SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET

DAN TAMPAK (VISIBEL)

Oleh : Definingsih Yuliastuti

Prodi S1-Farmasi
Stikes Paguwarmas
Maos-Cilacap
 PENDAHULUAN
• Sinar Ultraviolet (UV) dan Sinar tampak (Visibel) merupakan
salah satu dari Radiasi Elektromagnetik.
• Panjang gelombang (Lambda (λ)) merupakan jarak linier dari
suatu titik pada satu gelombang ke titik yg bersebelahan pd
gelombang yg berdekatan.
• Dimensi panjang gelombang adalah panjang (L) yg dpt dinyakatan
dlm (cm), atau yg lebih umum dalam unit2 berikut :
Satuan
1 Å = 1 angstrom = 10-10 m = 10-8 cm
1 µ = 1 mikron = 10-6 m = 10-4 cm = 104 Å
1 mµ = 1 milimikron = 10-9 m = 10-7 cm = 10 Å
1 nm = 1 nanometer = 10-9 m = 10-7 cm = 10 Å = 1 mµ
Panjang gelombang pada daerah UV dan Vis biasanya dinyatakan
dalam satuan “nm”
 Daerah UV dan Daerah Vis
1. Daerah UV (ultraviolet)
200 – 400 nm  dapat dideteksi dengan film
(150-72 kcal mol-1) fotografik atau sel fotolistrik
Sumber sinar
 lampu “hydrogen - discharge”  the high-voltage
(180 – 400 nm)
 lampu “deuterium-discharge”
2. Daerah Vis (visibel)
400 – 800 nm  batas sensitif mata
(72-36 kcal mol-1)

Sumber sinar
 lampu “tungsten- filament”
(400 – 800 nm)
3
 Spektrofofometri

Teknik analisis yang berhubungan

dengan
penggunaan cahaya
untuk
Mengukur konsentrasi bahan kimia

4 SPECTRO-2016
 Akan dipelajari:

 Prinsip dasar penyerapan radiasi

cahaya oleh suatu molekul [obat]

 Bagaimana proses tersebut diguna-

kan dalam analisis kualitatif dan
kuantitatif ?

5 SPECTRO-2016
 Spektrofotometer

alat yang digunakan untuk

mempelajari
absorpsi (penyerapan)
atau
emisi (pancaran)
radiasi elektromagnetik/cahaya
oleh suatu molekul
[ sebagai fungsi panjang gelombang ]
6 SPECTRO-2016
 Radiasi elektromagnetik
• Radiasi elektromagnetik, atau sinar
 suatu bentuk energi radiasi,
memperlihatkan sifat partikel dan gelombang

• Sifat gelombang, tergambar pada sifat optik radiasi

elektromagnetik, yaitu difraksi

• Sifat partikel, atau foton, tergambar pada proses

interaksi radiasi elektromagnetik dengan zat, yaitu
pada proses penyerapan dan emisi

7
 Interaksi antara sinar dan zat
dipantulkan
(reflection) sampel
dihamburkan
(Scattering)

sinar dari menuju detektor

sumber I
Io
diserap
(absorption)

Io = intensitas sinar sebelum mengenai sampel

I = intensitas sinar yang diteruskan

Perhitungan intensitas pita serapan

 menggunakan hukum Lambert dan Beer
8
Serapan sinar UV/Vis ditentukan oleh :
1. Kromofor : gugus atau atom dalam senyawa organik yg mampu
menyerap sinar UV dan visibel.
a.l : >C=C<, >C=O, -N=N-, -N=O,  mempunyai multiplet
bonding (Shimadzu,4.4.1)
-NO2, -C=C-
Kromofor biasanya mengandung “ bond”
2. Ausokrom : gugus fungsional yang tidak mempunyai serapan
a.l : -OH, -NH2, -SH, -OCH3  punya pasangan elektron yang tidak
, dan beberapa halogen terikat (Shimadzu,4.4.1)

