Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola

pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen berupa molekul
yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak akan melewati kolom yang
merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan
cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini,
berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah
komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan
detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut (Anonim, 2012).
Menurut Alimin (2007, hal: 75) keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah
a.

Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.

b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.

c.

Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.

d.

Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal dan
rumit.
Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi
sepanjang kolom (atau, seperti dalam kromatografi kertas atau lapis tipis, ekivalen fisik
kolom), dan tentu saja dasar pemisaha terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk
larutan yang berbeda. Kita boleh menganggap laju perpindahan sebuah zat terlarut sebagia
hasil dari dua faktor, yang satu cendrung menggerakkan zat terlarut itu dan yang lain
menahannya. Dalam proses asli tswett, kecendrungan zat-zat terlarut untuk menyerap pada
fasa padat menahan pergerakan mereka, sementara kelarutannya dalam fasa cair bergerak
cendrung menggerakkan mereka. Perbedaan yang kecil antara dua zat terlarut dalam kekuatan
adsorpsi dan dalam inetraksinya dengan pelarut yang bergerak menajdi dasar pemisahan bila
molekul-molekul zat terlarut itu berulang kali menyebar di antara dua fasa itu ke seluruh
panjang kolom (Underwood, 2002:487).

Faktor-faktor yang mempengaruhi Kromatografi adalah :

-

Kehadiran ion lain, misalnya danya klorida dalam pemisahan yang dilakukan dengan
larutan-larutan nitrat.

Keasaman larutan aslinya

Waktu melakukan percobaan

Adanya katio-kation lain dan konsentrasinya.

Sifat-sifat dari kepolaran noda adalah :

-

Tinta hitam dan tinta biru bersifat non polar

Tint merah, ekstrak mawar dan ekstrak pandan bersifat semi polar.

Tinta cumi bersifat polar.

Peralatan Kromatografi Kolom

Alat utama yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 5 cm
- 1 m. Pada bagian dasar tabung diberi semacam penyaring dari glass wool untuk
menghindari hilangnya fasa diam.
Fasa gerak
Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian rupa sehingga
faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan waktu dan
jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom dipilih
supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Eluen yang digunakan dapat
dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen
yang sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.
Fase gerak (mobile phase) merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun
berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak ini tidak hanya dalam bentuk cairan tapi juga
dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah
menguap (volatile) (Denikrisna, 2010).

Fasa diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya
berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam
berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas permukaan.
Fase diam (stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam
proses pemisahan dengan kromatografi karena adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi
perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fase diam dapat
berupa bahan atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya
dilapisi pada padatan pendukung (Denikrisna, 2010).
Adsorben
Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling
umum digunakan untuk kromatografi kolom. Ukuran partikel dari

adsorben sangat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati

kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk
kromatografi kolom tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel
yang lebih besar digunakan untuk komatografi kolom gravitasi. Alumina
lebih sering digunakan dalam kromtografi kolom dibanding kromtografi
lapis tipis. Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah
air yang dikandung. Caranya ialah dengan mengeringkan alumina pada
suhu 360 0C selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina kering tersebut
menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dari kadar
airnya dan dinyatakan dalam skala Brockman.
D. Pelarut
Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel
yang dapat menentukan keberhasilan pemisahan secaa kromatografi
kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan
mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang
terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama.
Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga
digunakan adalah pelarut mengelusi kolom. Dalam hal ini pelarut yang
pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk mengelusi
komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polar ditambahkan untuk
mengelusi komponen yang lebih polar juga.
E. Syarat-syarat Adsorben dan Pelarut
Harus memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbsi akan
semakin bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter adsorben.
Harus mudah diregenerasi
Tidak cepat kehilangan kapasitas serap

Pemilihan pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih

baik untuk memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan
elusi sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. kekuatan dari
zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.
Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan
pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa,
baik

pengotornya

maupun

hasil isolasinya.

