungkin dapat mempengaruhi kuantifikasi
 2. External Standard Calibration
(Baku Eksternal)
• Prosedur kuantitasi dengan baku eksternal (external
standard/ESTD) adalah prosedur kuantitatsi dasar
dimana baik standar/kalibrasi dan analit dalam sampel
yang ditetapkan kadarnya dianalisis pada kondisi yang
sama secara terpisah.
• Hasil (biasanya data peak height atau peak area yang
diukur dari sistem data) dari sampel yang belum
diketahui kadarnya (unknown) dibandingkan dengan
sampel kalibrasi/standar, menggunakan kurva baku/
kalibrasi untuk menghitung jumlah analit dalam
sampel.
Prinsip kalibrasi standar eksternal
 a. Single Point Calibration
Menggunakan larutan standar/ sampel kalibrasi
pada satu konsentrasi tertentu
Contoh:
• Injeksi pada KCKT larutan yang mengandung
Parasetamol pada konsentrasi 2.000 μg/mL
menghasilkan peak area 100.000.
• Injeksi pada kondisi yang sama dari larutan
sampel yang tidak diketahui kadar
parasetamolnyanya menghasilkan peak area
57.000.
• Berapakah konsentrasi Parasetamol dalam
sampel yang terukur?
 Jawab
Cs = Konsentrasi parasetamol standar = 2.000 μg/mL
As = peak area standar 100.000.
Ax = peak area sampel
Cx = konsentrasi parasetamol sampel (µg/mL)

Ax
Konsentrasi parasetamol = X Cs
As

57.000
Konsentrasi parasetamol = X 2000 µg/ mL
100.000

= 1140 µg/ mL
 b. Multi-Level Calibration Curve
Menggunakan larutan standar/ sampel kalibrasi
pada beberapa konsentrasi (seri konsentrasi)

Kurva kalibrasi adalah grafik yang menggambarkan hubungan antara

jumlah dan data respon detektor untuk suatu analit tunggal (senyawa) yang
diperoleh dari satu atau lebih sampel kalibrasi.
Kurva biasanya dibuat dengan menginjeksikan satu seri larutan
standar/baku/kalibrasi yang diketahui konsentrasinya dan dilakukan
pengukuran luas puncak/ peak area masing-masing konsentrasi.
External Standard Multi-Level
Calibration
Multi-Level Calibration (kurva baku)

Beberapa
konsentrasi baku
yang berbeda
diinjeksikan, dicatat
luas puncaknya
 Multi-Level Calibration (kurva baku)

Kurva baku/ kalibrasi diperoleh dengan meghubungkan

konsentrasi baku/standar di sumbu x dan luas puncak/ peak area
di sumbu y. Diperoleh persamaan garis lurus  y = bx + a
dimana b = slope; a = intersep
 Multi-Level Calibration (kurva baku)

 Kemudian diinjeksikan larutan sampel. Luas puncak analit

pada kromatogram sampel digunakan untuk menghitung
kadar analit dalam sampel
 Luas puncak sampel dimasukkan sebagai nilai y pada
persamaa kurva baku yang sudah dibuat (y = bx + a) untuk
mencari nilai x yaitu konsentrasi analit terukur
Informasi Statistik dari suatu garis
regresi
Koefisien korelasi dan bentuk grafik
• Intersep dari persamaan regresi menunjukkan
kesalahan sistematik  nilai intersep yang besar
baik positif maupun negatif mengindikasikan
adanya inherent error dalam penyiapan sampel
untuk analisis
• Slope dari garis mengindikasikan ‘sensitivity’.
• Koefisien regresi adalah ukuran statistik dari
‘goodness of fit’ ke garis lurus; dihitung dari
residuals (error) tiap titik data, r +1
mengindikasikan suatu garis lurus dengan slope
positif.
Parameter penting dalam Multi-level
Callibration
 Perhitungan dengan Kurva Kalibrasi
Dari kurba baku/kalibrasi, analisis regresi
akan menghasilkan persamaan garis lurus :
y = bx + a atau y = mx + c
Dimana :
y = luas puncak / peak area
 m atau b = slope dari garis regresi
 c atau a = intersep dari garis regresi dengan
sumbu y
 Latihan:
• Suatu persamaan regresi yang diperoleh dari
multi-level calibration adalah y = 100,92 x +
0,3562 (dimana x adalah konsentrasi baku
(µg/mL).
• Jika peak area sampel adalah 327.
• Jika sampel sebelum injeksi diencerkan dari 10
mL menjadi 25 mL
• Hitunglah konsentrasi analit dalam sampel!
 Jawab
Diketahui:
Peak area analit dalam sampel = 327
Faktor pengenceran = 25 mL / 10 mL = 2,5 x
Persamaan kurva baku y = 100,92 x + 0,3562