Jika terikat dengan kromofor, gugus ini biasanya menyebabkan

pergeseran serapan ke arah  yang lebih besar (pergeseran
merah/batokromik) dan meningkatkan intensitas puncak serapan
(efek hiperkromik)
9
3. Ikatan terkonjugasi
Merupakan ikatan rangkap yg berselang – seling dg satu
ikatan tunggal. Molekul yg mempunyai ikatan rangkap
terkonjugasi akan mengalami pergeseran batokromik.
Contoh :
1,3-butadiena (H2C=CH-CH=CH2) punya pita serapan
max di 217 nm, sedangkan 1,5-heksadiena (H2C=CH-
CH2-CH2-CH=CH2) tidak terkonjugasi py serapan max di
187 nm.
 Aspek Kualitatif dan Kuantitatif
Spektrofotometri UV-Vis
1. Aspek Kualitatif
Data spektra jika digabungkan dg cara lain spt spektroskopi infra merah,
resonansi magnet inti dan spektroskopi massa dpt digunakan untuk analisis
kualitatif → data yg diperoleh : panjang gelombang max, intensitas, efek
pelarut.

2. Aspek Kuantitatif
- Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan
(larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yg diteruskan diukur besarnya.
- Radiasi yg diserap oleh cuplikan ditentukan dg membandingkan intensitas
sinar yg diteruskan dg intensitas sinar yg diserap jika tidak ad spesies
penyerap lainnya.
 Hukum Lambert-Beer
Kuantitas spektroskopi yg diukur biasanya adalah transmitans
(T) = I/Io
- log (I/ Io) = a.b.c
- log T = a.b.c
Kett : T = Transmitans,
I = Intensitas sinar mula-mula
Io = Intensitas sinar setelah melalui larutan

A = log (Io/I) A = log 1/T Kett : A= Absorbansi/serapan

log (Io /I) = a.b.c
A = abc
Kett : A = absorban
a = absorptivitas
b = tebal kuvet
c = konsentrasi
• Absoptivitas (a) merupakan konstanta yg tdk tergantung pd konsentrasi,
tebal kuvet, dan intensitas radiasi yg mengenai larutan sampel, tetapi
tergantung pd suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang
radiasi.
• Jika satuan c dalam molar (M) maka absorptivitas disebut
absorptivitas molar (ε)
• Selanjutnya persamaan Lambert-Beers menjadi
- log T = ε.b.c atau A = ε.b.c
Kett : A : Absorbansi (= serapan)
ε : molar absorptivitas (L mol-1 cm-1) atau (M-1 cm-1)
c : kosentrasi larutan (mol/L)
b : tebal sel ≈ tebal kuvet ≈ tebal larutan (cm)
nilai c biasanya hanya untuk larutan encer (c ≤ 0,1 mol/L)
- Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yg diteruskan oleh
larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi
larutan.
• Jika c dinyatakan dengan persen berat/volume (g/100 ml)
maka absorptivitas dapat ditulis dg E1%1cm dan juga seringkali
ditulis A1%1cm

• Hubungan antara nilai E1%1cm dengan absortivitas molar (ε)

adalah :
ε = E1%1cm x BM/10
• Contoh perhitungan
Absorptivitas molar kompleks besi (II)-1,10-fenantrolin adalah
12.000 M-1cm-1. Minimum absorbansi yg dapat dideteksi adalah
0,001 jika diukur pada suatu sel (kuvet) berketebalan 1 cm.
Berapakah konsentrasi minimum kompleks besi (II)-1,10-
fenantrolin yg dapat dideteksi ?
Jawab :
Dengan menggunakan persamaan : A = ε.b.c , maka akan diperoleh :
0,001 = 12.000 M-1cm-1x 1 cm x c
c = 0,001
12.000 M-1cm-1 x 1 cm
c = 8,3 x 10-8 M
Sehingga c (minimum yg dapat dideteksi) = 8,3 x 10-8 M
Larutan uji biasanya sangat encer (c ≤ 0,1 mol/L)
Jika pekat : yang dipantulkan, yang dihamburkan, yang diserap besar,
sedangkan yang diteruskan : kecil

Seharusnya adalah yang diteruskan : besar

Nilai maksimal absorbansi/serapan (A) adalah 1,0

 A yang digunakan : 0,2 – 0,8 [0,2 - 0,650]
atau T : 15 – 75%
Angka ini dipilih untuk meminimalkan “eror” dari alat

Untuk mengetahui apakah “daerah kerja” memenuhi hukum Lambert-

Beer  dibuat kurva baku
Kurva baku digunakan jika “r hitung > r tabel”
Nilai r yang dapat diterima r ≥ 0,999

kurva baku  jaminan kita bekerja dengan larutan encer

yang memenuhi hukum Lamber-Beer
Hal-hal yg harus diperhatikan dlm analisis Spektro UV-Vis

- Terutama untuk senyawa yg semula tdk berwarna yg akan dianalisis

dg spektrofotometri visibel
- Pembentukan molekul yg dpt menyerap sinar UV-Vis
Jika senyawa yg dianalisis tdk menyerap sinar, cara yg digunaka adalah dg
merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dg pereaksi ttt.

