SPEKTROFOTOMETRI

UV - VISIBEL
 INSTRUMENTASI
SINGLE BEAM
DOUBLE BEAM
 REM
• REM → UV & sinar tampak (Vis) : energi yg
merambat berbentuk gelombang

~
• 1 panjang gelombang, satuan nm = 10-7 cm =
10 A°.
• Frekuensi (ν), jumlah gelombang/detik, satuan
Hertz (Hz)
• E = h.ν
• ν = c/λ
• E = h.c/λ

E = energi radiasi cahaya

h = tetapan planck, 6,626 x 10-34 joule
c = kecepatan cahaya, 3 x 1010 cm/detik
λ = panjang gelombang
 Spektrum elektromagnetik

λ UV = 200-400 nm
λ Vis = 400-750 nm
 Penyerapan REM
• Molekul mempunyai energi : 1. tranlasi 2.
vibrasi 3. rotasi 4. elektronik

• E = Etrans + Evib + Erot + Eelek

• Jika molekul terkena REM dg frekuensi = E

molekul pd level yg lebih tinggi → terjadi
absorbsi energi oleh molekul
• E2 – E1 = h.ν

E2 = energi pd tk lebih tinggi

E1 = energi pd tk lebih rendah

E2
h.ν

E1
e – yg terlibat pada radiasi uv & vis
1. Elektron sigma (σ)
Orbital yg sebabkan terjadinya ik. Tunggal.

2. Elektron phi (π)

Ik. Rangkap dalam molekul, terdapat 2 macam
orbital molekul, orbital σ dan π (mempunyai
sepasang e- )

3. Elektron non bonding (n)

Tidak ikut dalam pembentukan ikatan dlm
molekul, ada pada atom N,O,S dan halogen.
Transisi elektronik dalam molekul
1. Transisi sigma – sigma bintang (σ → σ*)
Energi yg dibutuhkan frekuensinya < 180 nm

2. Transisi non bonding– sigma bintang (n → σ*)

Energinya lebih kecil dibanding σ → σ* shg λ
yg diserap lebih panjang (150-250 nm), tetapi
kebanyakan < 200 nm.
3. Transisi n --> π* dan π --> π*
Untuk gugus fungsi tdk jenuh, λ 200 – 700 nm,
cocok utk analisis pd spektrofotometer uv-vis.
 Kromofor & Auksokrom
• Kromofor : Struktur tertentu dalam molekul yang
menyebabkan absorbsi REM (gugus tak jenuh yg
dpt menjalani transisi n --> π* dan π --> π*)

• n --> π* contoh : C=O, C=OR, COOR.

• Auksokrom : gugus yang mengintensifkan

absorbansi. Hanya dpt menjalani transisi n --> π*
& n → σ*
• Contoh : -OH, -OR, -NH2 , -NHR, -X
 Analisis kualitatif
• Data yang dipakai : λmax, intensitas, efek pH,
pelarut.

• Harus digabung dg data lain : spektroskopi

massa, spektroskopi IR, NMR.

• Data dibandingkan dg data yg telah

dipublikasikan (buku/jurnal penelitian)
 Analisis Kuantitatif
• Berkas REM dikenakan pd larutan sampel
(cuplikan) dan intensitas REM yg diteruskan
diukur besarnya.

• Radiasi yg diserap cuplikan → ditentukan dg

membandingkan intensitas sinar yang
diteruskan dg yg diserap.
• T = I/I0
• A = log 1/T = log (I0/I)
T, transmitan ; A, Absorbansi ; I0, Intensitas cahaya
masuk ; I, Intensitas cahaya yg telah melewati
cuplikan

• Bila larutan pada sel dg ketebalan [db], dikenakan

suatu sinar monokromatik → maka penurunan
intensitas sinar [dl] BERBANDING LANGSUNG dg
intensitas radiasi [l], konsentrasi unsur yang
menyerap [c], dan dg ketebalan sel [db].
• Contoh : Ekstingsi Molar suatu senyawa besi =
12.000 M-1cm-1 , absorbansi min. yang dibaca
0,02. jika kuvet tebalnya 1 cm, berapa
konsentrasi minimal yg dapat di deteksi ?

→A = ε.b.c → 0,02 = 12.000 x 1 x c

→C = 0,02/12.000 = 1,6 x 10-6 M.
• Parasetamol pada pelarut metanol
mempunyai A11 = 468 pada λ 247 nm. Berapa
kadar (bpj) yang harus dibuat agar
Absorbansinya minimal 0,15 ?

