KROMATOGRAFI

Apakah Kromatografi itu ???

 Sejarah kromatografi
• Pertama kali diperkenalkan oleh W. Ramsey pada tahun 1905
• Istilah kromatografi (artinya penulisan warna) pertama kali
diberikan oleh Mikhail Semenovic Tswett pada tahun 1908

Di awal abad ke-20 kimiawan Rusia Mikhail Semënovich Tsvet

(1872-1919) menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk
kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan campuran
pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara
mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan
berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan kromatografi
pada teknik pemisahan baru ini (1906).
 Pengertian Kromatografi
Kromatografi secara umum.

menjadi
Teknik Suatu
pemisahan campuran Komponen

Kromatografi adalah teknik untuk

memisahkan campuran menjadi
komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fisik
masing-masing komponen.
Pemakaian Kromatografi
Analitik:
= Kualitatif: Mengetahui identitatas suatu analit
= kuantitatif : menentukan kadar analit

Preparatif:
= untuk mendapatkan komponen murni
Penggolongan kromatografi:

a. Berdasarkan fase gerak

=> kromatografi cair: KLT, KKt, KCKT
=> Kromatografi gas: KGC, KGP

b. Berdasarkan fase diam

=> kromatografi Cair-Cair: KKt, KCKT
=> Kromatografi Cair-Padat: KLT, KK, KCKT
c. Berdasarkan penampang fase diam:

=> kromatografi datar / planar: KLT, KKt

=> kromatografi kolom: KK, KGC, KGP, KCKT
Jenis-jenis Kromatografi
Berdasarkan Alat dan Bahan yang digunakan, antara
lain :
1. Kromatografi Konvensional
- Kromatografi Kertas (KKT)
- Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
- Kromatografi Kolom Klasik
Kelemahan konvensional: lama, tenaga besar, sering tidak akurat, tidak dapat
mendeteksi pada kadar rendah seperti ppm

2. Kromatografi Kolom modern

Teknik kromatografi: terus berkembang dengan akurasi tinggi

- Kromatografi gas (GC)

- Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
 A. Kromatografi Kertas

• Kromatografi kertas adalah kromatografi

yang menggunakan kertas selulosa murni
yang mempunyai afinitas besar terhadap
air atau pelarut polar lainnya.

• Kromatografi kertas digunakan untuk

memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya.
Prinsip Kerja Kromatografi
Kertas

Pelarut bergerak lambat pada

kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda
dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan
bercak warna.
 Cara penggunaan Kromatogarfi
kertas
1. Kertas yang digunakan adalah Kertas Whatman
No.1.
2. Sampel diteteskan pada garis dasar kromatografi
kertas.
3. Kertas digantungkan pada wadah yang berisi
pelarut dan terjenuhkan oleh uap pelarut.
4. Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan
penguapan pelarut sama halnya dengan
pergerakan pelarut pada kertas.
Contoh Kromatografi
Kertas
 B. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah

kromatografi yang menggunakan kolom
sebagai alat untuk memisahkan
komponen-komponen dalam campuran.
 Prinsip Kerja Kromatografi
Kolom
• Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran
dengan afinitas berbeda terhadap permukaan
fase diam.

• Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase

geraknya adalah cairan yang mengalir membawa
komponen campuran sepanjang kolom.

• Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap

absorben akan secara selektif tertahan dan
afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran
pelarut.
 Cara Penggunaan
Kromatografi Kolom
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan
melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam
adsorben (bahan penyerap).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu
macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan
sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.
Gambar kromatogafi kolom
 C. Kromatografi Lapis Tipis

• Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan

campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya yang digunakan.

• Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk

memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon
yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
Prinsip kerja Kromatografi Lapis
Tipis
• KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika atau
alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras.
• Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam.
• Fase gerak merupakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.
• Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan
warna yang merupakan gabungan dari beberapa
zat pewarna.
Cara Penggunaan Kromatografi
Lapis Tipis

Pada cara penggunaan KLT hampir

sama dengan penggunaan Kromatografi
kertas, hanya saja pada KLT fase
diamnya menggunakan plat gelas/
logam/ Aluminium foil sedangkan pada
kromatografi kertas menggunakan
kertas.
Gambar Kromatografi Lapis
Tipis
KLT:

Umum Istilah
Fase diam
Kromatografi Lapis Tipis = Thin Layer Chromatography

Mekanisme Pengembangan = development = eluasi = elusi

Eluen = pelarut untuk pengembangan
 Penampak Eluat = pelarut yang mengandung analit hasil pemisahan dengan
bercak kromatografi
Kromatogram = gambar hasil pemisahan
 Peralatan Kromatograf = alat untuk kromatografi
Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik awal / jarak
Penggunaan migrasi fase gerak setelah pengembangan
RRf = 100 x Rf
Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

KLT merupakan
Fase diam
1. Kromatografi cair

Mekanisme Fase diam: padat, fase gerak: cair

2. Kromatografi planar
 Penampak
3. Umumnya fase diam silika gel, alumina
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum Lapis Tipis terdiri dari:

Plat: kaca, Alumunium, plastik
Fase diam
Adsorben: silika gel, alumina, selulosa, dll
Mekanisme

Macam-macam adsorben di pasaran:

 Penampak
bercak Silika gel G, silika gel GF, silika gel H
Alumina H, Alumina HF
 Peralatan
Selulosa
Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:
SILIKA GEL: SiOH, SiO2
Umum Sifat polar
Silika gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15%
Fase diam
Silika gel S (mengandung pengikat starch =pati
Mekanisme Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator
fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat aktif,
yang berfluoresensi pada 254 nm
 Penampak
bercak Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat)
biasanya untuk kromatografi vakum
 Peralatan Silika gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung indikator
floresensi)
Penggunaan Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif &
mengandung indikator floresensi)
Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum Alumina Al2O3

Kurang polar dibanding silika gel
Fase diam
Almunina basa, netral, asam
Mekanisme Alumina G, F, H, P

 Penampak
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Mekanisme KLT (fase diam Silika /Alumina):

Fase diam
1. Adsorbsi senyawa pada adsorben/penjerap/fase diam
Mekanisme 2. Kompetisi fase gerak & solut untuk berikatan dengan
fase diam, dimana solut lepas dari permukaan fase
 Penampak diam => desorbsi
bercak 3. Senyawa dielusi oleh eluen/pengembang/fase gerak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum
Penampak Bercak:
Fase diam 1. Visual => analit berwarna
2. Penampak bercak kimia
Mekanisme
Misalnya: Uap Iodium, Asam sulfat, pekat,
ninhidrin
 Penampak
bercak 3. Lempeng diberi fluoresensi

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum Penampak Bercak kimia, berdasarkan

sifatnya:
Fase diam 1. Permanen: Asam sulfat pekat, ninhidrin
2. Sementara: Uap Iodium
Mekanisme

 Penampak Penampak Bercak kimia, berdasarkan

bercak
spesifisitasnya:
1. Spesifik:
 Peralatan
ninhidrin: untuk zat dengan atom N (protein,
Alkaloid dll)
Penggunaan
2. Umum:
Rekayasa Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir semua zat)
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan
A Spray Cupboard Suitable for Sufuric Acid Spray
Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan

Penggunaan
An automatic TLC Plate Sampler
Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa Metode normal Pengembangan plat KLT

dalam KLT
Metode Pengembangan pada KLT

Berdasar arah pengembangan

 Menaik
 Menurun

Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
 Pengembangan 2 dimensi
Pemisahan KLT 2 dimensi
KLT:

Umum

Fase diam Penggunaan KLT

Mekanisme 1. Untuk penentuan jumlah komponen dalam
campuran.
 Penampak
2. Untuk penentuan identitas antara dua
campuran.
bercak
3. Untuk memonitor perkembangan reaksi.
4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
 Peralatan 5. Untuk penentuan kondisi yang sesuai untuk
pemisahan pada kromatografi kolom.
Penggunaan 6. Untuk memonitor kromatografi kolom .

