KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Lisna Dewi , M.Si.

 ANALISA KROMATOGRAFI

• Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling banyak digunakan

• Kromatografi adalah pemisahan suatu campuran senyawa-senyawa menjadi
komponen-komponen yang terpisah.
• Pemisahan cuplikan menjadi komponen-komponen individual memudahkan untuk identifikasi
(kualitatif) dan mengukur kadar (kuantitatif) dari bermacam-macam komponen cuplikan.

21/12/2022 2
• Kromatografi pertamakali diperkenalkan oleh : Michael Tswett (Rusia) tahun 1906
• Berasal dari bahasa Yunani :
kromatos = warna
graphos = menulis

• Proses kromatografi berdasarkan perbedaan distribusi senyawa penyusun campuran

diantara dua fasa
• Satu fasa tetap tinggal pada sistem disebut : fasa diam (fasa stationer)
• Fasa lain memperkolasi melalui celah-celah fasa diam disebut : fasa gerak (fasa mobil)

21/12/2022 3
 PRINSIP KROMATOGRAFI

• Kecenderungan zat untuk larut dalam suatu cairan

• Kecenderungan zat untuk teradsorpsi pada butir zat padat yang halus
dengan permukaan luas (adsorben)
• Kecenderungan zat untuk menguap
 ISTILAH PENTING

1. Polaritas
2. Partisi
3. Adsorpsi
 POLARITAS

• Menunjukkan adanya pemisahan kutub muatan positif dan negatif dari suatu molekul sebagai akibat
terbentuk konfigurasi tertentu dari atom-atom penyusunnya
• Molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul lain yang mempunyai polaritas
• Tingkat pemisahan dari molekul-molekul tersebut menentukan polaritas dan daya tariknya
Polaritas digunakan sebagai petunjuk sifat:
• Pelarut/solven
• Adsorben
• Zat yang dipisahkan/solut

PRINSIP LIKE DISSOLVES LIKE

• Pelarut polar cenderung melarutkan solut polar
• Adsorben polar cenderung mengadsorbsi solut polar
 PARTISI

• Proses partisi tergantung dari daya larut solut dalam dua macam cairan
• Peka terhadap perbedaan BM solut
• Zat yang terdiri dari satu seri deret homolog paling baik dipisahkan dengan kromatografi
partisi
• Misal: pemisahan berbagai jenis asam amino, asam lemak, gula
 ADSORBSI

• Peka terhadap bentuk stereometri dari solut yang dipisahkan

• Banyaknya solut yang dapat diadsorbsi pada permukaan adosrben tergantung dari konfigurasi
solut
• Kemampuan untuk diadsorbsi menentukan kemudahan solut untuk dipisahkan dengan
kromatografi adsorbsi
• Cocok untuk memisahkan campuran solut yang serupa tetapi mempunyai perbedaan bentuk
sterometrik
 KLASIFIKASI KROMATOGRAFI

Pengelompokan kromatografi :
1. Berdasarkan fasa yang digunakan (fasa diam dan fasa gerak)
• Kromatografi gas
• Kromatografi cair
2. Berdasarkan mekanisme yang menyebabkan distribusi fasa

21/12/2022 10
 Pengelompokan kromatografi berdasarkan mekanisme yang menyebabkan distribusi
fasa

1. Kromatografi cairan-padatan atau kromatografi serapan.

Ditemukan oleh Tswett dan dipopulerkan oleh Kuhn & Lederer (1931). Sebagai isi
kolom, silika gel atau alumina, dengan ratio luas permukaan terhadap volume sangat
besar
2. Kromatografi cairan-cairan atau kromatografi partisi.
Dikenalkan oleh Martin & Synge (1941). Fasa diam lapisan tipis cairan yang melapisi
permukaan padatan inert yang berpori-pori. Banyak kombinasi cairan yang dapat
digunakan

21/12/2022 11
3. Kromatografi gas-padat
Sebelum tahun 1800an digunakan untuk pemurnian gas
4. Kromatografi gas-cairan
Metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Dapat memisahkan dengan
cepat dan peka. Pertama kali diperkenalkan oleh James & Martin (1952), yang
menyebabkan revolusi dalam kimia organik
5. Kromatografi kertas
Kromatografi cairan-cairan, dimana fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari
lembab udara oleh kertas

21/12/2022 12
6. Kromatografi Lapis Tipis
Sama seperti kromatografi kertas, lempeng gelas atau aluminium
yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel atau bahan
serbuk lainnya, digunakan pengganti kertas. KLT selalu dijadikan
pilihan pertama pada pemisahan dengan teknik kromatografi.

