Pada materi sebelumnya tentang kromatografi, Klasifikasi kromatografi

berdasarkan sistem geometrinya ada 2, yaitu kromatografi kolom dan

kromatografi planar/bidang/datar.

Kromatografi kolom, seperti yang dicobakan ilmuwan Rusia Mikhail Tsvett,

dimana pada kolom diisi dengan fasa diam berupa padatan/ serbuk CaCO3
yang akan menyerap senyawa2 dari sampel yang dibawa oleh fasa gerak.
Ingat, … yang diserap adalah senyawa2 yang sama kepolarannya dengan
kepolaran fasa diam = like dissolved like.. Karena menyerap/adsorbsi maka
fasa diam dinamakan juga adsorben.

Kromatografi planar atau bidang atau datar: adsorben atau fasa diamnya
ditempel/direkatkan secara tipis dan merata diatas permukaan lempeng bidang
datar (bisa alumnium atau kaca). Sehingga dinamakan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT = TLC). Sampel ditotol atau diteteskan dibagian bawah lempeng tipis
(pelat) dan ditempatkan/ditegakkan dalam wadah = chamber yang sudah ada
pelarut/fasa gerak. Fasa gerak akan merembes di adsorben karena gaya
kapilaritas (kalau pada kromatografi kolom= fasa gerak bergerak karena gaya
gravitasi bumi) sambil membawa senyawa2 dari sampel yang kita totolkan tadi
dengan prinsip like dissloved like. Pemisahan terjadi karena perbedaan
kelarutan (koefisien distribusi).
KLT:

Umum
Istilah

Fase diam
Kromatografi Lapis Tipis = Thin Layer Chromatography

Mekanisme Pengembangan = development = eluasi = elusi

Eluen = pelarut untuk pengembangan
 Penampak Eluat = pelarut yang mengandung analit hasil pemisahan dengan
kromatografi
bercak Kromatogram = gambar hasil pemisahan
Kromatograf = alat untuk kromatografi
 Peralatan
Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik awal /
jarak migrasi fase gerak setelah pengembangan
Penggunaan Rf digunakan untuk analisa kualitatif

Rekayasa
Gambar samping, adalah pelat KLT yang sudah di
elusi/pengembangan. Gambar titik merah paling bawah
adalah sampel yang sudah ditotolkan, dan dielusi.
Muncul 4 bercak/noda , pink, coklat, biru, hijau, berarti
ada 4 senyawa/analit yang ada dalam sampel yang
ditotolkan tsb. Ke empat senyawa tsb dibedakan (analisa
kualitatif) dengan nilai Rf (retardation factor) yang
nilai/angkanya adalah jarak migrasi analit/senyawa dari
titik awal (titik merah) / jarak migrasi fase gerak setelah
pengembangan (retardation factor ) fase gerak adalah
latar yang warna kuning. Jarak kuning dihitung/diukur
pakai penggaris dari titik merah sampai kuning teratas
Misalnya menghitung nilai Rf dari noda/analit biru,

Rf biru = jarak merah ke biru = ……cm dibagi

jarak merah ke kuning
teratas = ….cm

= 0,…
KLT:

Umum

KLT merupakan
Fase diam
1. Kromatografi cair

Mekanisme Fase diam: padat, fase gerak: cair

2. Kromatografi planar
 Penampak
3. Umumnya fase diam silika gel, alumina
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum Lapis Tipis terdiri dari:

Plat: kaca, Alumunium, plastik
Fase diam
Adsorben: silika gel, alumina, selulosa, dll
Mekanisme

Macam-macam adsorben di pasaran:

 Penampak
Silika gel G, silika gel GF, silika gel H
bercak
Alumina H, Alumina HF

 Peralatan Selulosa
 Kieselgur
Penggunaan

Rekayasa
KLT:
SILIKA GEL: SiOH, SiO2.xH2O
Umum
Sifat polar
Silika gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15%
Fase diam
Silika gel S (mengandung pengikat starch =pati
Mekanisme Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator
fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat aktif,
 Penampak yang berfluoresensi pada 254 nm
Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat)
bercak
biasanya untuk kromatografi vakum

 Peralatan Silika gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung indikator

floresensi)

Penggunaan Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif &
mengandung indikator floresensi)

Rekayasa
KLT:

Umum Alumina , Al2O3

Kurang polar dibanding silika gel
Fase diam
Alumina basa, netral, asam
Mekanisme Alumina G, F, H, P

 Penampak

bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum
KIESELGUR

Terdiri dari SiO2 > 89%

Fase diam Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO, MgO, Na2O,
dll.
Mekanisme > Aktifitas rendah
Digunakan sebagai pendukung fase diam bukan sebagai
 Penampak adsorben.

bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum

Mekanisme KLT (fase diam Silika

Fase diam /Alumina):
1. Adsorbsi senyawa pada
Mekanisme
adsorben/penjerap/fase diam

 Penampak 2. Kompetisi fase gerak & solut untuk

berikatan dengan fase diam, dimana solut
bercak lepas dari permukaan fase diam =>
desorbsi
 Peralatan 3. Senyawa dielusi oleh
eluen/pengembang/fase gerak
Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum Selulosa = polimer

Mekanisme : kromatografi kertas = partisi
Fase diam
Serat lebih pendek, bercak lebih kecil dari KKt
Mekanisme Waktu lebih lama daripada adsorben lain, tapi lebih
singkat dari KKt
 Penampak
Tidak bisa menggunakan H2SO4
bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum
Menggunakan pelarut campuran polar (misal
asetonitril/air) senyawa lebih polar (air) diserap dalam
Fase diam selulosa dimana berfungsi sebagai fase diam cair.

