A.

Soal
1. Jelaskan prinsip pemisahan dari metode HPLC!
2. Sebutkan dan jelaskan fungsi dari bagian-bagian instrumen HPLC!
3. a. Bagaimana proses filtrasi dan degassing pada solven HPLC yang akan digunakan? b. Apa
tujuan dari kedua proses tersebut?
4. Seorang tenaga farmasi melakukan evaluasi terhadap panjang gelombang maksimal (ʎmax)
yang akan digunakan pada analisis HPLC menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Berdasarkan
data nilai absorbansi dari berbagai konsentrasi di bawah ini (amati data dalam kotak berwarna
merah dan hijau), berapakah nilai panjang gelombang maksimal (ʎmax) yang akan digunakan?
Jelaskan!

1
5. Berikut ini adalah kondisi dari dari alat HPLC yang digunakan dalam suatu penelitian

Tentukan :
a. Fase gerak yang digunakan
b. Tipe elusi dari fase gerak tersebut
c. Fase diam yang digunakan
d. Suhu analisis
e. Kecepatan alir
f. Lama waktu analisis
g. ʎmax yang digunakan
h. Tipe detector
i. Berdasarkan kondisi yang yang telah dijelaskan, analisis yang dilakukan termasuk ke
dalam analisis HPLC fase normal atau fase terbalik? Jelaskan jawaban Anda!

2
6. Setelah melakukan analisis senyawa Clopidogrel menggunakan instrument HPLC, didapatkan
hasil kromatogram seperti gambar dibawah ini.

Berdasarkan data yang teramati pada kromatogram diatas,

a. Data apa yang diperoleh pada peak tersebut?

b. Analisis apa yang dapat dilakukan? Jelaskan!

7. Bagian QC dari suatu industri obat melakukan mencoba membuat kurva baku untuk
menghitung kadar senyawa Dapaglifozin menggunakan HPLC. Berikut data AUC yang
diperoleh dari seri konsentrasi yang telah dibuat.

3
Berdasarkan data diatas,

a. Buatlah grafik kurva kalibrasi dari data di atas!

b. Tentukan persamaan regresi linearnya!

8. Sebuah penelitian dilakukan untuk menentukan kadar senyawa Sofobuvir (SOF) dan
Velpatasvir (VEL) pada suatu sampel. Tentukan kadar dari masing-masing senyawa dengan
menggunakan data dibawah ini!

B. Jawaban
1. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya, setiap
campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram.
Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran.
2. Bagian Bagian HPLC  – High Performance Liquid Chromatography

4
- Solvent Organizer digunakan untuk menghilangkan pengaruh gelembung(gas) atau
mengurangi fluktuasi tekanan yang menyebabkan base line conditioning tidak bisa tercapai.

- Hight Pressure Pump merupakan kompenen penting dari instrument HPLC untuk memompa
solvent organizer . Pada umumnya beberapa pompa memiliki tekanan yang berkisar pada
6000psi, namun ada beberapa jenis pompa yang mampu memiliki tekanan hingga 9000psi. Hal
ini tentu saja bisa merubah sesuai kebutuhan, pompa dengan tipe tekanan 9000 psi biasa
digunakan pada UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). Pemilihan pompa yang
sesuai bisa saja memberikan dampak yang besar dari setiap aplikasi, bukan hanya waktu yang
lebih singkat tapi juga penggunaaan solvent berkurang dengan signifikan.

- Auto Sampler HPLC digunakan dalam presisi injeksi yang tinggi diperlukan dalam proses
auto sampler, perubahan linearity yang luas diperlukan dari berbagai algoritma yang sudah
ditanamkan pada software auto sampler.
- Column Oven HPLC berfungsi untuk menjaga suhu atau temperature pada range tertentu, hal
ini dilakukan karena pengukuran nilai pada mobile phase bisa berubah pada suhu yang berbeda.
Artinya, jika sample diberikan perlakuan yang sama pada suhu yang sama akan meningkatkan
ke-akuratan proses pengambilan data.
- Detector UV-VIS HPLC berfungsi untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam
kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak berdera, rentang
tanggapan liniernya sangat lebar dan menggapai semua jenis senyawa.