- Syarat pereaksi yg digunakan :

- Reaksinya selektif dan sensitif
- Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel (ajeg)
- Hasil reaksi stabil dlm jangka waktu yg lama
Keselektifan dapat dinaikkan dg mengatur pH, atau penggunaan teknik
ekstraksi.
- Misal : analisis obat gol sulfonamid (ex : Sulfioksazol) tidak
berwarna diubah menjadi senyawa berwarna setelah
didiazotasi dan dikopling dg naftil etilen diamin (NED).

Kelebihan asam nitrit dihilangkan dg penambahan asam

sulfamat (kl tdk dihilangkan, senyawa yg sudah berwarna akan
dirusak (dioksidasi) oleh asam nitrit sehingga kembali menjadi
tidak berwarna.
 Tahapan Kerja Analisis Pada spektrofotometri
UV dan Visibel

1. Mencari “Operating Time” (OT)

Tujuan :
mengetahui waktu dimana suatu proses reaksi
berlangsung stabil
Pada saat reaksi berlangsung stabil (=pada saat OT)
 diukur serapan larutan uji
Pengukuran pada saat reaksi berlangsung tidak stabil
 data yang diperoleh tidak menentu

19
2. Mencari  maksimum (maks)

Tujuan : untuk memperoleh serapan maksimum

Serapan maksimum diperoleh jika pengukuran dilakukan pada maks

Perubahan serapan per unit konsentrasi pada maks adalah sangat besar

“ semua yang terserap larutan uji idealnya juga terukur maksimal oleh
spektrofotometri “ sehingga diperoleh hasil uji yang maksimal.

maks harus dicari walaupun dalam prosedur

aslinya biasanya juga telah disebutkan
3. Membuat range kurva baku

• Membuat seri
konsentrasi vs
absorbansi senyawa
baku
• Range konsentrasi yang
dibuat harus
menghasilkan
absorbansi kisaran 0,2-
0,8
4. Mencari kadar zat dalam larutan uji
a. Larutan uji dalam kuvet yang telah dipersiapkan
diukur serapannya pada OT dan  maks yang
telah diketahui.
Dilakukan beberapa kali pengulangan pengujian
(minimal 3 replikasi).
b). Dengan bantuan kurva standar atau persamaan
garis linier yang diperoleh dapat diketahui kadar
zat dalam sampel.

22
 Sampel

Sampel (molekul, ion) yang diuji pada daerah UV atau

Vis biasanya berupa gas atau larutan dan ditempatkan
dalam sel atau kuvet

23
Blangko
• Serapan yang terukur oleh spektrofotometer tidak hanya serapan solut
dalam larutan uji melainkan juga semua molekul yang dilewati sinar.
Karenanya dibuat blangko, untuk mengkoreksi pantulan, hamburan
dan penyerapan oleh kuvet dan konstituen pada larutan uji.

Blangko dibuat dengan menempatkan konstituen (pelarut, reagen, dll)

pada larutan uji ke dalam kuvet. Dengan larutan blangko selanjutnya
rekorder diatur pada posisi T = 100% atau A = 0, pada  pengujian
serapan solut. Setelah itu baru dilakukan pembacaan serapan solut
dalam larutan uji.

24
 Kuvet
Untuk Vis  dari gelas atau kuarsa (quartz)
Untuk UV  harus dari kuarsa
Gelas menyerap sinar UV dengan kuat
Kuvet biasanya mempunyai panjang celah 1,0 cm
Kuvet dari kuarsa atau gelas dapat dibersihkan dengan dibilas
dengan air; jika perlu, dengan larutan deterjen atau
asam nitrat panas
Dibilas dengan etanol agar cepat kering
Dibilas untuk mencegah terjadinya penumpukan zat yang
mengabsorbsi pada permukaan kuvet