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum
Bagaimana mendapatkan komposisi fase gerak
yang baik untuk KLT????
Fase diam

Mekanisme 1. Cari di pustaka (jika ada)

2. Jika tidak ada, cari yang sifatnya mirip
 Penampak
3. Jika tidak ada yang mirip lakukan percobaan
bercak
a. Lakukan eluasi dengan fase gerak paling non polar
 Peralatan b. Lakukan kenaikan kepolaran secara gradien
c. Evaluasi hasil, dan tentukan komposisi yang paling
Penggunaan
baik

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum
Contoh Peningkatan Kepolaran secara Gradien
Fase diam

Mekanisme
Metanol:etil-asetat: (1:10)
Metanol:etil-asetat: (2:10)
 Penampak
bercak Metanol:etil-asetat: (3:10)
Metanol:etil-asetat: (4:10)
 Peralatan
Metanol:etil-asetat: (5:10)
Penggunaan
Dst.
Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan
Tingkatkan kepolaran
Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak
bercak

 Peralatan
Turunkan kepolaran
Penggunaan

Rekayasa
dalam KLT
Berdasarkan jenis fase, pengembangan
dibagi:
Fase normal: jika fase diam lebih polar dari fase gerak
Fase terbalik: jika fase gerak lebih polar dari fase diam

Contoh fase normal: KLT dengan fase diam Silika

dan fase gerak petroleum eter

Contoh fase terbalik: KLT dengan fase diam C18

dengan fase gerak metanol
KLT:

Umum KLT untuk Preparatif

Fase diam Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang
lebih tebal
Mekanisme
Totolkan, jika ada senyawa pembanding
Anda dapat menotolkan sampel secara bergaris
 Penampak
bercak Setelah pengembangan, masing-masing hasil
pemisahan dikerok dan dilarutkan dengan pelarut
 Peralatan yang sesuai.
Jangan semprot dengan bahan kimia, sebagai
Penggunaan penampak bercak (gunakan UV atau uap Iod)

Rekayasa
dalam KLT
KLT:

Umum
KLT untuk Kuantitatif
Fase diam
Totolkan senyawa pembanding yang diketahui
kadarnya
Mekanisme
Gunakan pipet kapiler terukur volumenya /
 Penampak microsiringe
bercak Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel dan
bandingkan dengan senyawa pembanding
 Peralatan
Untuk menghitung intensitas anda bisa gunakan
KLT scanner atau dikerok dan gunakan
Penggunaan spektrofotometer

Rekayasa
dalam KLT
 D. Kromatografi Gas

Kromatografi gas adalah proses

pemisahan campuran menjadi komponen-
komponennya dengan menggunakan gas
sebagai fase bergerak yang melewati
suatu lapisan serapan (sorben) yang
diam.
Gambar Kromatografi gas
 Proses Kromatografi
• Pembawa gas
• Detektor
• Kolom
• Flow Controller
• Sampel Injeksi
 Gas pembawa
• Gas yang telah digunakan dalam GLC :
Hidrogen, helium, nitrogen, argon, karbon
dioksida, dan uap air.
• Gas pembawa yang cocok bergantung pada
karakteristik detektor tersebut.
• Gas hidrogen dan helium digunakan pada
detektor kinduktivitas termal sedangkan
nitrogen digunakan pada detektor pengionan
nyala.
 Sistem pengambilan sampel
• Sampel-sampel cair : diinjeksikan melalui
suatu karet septum dengan memakai suntikan
syringe.
• Sampel-sampel gas : diinjeksikan atau
dimasukkan dengan memakai bermacam-
macam alat pengambilan sampel gas yang
dirancang untuk kromatograf komersial
Kromatografi Cair
 Kromatografi Cair
Kromatografi adalah kromatografi
dengan fasa gerak berupa zat cair.
 PROSES-PROSES DISTRIBUSI FASA

• Adsorpsi

• Pertukaran Ion

• Partisi Cair - Cair

 PERTUKARAN ION

Prinsip Pemisahan Ion

Untuk memisahkan sejumlah anion dan kation
satu sama lainnya. Anorganik kation
dipisahkan pada kolom resin pemisah kation,
sementara anorganik anion dipisahkan pada
kolom resin pemisah anion.
Resin Pemisah Ion
 PARTISI CAIR - CAIR
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat
diantara dua pelarut yang tidak dapat
bercampur salah satu diantaranya bertindak
sebagai fasa diam dan yang lainnya sebagai
fasa gerak.