3.a. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil,
misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring (filter) debu. Degassing dapat
dapat juga dibuat sendiri dengan erlenmeyer yang dilengkapi dengan pengaduk magnet,
pemanas, dan pompa vacum.

b. Tujuannya untuk menghilangkan gas pada sampel yang akan dianalisis, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor yang akan mengacaukan
analisis.

5
4.

Panjang gelombang maks = 255 nm

0.7

0.62 0.6 0.61

0.6 0.59
0.56 0.55
0.52
0.5
0.47 0.48
0.44
0.4 0.4

0.3
0.26

0.2 0.21 0.21

0.19 0.18
0.15 0.16 0.14
0.1 0.09
0.05
0.03
0
200 250 300 350 400 450

Panjang gelombang maksimum yang digunakan di 255 nm dengan melihat nilai absorban
(konsentrasi) tertinggi 0.616 µg/mL.Dengan menggunakan Panjang gelombang maksimum pada
sampel yang akan diuji, maka kepekaannya juga maksimal karena perubahan absorbansi untuk
setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.

5.
a. Fase gerak yang digunakan adalah campuran penyangga aseton nitril dan ortho phosphoric
acid (50:50 v/v)
b. Tipe elusi dari fase gerak tersebut adalah elusi isokratik dimana komposisi fase gerak tidak
berubah selama analisis berlangsung
c. Fase diam yang digunakan adalah kolom Altima C18 (150 mm x 4.6 mm x 5µm)
d. Suhu analisis adalah 30oC
e. Kecepatan alir sebesar 1.0 mL/menit

6
f. Lama waktu analisis 10 menit
g. ʎmax yang digunakan 240 nm
h. Tipe detector yang digunakan adalah PDA detector
i. Analisis yang digunakan termasuk dalam analisis HPLC Fase Terbalik (Reverse Phase
HPLC). Pada jenis ini, fase diam yang digunakan bersifat non-polar dan fase geraknya bersifat
polar. Pemisahan terjadi karena komponen sampel yang bersifat kurang polar akan melewati
kolom lebih lama dibandingkan komponen sampel yang bersifat lebih polar. Fase diam yang
digunakan pada fase ini biasanya merupakan  hidrokarbon alkil non polar seperti rantai C-8 atau
C-18 yang terikat pada basis silika. Kolom C18 atau Oktadesil Silika (ODS) merupakan jenis
yang paling populer digunakan dalam HPLC. Fase gerak yang kerap digunakan pada fase
terbalik adalah campuran air dengan pelarut polar lain seperti Metanol, Asetonitril, atau
Tetrahidrofuran.

6. a. Dari data kromatogram yang disajikan terdapat kandungan senyawa Clopidogrel dengan
memiliki retention time (Rt) = 2.718 menit dan 0,43 AU

b. Waktu retensi Clopidogrel dipengaruhi oleh interaksi Clopidogrel dengan fase diam dan fase
geraknya atau dengan kata lain dipengaruhi oleh koefisien partisinya dari Clopidogrel terhadap
fase diam dan fase geraknya. Clopidogrel memiliki sisi polar dan sisi non polar pada strukturnya.
Pada analisa iini digunakan kromatografi partisi fase terbalik dimana fase gerak yang digunakan
lebih polar disbanding fase diam. Oleh karena itu, senyawa cenderung bersifat non polar
menyebabkan senyawa akan lebih lama melewati kolom sehingga waktu retensinya akan lebih
besar.

7
7. a.

Grafik Kurva Kalibrasi

3500000

3000000
f(x) = 47789.18 x + 141119.13
R² = 1
2500000
Mean AUC

2000000

1500000

1000000

500000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentration

b. Persamaan regresi linearnya adalah y = 47789X + 141119 dengan correlation number R 2=

0.9957

8. Kadar Sofobuvir (SOF) :

Dari grafik Sofobufir (SOF) Conc Vs Area diperoleh persamaan regresi linear y = 6759.1 X +
24800.

Dari hasil analisa sampel 1 memiliki peak area y = 2693211, kemudian nilai peak area sampel 1
ini dimasukkan ke persamaan regresi linear y = 6759.1 X + 24800 sehingga diperoleh nilai
konsentrasi X = 394,79 ppm.