25
26
 Instrumen
Alat yg digunakan : Spektrofotometer
Penggolongan berdasarkan sistem optik
-- single beam
Sistem optik -- -- single detector
-- double beam --
-- double detector
Pada double beam,
sumber cahaya utama terbagi menuju 2 beam :
satu menuju kuvet (mengandung larutan sampel) dan satu
menuju kuvet (mengandung pelarut referensi/ larutan
blangko)

27
 Aplikasi UV/Vis
• Bidang lingkungan
(misal : analisis berbagai logam dalam air)
• Bidang industri
Bidang industri farmasi : analisis antibiotika, hormon,
vitamin, analgesik)
Bidang industri lain : analisis makanan
• Bidang Forensik
(misal : analisis narkotika, alkohol dalam darah)

28
 Contoh Soal
1. Penetapan kadar furosemid dalam tablet
Cara : 20 tablet ditimbang satu per satu untuk mengetahui keseragaman berat
tablet. Sebanyak 20 tablet furosemid ditimbang sekaligus dan mempunyai
berat 1,656 g. Serbuk dengan berat 419,0 mg digojok dengan 300 ml
NaOH 0,1 N untuk mengekstraksi furosemid yg bersifat asam, lalu di
encerkan sampai 500,0 ml dengan NaOH 0,1 M. Sejumlah ekstrak disaring
dan diambil 5,0 ml filtrat, lalu diencerkan dg NaOH 0,1 M sampai 250,0 ml.
Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 271 nm dan mempunyai
absorbansi sebesar 0,404; 0,434; 0,445. Kandungan furosemid yg
dinyakatakan dlm etiket, tiap tabletnya adalah 40 mg.
Hitunglah kandungan furosemid tiap tabletnya berdasarkan contoh soal
tersebut?
Hasil Kurva Baku :
C (µg/ml) Absorbansi
5 0,275
10 0,479
15 0,649
20 0,814

Dikett :
Persyaratan dlm farmakope = teblet furosemid mengandung furosemid tidak
kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yg tertera dlm
etiket
• Diket : Bobot rata2 tablet = 1,656 gram/20 = 82,8 mg
Didapat :
A = 0,1075
B = 0,0357
R = 0,9987
Y = 0,0357X + 0,1075
R tabel (95%) = 0,950 sehingga R hitung > R tabel (data Kurva Baku diterima)
Perhitungan kadar :
Y = 0,0357X + 0,1075
0,404 = 0,0357X + 0,1075
0,404-0,1075 = 0,0357X
X = 8,305 µg/ml
Kadar sebenarnya 1 = kadar sampel x vol x F.Pengenceran x Bobot rata2 tablet
bobot penimbangan sampel
= 8,305x 10-3mg/ml x 500 ml x (250/5) x 82,8 mg/tablet
419,0 mg
= 41,029 mg/tablet
Kadar 2 ??
Kadar 3 ??
Kadar rata2 ??
2. Penetapan kadar bahan baku sulfadiazin

Cara :
a. Timbang seksama 100,0 mg bahan baku sulfadiazin, masukkan ke dalam labu
takar 100 ml, tambahkan NaOH 0,5 N hingga tanda batas volume 100 ml
b. Pipet 200µl larutan, masukkan ke dalam labu takar 100 ml, tambahkan 5,0 ml
HCl 0,5 N dan 5,0 ml larutan NaNO3 0,1% b/v, biarkan selama 3 menit
c. Tambahkan 5,0 ml pereaksi sulfamat 0,5% b/v, biarkan hingga gelembung gas
hilang
d. Tambahkan 5,0 ml pereaksi NED.HCl 0,1 % b/v, tambahkan aquadest hingga
tanda batas volume 100 ml
e. Lakukan replikasi 3 kali
• Jika diketahui kurva baku sulfadiazin :
Konsentrasi (µg/ml atau ppm) Absorbansi
1,0 0,262
1,5 0,379
2,0 0,480
2,5 0,578
3,0 0,686
3,5 0,787
diperoleh absorbansi sampel :
Rep 1 : 0,353
Rep 2 : 0,386
Rep 3 : 0,382
Hitunglan masing2 kadar sampel dan hitung rata2 kadar sampel !
Rumus
% kadar =(Nilai “x” kurva baku) x vol x pengenceran sampel x potensi standar
Bobot penimbangan sampel

Diketahui potensi standar sampel sulfadiazin = 99,99%

Kett : Setarakan satuan dalam setiap hitungan !!!
TERIMA KASIH….