Sebelumnya

dilakukan

percobaan tarhadap kromatografi lapis tipis sebagai pencari kondisi

eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik sehingga
antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna.
Jika kemurnian pelarut, temperature dan penjenuhan atmosfernya benar-benar dijaga, maka
harga Rf dipengaruhi antara lain oleh faktor-faktor berikut : (a) kehadiran ion lain, misalnya
adanya klorida dalam pemisahan yang dilakukan dengan larutan-larutan nitrat, (b) keasaman
larutan aslinya; ini dapat disebabkan oleh kebutuhan akan asam dalam pembentukan
kompleks yang dapat larut dalam pelarut organik, untuk mencegah hidrolisis garam, (c)

waktu melakukan percobaan untuk sepotong kertas; kadang-kadang harga-harga Rf mengikat

dengan bertambahnya waktu dan ini mungkin berpadanan dengan berkurangnya laju gerak
garis depan pelarut, (d) adanya kation-kation lain dan konsentrasi mereka

(Svehla,

1979:536).
Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat
padat aktif seperti alumino dan selika gel sebagai fase diam. Zat yang
dimasukan lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat
diserap dari larutan secara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita
sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda, sehingga
terjadi

pemisahan

kromatogram.
Pemisahan

dalam

dengan

kolom.

Hasil

kromatografi

pemisahan

kolom

biasanya

ini

disebut

digunakan

absorben yang paling umum : alumunium oksida (Al2O3) yang mempunyai

daya absorsi atau kereaktifan yang diatur secara cepat sehingga
penggunaan memberikan hasil yang baik. Seberapa jauh komponen itu
dapat diserap absorben tergantun pada sifat fisika komponen tersebut.
Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan
absorben, komponen cairan lainya akan mengalir kebawah . Jadi semakin
lemah kemungkinan cairan itu teradsopsi semakin cepat komponen itu
mengalir ke bawah. Bila kecepatan gerak cairan itu lebih besar dari pada
kecepatran absorbsi oleh absorben.
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan
daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji,
dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan
dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar
akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari
senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat.
Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap
berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa
tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan
khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom.

Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai
kemampuan untuk berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya,
teradsorpsi, atau bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi berdasarkan
perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan
untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), penetapan kadar (analisis kuantitatif), dan
pemurnian suatu senyawa (pekerjaan preparatif) (Soebagio, 2000:54).

CHLOROFORUM (Kloroform)
CHCl2

BM 119,38

Kloroform mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 99,5%
CHCl2, sisanya terdiri dari alcohol.
Pemerian: cairan jernih, tidak berwarna, mudah mengalir; mempunyai sifat khas;
bau eter; rasa mais dan membakar. Mendidih pada suhu lebih kurang 61 0
dipengaruhi oleh cahaya.
Kelarutan: sukar larut dalam air; dapat bercampur dengan etanol, dengan eter,
dengan benzene, dengan heksana, dan dengan lemak dan minyak menguap.
Bobot jenis: antara 1,476 dan 1,480, menunjukkan 99,0% sampai 99,5% CHCl 2.
Wadah dan penyimpanan: dalam wadah tetutup rapa, terlindung dari cahaya,
pada suhu tidak lebih dari 300.
Khasiat dan penggunaan: Antiseptikum umum; pengawet; zat tambahan
(Anonim,1995).
Senyawa kloroform adalah senyawa haloalkana yang mengikat tiga atom
halogen klor (Cl) pada rantai C-nya. Senyawa kloroform dapat dibuat dengan
bahan dasar berupa senyawa organik yang memiliki gugus metil (-CH 3) yang
terikat pada atom C karbonil atau atom C hidroksi yang direaksikan dengan
pereaksi halogen (Cl2). Beberapa senyawa yang dapat membentuk kloroform dan
senyawa

haloform

lainnya

adalah

etanol,

2-propanol,

2-butanol,

etanol,

propanon, 2-butanon. Halogenasi sering berjalan secara eksplosif dan hampir

tanpa kecuali menghasilkan campuran produk, karena lasan inilah halogenasi
kadang saja digunakan dalam laboratorium.