→A = A11.b.c → 0,15 = 468 (g/100ml) x 1 x c

→C = 0,15/468 = 3,21 x 10-4 g/100ml x 10000
→C = 3,21 mg/1000ml = 3,21 bpj.
 Prosedur Analisis
Scanning Panjang Gelombang
 Analisis analit tunggal
• Suatu seri konsentrasi larutan baku Vs
Absorbansinya pada λmax, suhu & pelarut yg
sama → sesuai HK. Lambert-Beer : jika
memberikan garis lurus → dilihat nilai r (≥
0,999 / ≥ r tabel) dan VX0 (≤ 2% atau 5%)

• dari persamaan garis, y = bx + a

b = slope a = intersep (perpotongan garis
dg sumbu y)
Abs Rentang Analisis

Y = bx + a

[ ] ppm

SX0 = Sy/x/b
Pembuatan kurva baku

Konsentrasi [ppm] Absorbansi pd λ terpilih

k1 0,2
Y = bx + a
r=…
k2 0,4
VX0 = …
k3 0,6
k3 0,8

Penentuan LOD & LOQ

LOD = 3. Sy/x/b

LOQ = 10. Sy/x/b

LOD & LOQ pada spektrofotometri UV-Vis tidak digunakan/ditentukan

karena sudah mengacu pada rentang Absorbansi 0,2 – 0,8
 x y

Y = 0,0456 X + 0,0231
y = bx + a
=b
Akurasi

Dibuat kadar tertentu analit → dilakukan preparasi seperti pada sampel →

ditentukan kadarnya, dan dibandingkan dg kadar sebenarnya ( % rekoveri)
persyaratan : 98-102%; 97-103%; 90-110 %.

Presisi

Dibuat kadar tertentu analit pada kadar rendah, tengah, dan tinggi / 50%,
100%, dan 150% dari kadar yg diperiksa dengan replikasi minimal 6 x.
Rata-rata replikasi masing2 kadar → persyaratan ≤ 5%.
 Analisis Campuran 2 Analit

• 2 analit dapat dianalis bersama-sama jika 2

λmax analit tidak saling mengganggu
/gangguannya kecil.

• Pengukuran dilakukan pada masing2 larutan

dan pd masing2 λmax → konsentrasi masing2
analit dapat dihitung.
Spektrum 2 komponen (analit)

λ1
λ2
Abs analit 1: A1= a1b1c1 = a1c1
Abs analit 2: A2= a2b2c2 = a2c2

Pengukuran 2 analit dilakukan pd λ1 & λ2 :

A λ1 = (a11.c1) λ1 + (a21.c2) λ1 ……… (1)
A λ2 = (a12.c1) λ2 + (a22.c2) λ2 ……… (2)
 Pengukuran Absorbansi

λ1 = …… nm λ2 = …… nm
Blank
Std 1 seny1
Std 2 seny1
Std 3 seny1
Std 4 seny1 a11 a12
Std 1 seny2
Std 2 seny2
Std 3 seny2
Std 4 seny2 a21 a22
Larutan sampel
Menentukan ekstingsi molar (ε)

Senyawa (analit) 1 Senyawa (analit) 2

ε pd λ1
ε pd λ2

Absorbansi campuran senyawa/analit pada λ1 dan λ2; ε pd λ1

Seny 1 & seny 2; ε pd λ2 Seny 1 & seny 2 → dimasukkan dalam
persamaan (1) & (2)

➔ Konsentrasi senyawa 1 & 2 didapatkan.

 Contoh soal
• Senyawa 1, 10-4 M pd λ420 nm absorbansinya
0,982 & 0,216 pada λ505 nm. Senyawa 2, 2.10-
4 M pd λ420 nm absorbansinya 0,362 & 1,262

pada λ505 nm. Absorbansi campuran senyawa

1 & 2, 0,820 pada λ420; dan 0,908 pada λ505.
berapa konsentrasi senyawa 1 dan 2 ?
 Spektrofotometri derivatif
• Zero crossing
• dA/dλ

• nilai dA/dλ diperoleh dengan membagi delta

absorbansi (ΔA=Aλ2- Aλ1) dengan delta
panjang gelombang (Δλ)

• Δλ yang digunakan adalah 3 nm

Derivat pertama
Derivat kedua
Derivat ketiga
• dari spektra derivat ketiga dari larutan murni
parasetamol, salisilamida dan kafein