7. Kromatografi penukar ion.

Bidang khusus krom. cairan-cairan, khusus untuk spesi ion.
Digunakan resin sintetik dengan sifat penukar ionnya, untuk
pemisahan logam dan asam amino

21/12/2022 13
8. Permiasi Gel
Pemisahan dengan gel, yang terdiri dari modifikasi dekstran, yang mempunyai ikatan
silang. Bahan ini dapat memisahkan molekul berdasarkan ukurannya
9. Elektroforesis
Kromatografi yang diberi media listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa
bermuatan positif menuju katoda dan anion ke anoda. Kecepatan gerak tergantung pada
besarnya muatan.

21/12/2022 14
•Kromatografi adalah teknik pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu sampel yang dibawa fase
gerak melewati fase diam (dapat berbentuk padat atau cairan).

•HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah kromatografi cair dengan alat yang berfungsi
mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam dengan memompa cairan (fase bergerak) pada
tekanan tinggi melalui kolom.
 PENDAHULUAN

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom, yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan
atau padat.

Partikel berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom akan memberi luas
permukaan yang lebih besar memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen
dalam campuran.

Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fase gerak ke dalam kolom,
dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan lebih
besar
 PENDAHULUAN

Metode kromatografi cair yang digunakan untuk menganalisa zat-zat organik yang biasanya
mempunyai sifat sukar menguap dan tidak stabil terhadap panas (thermolabil)

HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap fasa diam
tertentu
 PRINSIP HPLC/KCKT

“Pemisahan suatu senyawa kimia dari suatu campuran atau senyawa

lainnya berdasarkan perbedaan sifat fisiknya, memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung (kuantitatif) konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut”.
DASAR MEKANISME HPLC/KCKT
Elusi dalam kolom kromatografi
 DASAR MEKANISME HPLC/KCKT

Elusi dalam kolom kromatografi

Elusi : proses terbawanya komponen dalam suatu campuran, sehingga ada pemisahan komponen
yang dibawa oleh Fasa Gerak dari ujung atas kolom hingga bagian bawah
tR : waktu yang diperlukan oleh komponen untuk bermigrasi sepanjang kolom
Vr : volume Fasa Gerak yang dibutuhkan untuk membawa komponen dari titik awal kolom hingga
akhir kolom
 KELEBIHAN METODE HPLC
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Mudah dalam pengoperasian instrumentasinya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan "sample recovery"
volume sampel yang digunakan kecil
Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan non-volatil, stabil
dan tidak stabil secara thermal.
Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas.
 FASE HPLC

Terdapat dua Fase dalam metode HPLC:

Fase Normal HPLC : F.Gerak nonPolar – F.Diam polar

• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai
ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

• Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika
yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang
non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
 FASE HPLC

Terdapat dua Fase dalam metode HPLC:

Fase Terbalik HPLC : F.Gerak polar – F.Diam nonpolar

• Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan
rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom
karbon 8 atau 18.

• Pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

• Air mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit.

• Fase terbalik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
INSTRUMEN HPLC/KCKT
INSTRUMEN HPLC/KCKT
BAGAN HPLC/KCKT
BAGAN HPLC/KCKT

WADAH FASE GERAK/RESERVOIR

Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam kolom
dengan bantuan pompa.

Syarat fasa gerak yang digunakan harus dimilipore ( pori pori ± 5μm) dan
didegass (menghilangkan gas terlarut) → gas NO2 & O2 → membuat
gelembung-gelembung di dalam kolom & detector - bila ada gelembung
akibatnya pelebaran pita analit dan mengganggu system detector

Fasa gerak bisa 1 jenis (konsentrasi konstan) - Isokratik atau lebih dari 1
jenis fasa gerak yang polaritasnya berbeda - elusi gradien
BAGAN HPLC/KCKT

POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak yang mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)
Kec. Alir 1-3ml/menit
Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless steel
Tidak ada pulsa getaran
Kontinyu
BAGAN HPLC/KCKT

INJEKTOR: Alat untuk

pemasukan sampel ke dalam
sistem KCKT

Oven kolom : Instrumen pemanas yang didalamnya terdapat Fasa diam, kolom
merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah terjadi pemisahan
komponen-komponen cuplikan.
Syarat :