Rumus struktur kloroform

Kloroform disebut juga haloform disebabkan karena brom dan klor juga
bereaksi dengan metal keton, yang menghasilkan masing-masing bromoform
(CHBr3) dan kloroform (CHCl3). Hal ini disebut CHX3 atau haloform, maka reaksi
ini sering disebut reaksi haloform (Anonim,2010).

b.

Etanol
Etanol, disebut juga etil alkohol, alkohol murni, alkohol absolut, atau alkohol
saja, adalah sejenis cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak
berwarna, dan merupakan alkohol yang paling sering digunakan dalam
kehidupan sehari-hari.
Etanol termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia
C2H5OH dan rumus empiris C2H6O. Ia merupakan isomer konstitusional dari
dimetil eter. Etanol sering disingkat menjadi EtOH, dengan "Et" merupakan
singkatan dari gugus etil (C2H5).

Rumus struktur etanol

Etanol banyak digunakan sebagai pelarut berbagai bahan-bahan kimia yang
ditujukan untuk konsumsi dan kegunaan manusia. Contohnya adalah pada
parfum, perasa, pewarna makanan, dan obat-obatan. Dalam kimia, etanol adalah
pelarut yang penting sekaligus sebagai stok umpan untuk sintesis senyawa kimia
lainnya. Dalam sejarahnya etanol telah lama digunakan sebagai bahan bakar.
Etanol adalah cairan tak berwarna yang mudah menguap dengan aroma
yang khas. Ia terbakar tanpa asap dengan lidah api berwarna biru yang kadangkadang tidak dapat terlihat pada cahaya biasa.
Sifat-sifat fisika etanol utamanya dipengaruhi oleh keberadaan gugus
hidroksil

dan

pendeknya

rantai

karbon

etanol.

Gugus

hidroksil

dapat

berpartisipasi ke dalam ikatan hidrogen, sehingga membuatnya cair dan lebih

sulit menguap dari pada senyawa organik lainnya dengan massa molekul yang
sama.
Pasir
Pasir adalah contoh bahan material butiran. Butiran pasir umumnya
berukuran antara 0,0625 sampai 2 milimeter. Materi pembentuk pasir adalah
silikon dioksida, tetapi di beberapa pantai tropis dan subtropis

umumnya

dibentuk dari batu kapur (Anonim,2010).

Faktor Retardasi (Rf), merupakan parameter karakteristik kromatogrfi kertas dan kromatogrfi
lapis tipis. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatogrfi
dan pada kondisi tetap merupakan besaran karakteristik dan reproduksibel.

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak

digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam

jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering
digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua
macam (Hargono, 1986):
1. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapaskemudian
ditambahkan cairan pengelusi.
2 hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat,
setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran
ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai
diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur
tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai
fraksi-fraksi.
Kolom dapat dibuat dari berbagai jenis material, seperti stainless steel, aluminium,
tembaga, gelas dan paduan silika. Sebagian besar sistem kolom modern terbuat dari gelas
atau paduan silika. Kolom konvensional dibuat dari material pendukung yang dilapisi fase
diam dari berbagai pembebanan yang dikemas di dalam kolom. Kolom kapiler terdiri dari
tabung kapiler panjang yang didalamnya dilapisi dengan fase diam (fase diam dapat juga
direkatkan langsung pada permukaan silika). Sebagian besar kolom kapiler terbuat dari
paduan silika yang dilapisi polimer di bagian luarnya. Paduan silika sangat mudah pecah
sedangkan lapisan polimer tersebut bertindak sebagai pelindungnya (Seno, 1997).
Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen kimia
untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya
gravitasi. Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaloran karena gaya tarik bumi
(gravitasi) atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan
kran.
Kelebihan kromatografi kolom :

1.

Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative

2.

Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran

3.

Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi

Kekurangan kromatografi kolom :

1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat
untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas
yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair,
ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya adlah 2530 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam pemisahan
senyawa-senyawa organic dan konstituen-konstituen yang sukar menguap sedangkan untuk
pemisahan jenis logan-logam atau senyawa anorganik jarang dipakai (Yazid, 2005, hal: 98).
. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi
yangakan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom
secarakontinyu sedikit demi sedikit
Pengisian harus dilakukan secara hat-hati dan sepadat mungkin agar rata
sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas
biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok. Sejumlah cuplikan yang dilarutkan
dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom dan dibiarkan mengalir ke
dalam adsorben. Slurry dimasukkan dengan hati-hati kedalam kolom kromatografi yang
telah diisikan n-heksan yang sebelumnya telah disumbat dengan kapas dan kertas saring yang
berfungsi sebagai penahan adsorben agar tidak keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus
dikerjakan secara seragam dan sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembunggelembung udara. Jika terdapat gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan
berpotensi menyebabkan pecahnya kolom.

Hal lain yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan
menambahkan eluen secara kontinu agar udara tidak masuk kedalam kolom. Kolom yang
padat diindikasikan dengan warna slurry yang semakin memutih dan kecepatan alir eluen
yang semakin lambat. Jika kolom sudah memadat, larutan sampel kemudian diisikan kedalam
kolom . Mekanisme yang terjadi pada kromatografi kolom ialah sample akan terelusi oleh
eluen (n-heksan) melalui fase diam silika gel. Senyawa organik terelusi oleh eluen proses
elusi terjadi karena keseimbangan distribusi zat analit pada fase gerak n-heksan dan fase diam
selika gel. Elusi terus berlangsung hingga tidak ada lagi yang tinggal dalam kolom. Proses
elusi ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung banyak betakaroten.

Pengisian dilakukan dengan bantuan batang pemanpat (pengaduk) untuk memanpatkan

adsorben dengan gelas wool pada dasar kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati
dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara. Untuk
membantu homogenitas pengepakan biasanya kolom setelah diisi divibrasi, diketok-ketok
atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu

Ketika kolom tidak ditambahkan metanol, ekstrak membutuhkan waktu lama untuk
menuruni kolom (proses fraksinasi lama), tetapi ketika ditambahkan metanol komponenkomponen ekstrak sangat sangat cepat menuruni kolom. Hal ini terjadi karena perbedaan
kepolaran antara metanol dan kloroform, dimana metanol lebih polar daripada kloroform
sehingga metanol mempunyai kemampuan berikatan lebih besar dengan ekstrak. Ini berarti
kloroform harus dijerap secara kuat pada silika gel dibandingkan dengan metanol sehingga
metanol lebih dahulu menuruni kolom. Fase gerak kloroform menghasilkan 4 fraksi. Fraksi
pertama berwarna kuning, kedua berwarna keruh kehijauan, ketiga berwarna bening
kekuningan, dan keempat warna bening kekuningan. Sedangkan pada fase gerak metanol
menghasilkan 3 fraksi, yaitu fraksi pertama berwarna hitam kehijauan, kedua hijau
kekuningan, dan ketiga kuning kecoklatan.

Komponen-komponen dalam campuran diadsorpsi dari larutan secara

kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom.
Dengan penambahan pelarut secara terus-menerus, masing-masing komponen akan
bergerak turun melalui kolom dan pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan
baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan
dikatakan tetap apabila suatu komponen yang satu dengan yang lainnya bergerak ke
bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi
pemisahan (Yazid, 2005, hal: 200-2001).
Dengan adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap,
keterikatan komponen terhadap pelarut dan keterikatan masingmasing komponen terhadap fase diam akan berubah-ubah, sesuai
dengan sifat-sifat masing-masing komponen..

Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan molekulmolekul komponen untuk melarut dalam cairan, melekat pada permukaan padatan
halus, bereaksi secara kimia dan terekslusi pada pori-pori fasa diam. Komponen yang
dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk
berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi atau
bereaksi secara kimia. Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang
menyusun suatu sampel.
Pemisahan bergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka diantara
butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fasa
bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk
teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya
secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada
fasa bergerak (Yazid, 2005, hal: 100).
Komponen-komponen dalam campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom, dengan penambahan pelarut (eluen)
secara terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada
bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen
campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan
lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda
sehingga terjadi pemisahan. Jika kolom cukup panjang dan semua parameter pemisahan
betul-betul terpilih seperti diameter kolom, adsorben, pelarut dan kecepatan alirannya, maka
akan terbentuk pita-pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap
zona yang keluar dari kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain
keluar dari kolom.

Metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak
sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan
pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yangcukup lama,
bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang
jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita
komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang
lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi,
ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam
relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan
fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas
permukaan fasa diam bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak
atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai
tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar
meregenerasi fasa diam (Hendayana, 2006, hal: 2-3).
Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing
komponen diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat)
lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat dari pada komponen yang tertahan lebih
kuat. Perbedaab gerakan antara komponene yang satu dengan yang lain disebabkan olehn
perbedaan dalam adsorben, partisi, kelarutan atau penguapan diantara dua fase. Jika
perbedaan-perbedaan ini cukup besar maka akan terjadi ppemisahan secara sempurna.
Dalam kromatografi hubungan suatu molekul komponen sampel yang tertahan atau
terditribusi diantara fase diam dan fase gerak dapat di tulikan dalam berbagai istilah. Istilahistilah yang sering dijumpai dalam kromatogrfi adalah :
-

Kesetimbangan ditribusi = Kesetimbangan yang terjadi pada kromatogrfi bersifat dinamis.

Molekul sampel atau zat terlarut berada bolak-balik diantara fase diam dan fase gerak,
sehingga konsentrasi rata-ratanya mengikuti hokum dinamis.

. Faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi proses pemisahan?

Jawab :
- Pemilihan adsorben sebagai fase diam
- Kepolaran pelarut yang akan dipisahkan
- Laju elusi atau aliran fase gerak
Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fasa
bergerak yang ditambahkan secara kontinu, akibatnya hanya komponen yang
mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan.
Komponen afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut.
Pada kromatografi adsorpsi, besarnya koefisien distribusi sama dengan konsentrasi zat

terlarut

pada

fasa

teradsorpsi

dibagi

konsentrasinya

pada

fasa

larutan.

Ketergantungan jumlah zat terlarut yang teradsorpsi terhadap konsentrasi zat terlarut
dalam larutan dinyatakan dengan isoterm adsorpsi Langmuir (Yazid, 2005, hal: 100).

Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat:

- Daya serap adsorben.
- Sifat pelarut.
- Suhu sistem kromotografi.
Kecepatan turunan sampel dipengaruhi oleh :

Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat.

Panjang absorben, makin panjan makin cepat turunnya senyawa.

Ukuran artikel absorben.

Rongga udara dalam absorben.

Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan
terganggu.
Faktor yang mempengaruhi proses pemisahan:

Daya serap adsoben.

Jenis / sifat eluen.

Suhu kromatografi.

Pelarut yang digunakan.

Untuk lebih memastikan tingkat kemurnian dari hasil pemisahan

dapat kita uji dengan metode Kromatografi Lapisan Tipis. Hasil yang ada
pada masing-masing vial tersebut kita uji dengan KLT sehingga bisa kita
lihat apakah pada masing-masing benar-benar hanya mengandung satu
komponen.

Kloroform digunakan sebagai pelarut untuk mendeteksi noda karena ketika senyawa organik
dijerap oleh kloroform pada plat, untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti dimana
semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Senyawa organik dan metanol mempunyai kepolaran yang hampir sama karena semakin
dekat kepolaran antara sampel dan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fasa gerak.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :

1. Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
2. Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
3. Lempeng yang tidak rata
Nilai Rf digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan
derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor
retensi.

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Dari hasil percobaan yanh dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Prinsip dasar kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis adalah pemisahan senyawa
menjadi komponen-komponennya berdasarkan perbedaan kecepatan perpindahan masing2.

masing komponen diantara dua fasa

Pada kromatografi kolom diperoleh delapan fraksi eluen yang memiliki warna fraksi yang
semakin pekat dan pada kromatografi lapis tipis diperoleh suatu campuran yaitu 2,4,6trinitrofenol.