• terlihat zero crossing parasetamol dan

salisilamida pada 271,3 nm dimana
parasetamol dan salisilamida memiliki d3A/dλ3
bernilai nol sedangkan kafein memiliki d3A/dλ3
bernilai negatif
• Berdasarkan panjang gelombang zero crossing
yang diperoleh pada 271,3 nm → dibuat seri
kadar larutan baku kafein yang diukur nilai
d3A/dλ3 (serapan derivat ketiga) pada λ271,3
nm.
• Konsentrasi dan nilai d3A/dλ3 serapan kafein
dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier
Kurva baku derivat ketiga
Kadar d3A/dλ3
(mg%)

0,7434 -1,185x10-4
1,2390 -2,15x10-4
1,7346 -3,4x10-4
2,2302 -4,74x10-4
2,7258 -5,63x10-4
3,2214 -7,26x10-4

r -0,99744
B -2,43024x10-4
A 7,568809x10-5
SD 2,1005x10-4
• Kadar terukur kafein diperoleh dengan
memasukkan nilai d3A/dλ3 serapan sampel
campuran pada panjang gelombang zero
crossing ke dalam persamaan kurva baku
kafein.
 Akurasi & Presisi
• Dari data 6 kali replikasi sampel diperoleh data
recovery dan presisi sebagai berikut:
Sampel Kadar Benar (mg%) Kadar Terukur (mg%) Recovery (%)
yg dibuat olh alat ukur/bnr x 100%
1 25,48 24,245 95,153
2 25,19 24,297 96,455
3 24,67 24,075 97,588
4 25,43 25,312 99,535
5 25,05 26,302 104,998
6 25,15 26,817 106,628

Rata-rata 25,175
SD 1,168
SE 0,477
%CV 1,895%
Rentang recovery 95,153-106,628
• Metode peak to peak

- Spektrum serapan larutan baku kafein dan sampel

dibuat spektrum derivatif pertama

- Spektrum derivatif pertama dibuat dengan

memplotkan dA/dλ terhadap panjang gelombang
(λ)

- Amplitudo diperoleh dari selisih serapan 2 panjang

gelombang yang berderet teratur dibagi Δλ
• Panjang gelombang peak-to-peak ditentukan dari
penggabungan spektrum derivatif larutan baku
kafein dan sampel

• dicari daerah panjang gelombang dimana

terdapat spektrum yang saling berhimpitan satu
sama lain secara total → menghasilkan puncak
maksimum dan puncak minimum.
Derivat pertama
Derivat kedua

hampir
Derivat ketiga

hampir
Derivat ke-empat

berhimpit
• Pada derivatif ke-4 → terdapat spektrum
saling berhimpitan total → menghasilkan
puncak maksimum (281 nm) & puncak
minimum (282 nm)

• λ281 – 282 nm → sbg λ peak to peak

• Persamaan kurva baku menyatakan hubungan

linier antara konsentrasi dan amplitudo peak-
to-peak (d4A/dλ4)
Kurva baku kadar vs amplitudo der. Ke-
4
Kadar d4A/dλ4
(mg %) x y

0,4944 0,002
0,7416 0,007
0,9888 0,008
1,4832 0,015
1,9776 0,030
A = -0,0078
B = 0,0178
r = 0,9716
• Pada penetapan kadar kafein dalam sampel
campuran → Amplitudo diukur dengan cara
menghitung jarak vertikal antara puncak
maksimum di 281 nm dan puncak minimum di
282 nm pada spektrum derivatif keempat
 Pustaka
• Handbook Pharmaceutical Analysis, 2002, John H. Miyawa and Stephen G.
Schulman, Editor: Lena Ohannesian and Antony J. Streeter, Marcel Dekker,
Inc, New York.
• Pharmaceutical Drug Analysis, 2005, Ashutosh Kar, New Age International,
Ltd. Publisher, New Delhi.
• Moffat A.C., Osselton M.D., Widdop B., 2011, Clarke’s Analysis of Drugs
and Poisons, in Pharmaceuticals, Body Fluids and Postmortem Material,
4th Ed., Pharmaceutical Press, Illinois.
• Kimia Farmasi Analisis, 2007, Sudjadi dan Abdul Rohman, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
• Penetapan Kadar Kafein Dalam Campuran Parasetamol, Salisilamida, dan
Kafein Secara Spektrofotometri Derivatif, M.G. Devi Wulandari, Regina
Dinta Friamita, Christine Patramurti, Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta