KROMATOGRAFI

KIMIA ORGANIK II – S1 FARMASI

INSTITUT ILMU KESEHATAN BHAKTI WIYATA KEDIRI
2020
OLEH: FITRI ROCHMAHDIAN, S.Si., M.S.Farm
Pokok Pembahasan

Sejarah dan perkembangan

kromatografi

Definisi dan prinsip dasar kromatografi

Penggolongan kromatografi

Kromatografi kolom dan kromatografi

lapis tipis
Sejarah kromatografi
• Suatu teknik pemisahan yang pertama kali diperkenalkan oleh ahli botani, bangsa
Rusia, Mikhail Tswett (1906) yang berhasil memisahkan klorofil dari pigmen lain
pada ekstrak tanaman melalui kolom gelas kaca
• Kolom gelas kaca diisi dengan kalsium karbonat (CaCO3) yang disebut sebagai
adsorben, dan dielusi dengan pelarut organik (petroluem eter)
• Hasil pemisahan berupa pita-pita berwarna yang terpisahkan akibat elusi pelarut
organik dalam kolom kaca
• Kesimpulan: pigmen yang lebih kuat terserap oleh adsorben akan keluar lebih lama
dibandingkan dengan pigmen yang lemah terserap oleh adsorben
• Teknik pemisaha ini diberi nama Kromatografi (chroma=warna;
graphien=tulisan/gambaran)
• Penemuan kromatografi pertama ini: Kromatografi kolom adsorpsi
• Perkembangan selanjutnya kromatografi kolom adsorpsi digunakan pula untuk
pemisahan zat-zat yang tidak berwarna (hanya dalam bentuk bercak dan grafik)

• Tahun 1941 Martin dan Singe menemukan metode kromatografi yang kedua 
Kromatografi Partisi
Kolom gelas diisi silikagel yang mengandung air  digunakan untuk memisahkan zat ke
dalam komponen-komponennya

• Tahun 1944 : Consden, Gordon, Martin  Mengembangkan kromatografi partisi yang

dilakukan pada kertas saring dan disebut : Kromatografi Kertas
Perkembangan kromatografi

Perkembangan selanjutnya, kromatografi telah melibatkan pemakaian alat bantu

seperti computer/gabungan dengan alat lain  memperluas jangkauan pemakaiannya.
Terbukti dengan lahirnya :

 Kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS)

 Kromatografi cair kinerja tinggi-spektrometri massa(HPLC-MS)
 Kromatografi ion dan sebagainya

Dari bermacam-macam cara ini, asas yang melandasi sama.

Definisi kromatografi

Keulmans (tahun 1959) :

Kromatografi adalah metoda pemisahan fisika, dimana komponen yang akan
dipisahkan, didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dengan luas permukaan
yang besar dan fasa gerak yang terperkolasi pada permukaan fasa diam.

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) :

Kromatografi adalah metoda yang digunakan terutama untuk memisahkan komponen
dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa
diam dan fasa bergerak/mobil. Fasa diam berupa padatan/cairan yang dilapiskan pada
padatan/gel.
Prinsip dasar kromatografi

• Pemisahan dengan metoda kromatografi dapat terjadi karena suatu

molekul/senyawa satu sama lain mempunyai sifat berbeda antara lain :

 Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut

 Daya serap / sorpsi yang berbeda satu sama lain

dengan suatu serbuk bahan padat (adsorpsi)

 Titik didih (penguapan) pada temperatur yang

berbeda satu sama lain
Pemisahan secara kromatografi
• Senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak (fasa
mobil/fasa gerak) yang mengalir melalui sistem yang diam (fasa diam)
• Selama pengaliran fasa mobil, akan terjadi proses: pelarutan, adsorpsi, penguapan
• Contoh terjadinya proses pemisahan:

 Suatu senyawa  corong pisah berisi dua macam pelarut yang sulit bercampur (air
dan eter), senyawa akan terdistribusi diantara kedua pelarut  sifat kelarutan
berperan dalam pemisahan

 Senyawa  cairan berisi adsorben (arang) Senyawa terdistribusi diantara cairan

dan adsorben  Kelarutan dan adsorpsi berperan

 Senyawa volatile  dilarutkan dalam cairan non volatile  kelarutan dan volatilitas
 2 macam fasa yang berperan :
Cair – cair, cair – padat, gas – cair, gas – padat
Fasa diam dan fasa gerak
• Dalam praktek, kromatografi dilaksanakan dalam situasi yang dinamis, salah satu
dari kedua fasa merupakan fasa bergerak dan fasa lainnya fasa diam
• Fasa bergerak: Cairan / gas
• Fasa diam : Cairan / padatan
• Bila komponen-komponen yang ada semuanya tidak bisa bergerak sama sekali 
pemisahan tidak berlangsung.
• Penempatan fasa diam dapat dilakukan seperti:
- dimasukkan di dalam suatu kolom
- ditabur sebagai lapisan
-didistribusikan sebagai film
-dan sebagainya
Penggolongan kromatografi

• Jenis-jenis kromatografi yang umum digunakan:

Fasa Fasa Teknik kromatografi Prinsip
gerak diam
Gas Padat Gas – padat Adsorpsi

Cair Padat Kolom, lapis tipis, Adsorpsi,

kertas pertukaran ion,
penyaringan gel
Cair Cair Kolom, lapis tipis, Partisi
kertas
Gas Cair Gas – cair Partisi
 I. Fasa k. gas – cair (gas – liquid – kromatografi = GLC)
k. gas – padat (gas – solid – kromatografi = GSC)
k. cair – cair (liquid – liquid – kromatografi = LLC)
k. cair – padat (liquid – solid – kromatografi = LSC)

II. Proses pemisahan k. adsorpsi

k. partisi
k. pertukaran ion
k. filtrasi/permeasi gel
k. elektroforesis

III. Teknik operasional Kromatografi kolom

kromatografi kertas
kromatografi lapis tipis
kromatografi gas
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT = HPLC=
high performance liquid kromatografi
Klasifikasi kromatografi menurut fasa
Kromatografi Gas – Padat
Gas – Solid – Chromatography (GSC)

• Digunakan sebelum tahun 1800 untuk pemurnian gas.

• Lama tidak berkembang sampai ditemukan fasa padat yang
baru

Kromatografi Gas – Cair

Gas – Liquid – Chromatography (GLC)

• Dikenalkan pertama kali oleh Jame dan Martin tahun 1952

• Metode pemisahan sangat efisien dan serba guna
• Sebagai metode pilihan dalam kromatografi karena dapat
memisahkan dengan cepat dan peka
Klasifikasi kromatografi menurut fasa dan proses
pemisahan
Kromatografi Cair-Padat
(kromatografi adsorpsi)
• Kromatografi serapan = Kromatografi adsorpsi

• Ditemukan oleh Tswett dan dikenalkan kembali oleh Kuhn

dan Lederer tahun 1931

• Fasa diam: zat padat yang aktif (adsorben)

• Fasa gerak: cair

• Digunakan sangat luas untuk analisis organic dan biokimia

• Dilakukan pada kolom yang diisi silica gel atau alumina

sebagai adsorben
Klasifikasi kromatografi menurut fasa dan proses
pemisahan
Kromatografi Cair – Cair
(kromatografi partisi)
• Dikenalkan oleh Martin dan Singe tahun 1941  mendapat
hadiah nobel
• Fasa diam : zat cair yang diserapkan pada zat padat yang inert
(tidak aktif)
• Fasa gerak : cair
• Contoh sederhana : Kromatografi kertas sebagai fasa diam
adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh
kertas.
• Kromatografi cair – cair ini juga dapat dilakukan pada
kromatografi kolom dan lapisan tipis.
Klasifikasi kromatografi menurut proses
pemisahan
Kromatografi Pertukaran Ion
• Fasa diam : Zat padat yang mengandung gugus ion
aktif yang dapat ditukar dengan ion lain dalam fasa
gerak

• Khusus digunakan untuk spesies ion seperti

campuran logam dalam tanah
Klasifikasi kromatografi menurut proses
pemisahan
Kromatografi Penyaringan Gel
Gel filtration chromatography

• Fasa diam : Gel yang terdiri dari modifikasi dekstran

– molekul polisakarida (Xephadex). Bahan ini dapat
menyerap air membentuk susunan seperti saringan
yang dapat memisahkan molekul-molekul
berdasarkan ukurannya.

• Kromatografi permeasi gel  teknik sama dengan

kromatografi filtrasi gel  fasa diam
Polistirena
Klasifikasi kromatografi menurut proses
pemisahan

Elektroforesis
• Merupakan kromatografi cair –cair yang diberi
medan listrik di sisinya dan tegak lurus pada aliran
fasa gerak

• Senyawa bermuatan positif menuju ke katode dan

yang bermuatan negative ke anode

• Kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan

Kromatografi
Kolom

Untuk pemisahan yg bersifat

preparatif. Misal: isolasi
senyawa dr bahan alam, yang
dibutuhkan dalam jumlah besar.
Kromatografi kolom

• Pengisian kolom:
• Kolom diisi dengan zat padat (adsorben)
• Kolom harus terisis homogen, tidak ada rongga
udara (kompak)
• Pengisian yang tidak teratur  hasil pemisahan
tidak baik
• Agar kolom dapat terisi kompak  adsorben
dibuat bubur/slurry dengan pelarut yang
sesuai/yang akan digunakan
• Dituang ke dalam kolom perlahan-lahan
• Pengisian sampel:
• Sampel dibuat larutan sepekat mungkin
(dicegah terjadinya pengendapan)
• Cara memasukkan sampel dengan
diinjeksikan ke bagian atas kolom, harus
serata mungkin dan dicegah adanya
goncangan yang menyebabkan rusaknya
pita-pita
• Elusi: membiarkan fase gerak (eluen) turun
dalam kolom dengan membawa sampel
sehingga terjadi pemisahan komponen-
komponen sampel tersebut
• Hasil pemisahan komponen-komponen dalam
kolom  kromatogram
• Kromatografi kolom ini disebut kromatografi
kolom terbuka (konvensional)
• Perkembangan kromatografi kolom 
kromatografi kolom tertutup yang dikemas
dalam peti baja  alat-alat canggih: GC, HPLC
• Fasa diam: zat padat aktif (adsorben)
umumnya bersifat polar, contoh: silika
gel, aluminium, magnesium karbonat
• Fasa gerak: zat cair dengan kepolaran
kecil/non polar, contoh: heksana,
kloroform
• Proses pemisahan: terjadi
kompetisi/persaingan antara fasa diam
yang mengadsorpsi komponen dan
fasa gerak yang membawa komponen
tersebut
• Mekanisme terjadinya pemisahan:
• Adsorpsi disebabkan adanya gaya tarik adsorben terhadap komponen
• Gaya tarik dapat berupa gaya elektrostatik dipol-dipol, gaya tarik antar molekul atau
kombinasi gaya-gaya tersebut

• Tiap komponen akan diadsorpsi oleh adsorben dengan kekuatan yang berbeda
• Komponen lebih polar diadsorpsi lebih kuat oleh fasa diam (adsorben) terjadi
pemisahan

• Komponen yang lebih kuat diadsorpsi berjalan lebih lambat dari pada komponen yang
kurang diadsorpsi oleh fasa diam
• Pada waktu elusi, komponen yang kurang diadsorpsi keluar lebih dahulu.
Kromatografi
Lapis Tipis

Pengembangan dari
kromatografi kolom.
Dapat digunakan pada sampel
dalam jumlah kecil.
Kromatografi lapis tipis (KLT)

• Keunggulan KLT dibanding kromatografi kolom:

 Cara sederhana dengan kecermatan tinggi
 Membutuhkan zat dengan jumlah sedikit
 Waktu lebih efisien
 Daya pisah (resolusi) lebih baik
 Terjadinya pemisahan lebih mudah diamati
 Biaya lebih murah
 Mudah dikembangkan
 Teknik pemisahan zat pada KLT
• Pelarutan sampel:
Sampel dilarutkan, jika memungkinkan dalam •
pelarut non polar yang mempunyai titik didih
rendah  ditotolkan langsung menguap.
Jika perlu, pelarut polar
sebaiknya menggunakan campuran CHCl3 –
metanol ( 1 : 1)
Konsentrasi larutan pada umumnya 0,01 – 1%.
Sebaiknya 1 – 5mg/mL larutan sampel masih
memadai untuk diaplikasikan pada pelat.
• Penotolan sampel:
Penotolan sampel dilakukan dengan
menggunakan mikropipet (disposable)
ukuran tertentu : 1L, 2L, 5L, 10L,
dst  hasil totolan akurat.
• Untuk tujuan yang tidak perlu teliti
(kualitatif) dapat digunakan pipa kapiler
buatan sendiri.
• Cara penotolan sampel pada KLT
• Untuk tujuan analisis
• Satu totolan sampel dan beberapa totolan zat standar dalam satu pelat
• Untuk tujuan preparatif (isolasi)
• Penotolan beberapa noda yang berdekatan

std
KLT analisis KLT preparatif
• Macam-macam sorben untuk KLT:
1. Silika gel (Asam silikat)  paling banyak digunakan, bersifat sedikit asam (asam
lemah). Macam: silika gel G (tipe 60), silika gel GF254 (60) sebagai indikator
senyawa fluorescein, silika gel H (60)
2. Alumina (Al2O3)  bersifat basa lemah. Macam: alumina, alumina G, alumina GF
3. Kiesel Guhr (Tanah diatomae)
4. Sorben organik (selulosa)  untuk memisahkan senyawa hidrofil seperti asam
amino, asam nukleat, gula, dsb.
• Elusi sampel
Elusi dilakukan dalam bejana (“CHAMBER”)
Bejana harus dapat ditutup rapat
Bejana dijenuhkan dengan uap eluen (periksa dengan kertas saring whatman)
Bejana tidak jenuh  eluen pada sorben menguap  jalannya eluen tidak kontinyu
 pemisahan tidak sempurna
 Pemilihan eluen : tergantung pada zat yang akan dianalisis
 Masukkan pelat ke dalam chamber
 Jalannya eluen  asending
 Biarkan eluen bergerak sampai tinggi tertentu  pelat diangkat  beri tanda
batas berhentinya eluen
• Elusi sampel Penjenuhan chamber

pelat

garis penotolan
 Hasil elusi
Elusi sampel

Elusi dapat dilakukan pada

chamber/tempat tertutup
lainnya
Setelah Setelah Selesai elusi
5 menit 10 menit dan
dikeringkan
Deteksi noda :

 Jika zatnya berwarna  langsung

terdeteksi
 Jika zatnya tidak berwarna :
* Penyemprotan dengan pereaksi 
warna
* Periksa di bawah sinar lampu UV
Silika gel G : Zat berfluorescein 
sorben gelap
Silika gel GF : Zat berbentuk noda
gelap  sorben berfluorescein Commercial TLC plate after Same TLC plate held under a
development UV lamp -
in normal lighting.
Penampak noda dengan pereaksi kimia
Identifikasi dan penentuan kadar

Identifikasi :
 Menghitung harga Rf, dibandingkan dengan standar
 Warna noda

Penentuan kadar :
Menghitung luas noda dibandingkan dengan standar
Spektrofotometri : Metode densitometri
Faktor Retardasi (Rf)

The Rf (=retardation factor) depends on

solvent sistem
absorbent (grain size, water content, thickness)
amount of material spotted
temperature
Faktor Retardasi (Rf)

•Pemisahan dikatakan baik jika harga Rf berbeda  0,2.

Faktor Retardasi (Rf)