Dari hasil analisa sampel 2 memiliki peak area y = 2686712, kemudian nilai peak area sampel 2
ini dimasukkan ke persamaan regresi linear y = 6759.1 X + 24800 sehingga diperoleh nilai
konsentrasi X = 393,83 ppm.

8
Dari hasil analisa sampel 3 memiliki peak area y = 2690798, kemudian nilai peak area sampel 3
ini dimasukkan ke persamaan regresi linear y = 6759.1 X + 24800 sehingga diperoleh nilai
konsentrasi X = 394,43 ppm.

Konsentrasi Sofobuvir (SOF) rata rata = (394,79 + 393,83+394,43) / 3 = 394,35 ppm

%kadar Sofobuvir (SOF)= 394,35 / 600 x 100% = 65,725%

Kadar Velpatasvir (VEL) :

Dari grafik Velpatasvir (VEL) Conc Vs Area diperoleh persamaan regresi linear y = 9824.1 X +
4791.2.

Dari hasil analisa sampel 1 memiliki peak area y = 966743, kemudian nilai peak area sampel 1
ini dimasukkan ke persamaan regresi linear y = 9824.1 X + 4791.2 sehingga diperoleh nilai
konsentrasi X = 97,9175 ppm.

Dari hasil analisa sampel 2 memiliki peak area y = 972077, kemudian nilai peak area sampel 2
ini dimasukkan ke persamaan regresi linear y = 9824.1 X + 4791.2 sehingga diperoleh nilai
konsentrasi X = 98,4605 ppm.

Dari hasil analisa sampel 3 memiliki peak area y = 974609, kemudian nilai peak area sampel 3
ini dimasukkan ke persamaan regresi linear y = 9824.1 X + 4791.2 sehingga diperoleh nilai
konsentrasi X = 98,7182 ppm.

Konsentrasi Velpatasvir (VEL) rata rata = (97,9175 + 98,4605 +98,7182) / 3 = 98,3654 ppm

%kadar Sofobuvir (SOF)= 98,3654 / 150 x 100% = 65,577%

C. Daftar Pustaka

1. Jurnal:

Arif Satria Wira Kusuma, Raisha Metantryana Hajar Ismanto. 2016. Penggunaan Instrumen
High-Performance Liquid Chromatography sebagai Metode Penentuan Kadar Kapsaisin
pada Bumbu Masak Kemasan “Bumbu Marinade Ayam Special” Merek Sasa. Farmaka.
ISSN: 1693-1424

9
2. Makalah dan Website:

Ahmad Ikhawan Habibi. 2015. Instrumen Kimia HPLC. Semarang : Universitas Islam Negeri
Walisongo.

Anonim. Bagian-Bagian HPLC Laboratorium Yang Perlu Diketahui.

https://andarupm.co.id/bagian-bagian-hplc-laboratorium/ diakses tanggal 20 Oktober 2021.

3. Website:
Nurya, Khusna. Fungsi Komponen KCKT. https://nuryakhusna12.wordpress.com/kckt/fungsi-
komponen-kckt/ . Diakses tanggal 20 Oktober 2021.
4. Buku
Suhartati, Tati. 2017. Dasar-Dasar Spektrofotometri UV-VIS dan Spektrometri Massa Untuk
Penentuan Struktur Senyawa Organik. Bandar Lampung: Aura CV Anugrah Utama Raharja.
5. Website.
Elsa. Jenis-Jenis HPLC dan Aplikasinya dalam Analisis. https://news.labsatu.com/jenis-jenis-
hplc-dan-aplikasinya-dalam-analisis/ diakses tanggal 20 Oktober 2021.

6. Makalah

Nugroho, Benny. 2011. Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada
Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar Merek
Rheumakur. Skripsi. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma.

7. Makalah

Nugroho, Benny. 2011. Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada
Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar Merek
Rheumakur. Skripsi. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma.

8. Makalah

10
Nugroho, Benny. 2011. Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada
Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar Merek
Rheumakur. Skripsi. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma

11