Keseragaman, kestabilan dan ketepatan kotrol temperatur yang baikPenampang:

baja tahan karat, tahan tekanan tinggi
Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih kompak, hasil pemisahan lebih
baik
Dapat dipakai berulang
BAGAN HPLC/KCKT

Detektor: Pendeteksi Data

Yang umum dipakai
●Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
●Detektor Photodiode Array (PDA)
●Detektor Fluorescence (RF)
●Detektor Konduktivitas (CDD)
●Detektor Refraktive Indeks (RID)
●Detektor Elektrokimia (ECD)
●Detektor spektrometer massa
FASA GERAK/SOLVEN PADA HPLC
INDEKS KEPOLARAN
 FASA GERAK/SOLVEN

Pemilihan fase gerak

Fase gerak memegang peranan penting dalam pemisahan analit karena migrasi analit diatur oleh
interaksi fase gerak dan fase diam, hal ini terjadi kompetisi antara fase gerak dan analit untuk
dapat terikat pada sisi-sisi aktif dari fase diam.

Fase gerak yang dipakai biasanya merupakan campuran 2 atau lebih pelarut yang kekuatannya
berbeda. Pelarut yang kepolarannya berbeda jauh dengan kepolaran fase diam dianggap sebagai
pelarut yang lemah, karena pelarut jenis ini tidak akan ditahan kuat oleh fase diam dan belum
tentu dapat mengusir analit dari ikatannya dengan fase diam untuk bermigrasi.
 FASA GERAK/SOLVEN

Sifat fisika-kimia pelarut yang harus diperhatikan untuk memilih pelarut yang dipakai dalam
HPLC adalah viskositas, kompresibilitas, indeks bias, tekanan uap, titik leleh, spektrum UV,
nilai ambang batas, daya campur dan kepolaran.

Disamping itu pelarut yang dipakai dalam HPLC harus murni secara kimia, bebas partikel,
bebas dari gas terlarut, dicampur dengan benar
FASA DIAM PADA HPLC
 EFISIENSI HPLC

Faktor-faktor yang mempengaruhi analisis HPLC

 APLIKASI ANALISIS HPLC

1. Waktu retensi
tR (Waktu retensi) akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
⚫ Tekanan yang digunakan (berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
⚫ Kondisi dari fase diam (material dan ukuran partikel)
⚫ Komposisi yang tepat dari pelarut
⚫ Temperatur pada kolom.

F : laju alir FG (fasa gerak) yang menyatakan

jumlah volume FG per satuan waktu ↓
F = V R / tR
tR = VR / F
 APLIKASI ANALISIS HPLC
2. Faktor kapasitas (k’)
• Faktor kapasitas adalah ukuran kemampuan kolom mempertahankan komponen sampel.
• Faktor kapasitas merupakan waktu zat terlarut berada dalam fase diam relatif terhadap waktu dalam
fase gerak.
• Nilai faktor kapasitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut :

K = <1 (tidak ada pemisahan)

K= > 1 (terjadi pemisahan)

Pemisahan yang baik :

1 < K < 10
 APLIKASI ANALISIS HPLC
3. Faktor selektivitas (α)
• Selektivitas merupakan kemampuan sistem HPLC untuk memisahkan senyawa yang berbeda.
• Nilai selektivitas ditentukan sebagai rasio perbandingan faktor kapasitas dari senyawa yang
berbeda.
• Nilai selektivitas harus > 1 agar terjadi pemisahan sempurna.
• Selektivitas bergantung pada sifat senyawa dan interaksi antara senyawa dengan permukaan fase
diam dan fase gerak.
• Selektivitas dihitung mempergunakan persamaan berikut:berikut :
 APLIKASI ANALISIS HPLC
3. Faktor selektivitas (α)
• Selektivitas merupakan kemampuan sistem HPLC untuk memisahkan senyawa yang berbeda.
• Nilai selektivitas ditentukan sebagai rasio perbandingan faktor kapasitas dari senyawa yang
berbeda.
• Nilai selektivitas harus > 1 agar terjadi pemisahan sempurna.
• Selektivitas bergantung pada sifat senyawa dan interaksi antara senyawa dengan permukaan fase
diam dan fase gerak.
• Selektivitas dihitung mempergunakan persamaan berikut:berikut :
 APLIKASI ANALISIS HPLC
4. Efisiensi kolom (N)
• Jumlah plat teoritis (N) merefleksikan jumlah waktu senyawa berpartisi antara dua fase selama
melalui kolom dan menggambarkan efisiensi kolom.
• Jumlah plat teoritis suatu kromatografi dapat dihitung dengan persamaan berikut::
 APLIKASI ANALISIS HPLC
5. Resolusi (Rs)
• Resolusi atau daya pemisahan dua pita yang berdekatan didefinisikan sebagai jarak antara
dua puncak pita dibagi dengan luas rata-rata pita.
• Nilai resolusi > 1,5 menunjukkan bahwa kedua puncak terpisah secara sempurna.
• Untuk pengembangan metode, sebaiknya dilakukan sampai resolusi
• ≥ 2. Resolusi dua senyawa dapat dapat dihitung dengan persamaan berikut:
 APLIKASI ANALISIS HPLC

6. Faktor tailing (Ft)

Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak setangkup), maka perhitungan asimetrisitas
merupakan cara yang baik untuk mengontrol sistem kromatografi. Peningkatan puncak asimetri akan
menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi. Pengukuran derajat asimetris puncak dapat
dihitung dengan faktor tailing dan faktor asimetris. Faktor tailing dihitung dengan menggunakan lebar
puncak pada ketinggian 5% dengan persamaan berikut:
 APLIKASI ANALISIS HPLC

Faktor tailing
Bentuk kromatogran normal jika nilai faktor tailing berada pada rentang yang dizinkan,
yaitu 0,9 ≤ Ft ≤ 1,2. Persyaratan umum untuk pemisahan rutin adalah Ft < 2 untuk semua
puncak. Puncak utama tailing (Ft > 2) sangat merugikan baik pemisahan dan analisis
kuantitatif
 APLIKASI ANALISIS HPLC

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan kuatitatif

Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisis kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi
dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar .

Contoh spektrum HPLC

 APLIKASI ANALISIS HPLC

Penentuan Kuantitatif
Hal yang perlu diperhatikan agar HPLC dapat digunakan untuk penentuan kuantitatuf adalah:
Parameter percobaan antara sampel dan standar adalah sama
Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan Hubungan/korelasi menggunakan deret standar baku pada
waktu retensi tertentu, yaitu:
▪ Berdasarkan area kromatogram
▪ Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
 APLIKASI ANALISIS HPLC

Penentuan Kuantitatif
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan Hubungan/korelasi menggunakan deret standar baku pada
waktu retensi tertentu, yaitu:
▪ Berdasarkan area kromatogram
▪ Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Puncak Y < dibanding dengan area dibawah

puncak X.
Hal ini disebabkan :
Karena Y konsentrasi lebih rendah
dibanding X
Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang
gelombang lebih sedikit dibanding dengan
X
 APLIKASI ANALISIS HPLC

Penentuan Kuantitatif:
Konsentrasi sampel =
 APLIKASI ANALISIS HPLC

Penentuan Kuantitatif:

Dari regresi linier standar

diperoleh persamaan garis
linear dan r,
Area sampel dimasukkan dalam
persamaan linear yang
diperoleh dari regresi linier
standar, sehingga diperoleh
konsentrasi sampel.
y = intercept + slope x
 ANALISIS PARACETAMOL DAN KAFEIN

Penentuan Kuantitatif dan Kualitatif

Fasa gerak : 420 ml KH2PO4 + 20 mL methanol + 30 mL asetonitril + 30 mL Isopropil-- saring
dan disonifikasi
Standar induk pembanding : larutan standar Kafein 250 ppm dan Paracetamol 500 ppm-
disonifikasi
Deret standar kerja : masing-masing induk diencerkan sampai diperoleh deret standar kafein
(25, 50, 75, 100, 125, 150)ppm, Paracetamol (50,100, 150, 200, 250, 300, 350)ppm
Sampel ditimbang dan dilarutkan kemudian disonifikasi
ANALISIS PARACETAMOL DAN KAFEIN
 ANALISIS PARACETAMOL DAN KAFEIN

Paracetamol
 ANALISIS PARACETAMOL DAN KAFEIN

Kafein
 ANALISIS PARACETAMOL DAN KAFEIN

Kafein
 fasa gerak :Gradien fasa gerak : Iso kratik
Air (ml) Metanol (ml) Air (ml) Metanol (ml)
90 10 70 30
80 20
70 30
60 40
50 50
40 60
30 70
20 80
10 90