Maka konsentrasi analit =

327 = 100,92 x + 0,3562
X = 3,237 (µg/mL)
Dikalikan faktor pengenceran; maka konsentrasi
analit adalah:
= 3,237 (µg/mL) x 2,5
= 8,092 µg/mL
3. Internal Standard Calibration (Baku
Internal)
• Prosedur baku internal dapat mengatasi kekuran
metode baku eksternal yaitu dengan
menambahkan sejumlah tertentu yang diketahui
baku/ senyawa yang berperan sebagai
normalizing factor.
• Senyawa ini (baku internal) ditambahkan baik ke
dalam larutan baku/kalibrasi maupun ke dalam
larutan sampel.
• Baku internal akan “mengkompensasi”
kehilangan analit selama preparasi sampel atau
variabilitas yang timbul selama penetapan
analitik (misalnya fluktuasi arus listrik yang akan
berakibat pada variabilitas hasil pengukuran).
• Baku/standar/senyawa yang digunakan sebagai
baku internal harus mirip dengan analit yang
dianalisis baik secara kimia maupun dalam hal
waktu retensi, tetapi harus dapat dipisahkan dan
dibedakan secara kromatografi (puncaknya
terpisah sempurna dari puncak analit).
• Pada prosedur multi-level calibration, jumlah
baku internal yang ditambahkan ke dalam
masing-masing larutan baku adalah konstan;
yaitu pada konsentrasi yang sama pada semua
konsentrasi larutan baku.
Analisis kuantitatif dengan Baku
Internal
 Syarat Standar Internal
- Terpisah sempurna dari peak senyawa yg dianalisis dan
peak lain

- Memiliki waktu retensi mirip sampel

- Tidak terdapat dalam sampel awal

- Dapat me mimic analit disetiap tahap preparasi sampel

 lanjutan…
- Memiliki respon terhadap detektor serupa dengan
respon analit pada konsentrasi yg digunakan

- Tidak harus memiliki kemiripan secara kimiawi dengan

analit

- Stabil dan tidak bereaksi dengan sampel atau fase gerak

- Tersedia komersial dengan kemurnian tinggi

 lanjutan…

Ditambahkan ke dalam larutan

seri kadar senyawa baku dan sampel
dengan konsentrasi tetap

(  kons. Sampel )
 Contoh cara kerja dengan baku internal:
• Pembuatan kurva baku larutan baku levofloxacin (5; 10; 15, 20; 25;
dan 30) mg/ml dengan penambahan baku internal ciprofloxacin 20
mg/ml.
• Disiapkan 6 labu takar 10 mL
• Pipet larutan stok baku levofloxacin 100 mg/mL sebanyak 0,5; 1,0;
1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL. Masing-masing dimasukkan ke dalam labu
takar 10 mL.
• Ke dalam masing-masing labu tambahkan 2,0 mL larutan baku
internal ciprofloxacin 100 mg/mL.
• Tepatkan volume masing-masing labu dengan fase gerak.
• Saring dengan membran filter dan sonikasi.
• Injeksikan ke KCKT.
• Amati kromatogram, catat luas puncak baku lefoloxacin dan luas
puncak baku internal.
• Hitung rasio luas puncak (Peak Area Ratio) levofloxacin terhadap luas
puncak ciprofloxacin pada tiap kromatogram
• Buat kurva hubungan antara konsentrasi levofloxacin (sumbu x) dan
rasio luas puncak (peak area ratio) di sumbu y
 Ciprofloxacin
(baku internal)
Channel A
levofloxacin
Levofloxacin
presisi B 1 080606.dat

17.042
Retention Time
0.050 0.050
Volts

Volts
0.025 0.025

14.900
0.000 0.000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Minutes

Konsentrasi Luas Area

Levofloxacin Levofloxacin Baku internal Peak Area
(mg/ml) Rasio
5 1.129.699 1.171.640 0.964203
10 1.531.960 1.183.757 1.294151
15 1.959.561 1.163.840 1.683703
20 2.452.914 1.163.125 2.108900
25 2.973.412 1.203.484 2.470670
30 3.273.521 1.202.074 2.723228
 3
2.5
Peka Area Rasio

2
1.5
y = 0.0729x + 0.5992
1 R² = 0.9956
0.5
0
0 10 20 30 40
Konsentrasi Levofloksacin (mg/mL)
Jika injeksi larutan sampel tablet levofloxacin
memperoleh data sebagai berikut:
 Bobot tablet : 722,7 mg
 Penimbangan serbuk tablet : 200 mg/500 mg x 722,7
mg = 289,08 mg
 Jumlah serbuk yang ditimbang : 289,08 mg
 Volume pelarutan (VP) : 10 ml
 Faktor pengenceran (FP) :-
 Luas Area Levofloxacin : 2.497.451
 Luas Area Standar internal : 1.219.132
Maka hitunglah kadar levoflokxacin dalam tablet sampel!
 Peak Area Rasio = Luas Puncak Levofloxacin/Standar Internal
= 2.497.451 / 1.219.132
= 2,0485
Persamaan kurva baku = y = 0,072x + 0,599
2,0485 = 0,072 x + 0,599
x = 20,1326 mg/mL
Kadar levofloxacin
(mg/tablet)= X (mg/ml) x VP x FP
X bobot rata-
Bobot serbuk yang ditimbang (mg) rata tablet
(mg/tablet)

Kadar levofloxacin
(mg/tablet)= 20,1326 (mg/ml) x 10 ml X 722,7 (mg/tablet)
289,08 mg
kadar levofloxacin = 503,315 mg/tablet
Jika dalam label di kemasan tertulis bahwa tiap
tablet mengandung 500 mg levofloxacin. Maka
kadar levofloxacin (%) terhadap label adalah:
Kadar levofloxacin hasil penetapan (mg/tablet) X 100%
Jumlah levofloxacin/ tablet pada label (mg/tablet)

503,315 mg/tablet X 100%

500 mg/tablet

= 100,663 %
4. Standard Addition Method
 Standar Adisi
- Senyawa standar yang ditambahkan sama dengan
senyawa analit dalam matriks (sampel)

- Standar dengan berat yang berbeda ditambahkan ke

dalam sampel (matriks) yang jumlahnya sama

- Kemudian dilakukan pengukuran kadarnya

- Paling sering digunakan dalam trace analysis

( konsentrasi analit < 0,1 % )
 lanjutan…

SYARAT

Respon analit sebelum di spiking

harus menghasilkan
nilai

S / N > 10
Standard Addition Method
Standard Addition sangat bermanfaat untuk matriks
sampel yang kompleks
Dapat mengkompensasi pengaruh matriks
Cara penetapan kadar dengan standar addisi :
 Sejumlah standar analit yang diketahui ditambahkan ke
dalam sampel
Standar yang ditambahkan dan analit dalam sampel
adalah senyawa yang sama
Peningkatan sinyal analit berkaitan dengan kuantitas total
analit
Dibutuhkan respon yang linier dari analit
Masukkan sejumlah volume tertentu sampel dalam
beberapa tabung
Tambahkan sejumlah volume yang berbeda (meningkat)

Tambahkan pelarut sampai volume tertentu di semua labu

 Method of Standard Addition
adds varying amount of standard to an unknown which already
contains some analyte

1. Add same quantity

of unknown sample
to a series of flasks
2. Add varying
amounts of
standard (made in
solvent) to each
flask, ex.
0,5,10,15mL)
3. Fill each flask to
line, mix and
measure
Ukur sinyal analitik untuk tiap sampel. Besarnya sinyal
proporsional terhadap konsentrasi analit

Concentration of analyte in initial solution signal from initial solution


Concentration of analyte plus s tan dard in final solution signal from final solution

X i 
IX
S  f   X  f
Standard addition equation:
IS X
Total volume (V):
V  Vo  VS , Vo  unknown initial volume , VS  added volume of s tan dard

X  f  X i  Vo  S  f  S i  VS 
V  V 
Buat kurva hubungan antara konsentrasi analit (standar) yang
ditambahkan dan sinyal yang terukur

X-intercept (y=0) yields  X  f

which is used to calculate X i from:
 
X i  X  f  V
 Vo 
Contoh-contoh analisis
 Fatty Acid Analysis of Lipid
Extracted From Rats by Gas Chromatography-
Mass Spectrometry Method
Utami et al, 2017

62
Pemilihan Fase Diam KCKT
Pemilihan Jenis Mekanisme LC
Pemilihan Fase diam dan mekanisme
pemisahan LC