Mekanisme

 Penampak

bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum

Fase diam

Penampak Bercak/noda:
Mekanisme
1. Visual => analit berwarna
 Penampak 2. Penampak bercak kimia
Misalnya: Uap Iodium, Asam sulfat
bercak
pekat, ninhidrin

 Peralatan 3. Lempeng diberi fluoresensi

Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum
Penampak Bercak kimia, berdasarkan sifatnya:
Fase diam
1. Permanen: Asam sulfat pekat, ninhidrin
2. Sementara: Uap Iodium
Mekanisme

 Penampak Penampak Bercak kimia, berdasarkan spesifisitasnya:

bercak
1. Spesifik:
ninhidrin: untuk zat dengan atom N (protein,
 Peralatan Alkaloid dll)
2. Umum:
Penggunaan
Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir semua zat)
Rekayasa
Penampak bercak atau noda diperlukan jika noda atau bercak
nya tidak berwarna (tidak kelihatan). Dengan penampak
bercak, bisa dilihat berapa banyak analit/senyawa dalam suatu
sampel
Seperti yang dibahas dibelakang, bisa asam sulfat pekat yang
disemprotkan ke plat KLT, atau uap iodium dll.
Tapi ada juga lempeng atau plat KLT itu sendiri sudah
ditambahkan zat yang berfluorisensi, sehingga bercak/noda
tsb akan terlihat bila kita tempatkan dibawah lampu UV
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak

bercak

 Peralatan

Penggunaan

Rekayasa
Chamber
Penjenuhan Chamber

*Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih

kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring.
*Penguapan dari fase gerak dari permukaan
lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan
menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility
hasil keterulangan Rf tak bagus.
*Fase gerak yang tidak mau campur dengan
sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak
jenuh
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak

bercak

 Peralatan

Penggunaan

Metode normal Pengembangan plat KLT

Rekayasa
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

 Penampak

bercak

 Peralatan

Penggunaan peralatan untuk penjenuhan plat KLT

Rekayasa
Efek Penjenuhan plat pengembangan plat
Metode Pengembangan pada KLT

Berdasar arah pengembangan

 Menaik
 Menurun

Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
 Pengembangan 2 dimensi
Pemisahan KLT 2 dimensi
Gambar kiri atas adalah waktu
elusi/pengembangan pertama,
ada 3 noda yang kelihatan,
hijau, biru dan pink.
Gambar kiri bawah, pelat KLT
tadi di elusi dalam posisi rebah,
ternyata yang warna pink masih
ada analit kuning sehingga
sebenarnya ada 8 analit yang
ada dalam sampel yang kita
totolkan.
KLT:

Umum

Penggunaan KLT
Fase diam

1. Untuk penentuan jumlah komponen dalam

Mekanisme campuran.
2. Untuk penentuan identitas antara dua
 Penampak campuran.
3. Untuk memonitor perkembangan reaksi.
bercak 4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
5. Untuk penentuan kondisi yang sesuai untuk
 Peralatan
pemisahan pada kromatografi kolom.
6. Untuk memonitor kromatografi kolom .
Penggunaan

Rekayasa
KLT:

Umum
Bagaimana mendapatkan komposisi fase gerak
yang baik untuk KLT????
Fase diam

Mekanisme 1. Cari di pustaka (jika ada)

2. Jika tidak ada, cari yang sifatnya mirip
 Penampak
3. Jika tidak ada yang mirip lakukan percobaan
bercak a. Lakukan eluasi dengan fase gerak paling non polar
b. Lakukan kenaikan kepolaran secara gradien
 Peralatan
c. Evaluasi hasil, dan tentukan komposisi yang paling
Penggunaan baik

Rekayasa
KLT:

Umum
Contoh Peningkatan Kepolaran secara Gradien
Fase diam

Mekanisme Metanol:etil-asetat: (1:10)

Metanol:etil-asetat: (2:10)
 Penampak
Metanol:etil-asetat: (3:10)
bercak
Metanol:etil-asetat: (4:10)
 Peralatan Metanol:etil-asetat: (5:10)

Penggunaan Dst.

Rekayasa
Berdasarkan jenis fase, pengembangan dibagi:
Fase normal: jika fase diam lebih polar dari fase gerak
Fase terbalik: jika fase gerak lebih polar dari fase diam

Contoh fase normal: KLT dengan fase diam Silika

dan fase gerak petroleum eter

Contoh fase terbalik: KLT dengan fase diam C18

dengan fase gerak metanol
KLT:
KLT untuk Identifikasi
Umum Umumnya parameter yang digunakan Rf
 Totolkan, Jika ada senyawa pembanding
Fase diam
Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase
Mekanisme gerak
Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda
 Penampak
Jika mungkin gunakan penampak bercak yang
bercak khas
Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka
 Peralatan
sebagai pembanding
Anda dapat menggunakan KLT Scanner untuk
Penggunaan
melihat identitas analit

Rekayasa Jika perlu, anda dapat kerok dan dilakukan

KLT pada umumnya untuk analisa kualitatif, tapi sekarang
sudah dikembangkan untuk analisa kuantitatif seperti KLT
Preparatif, KLT Scanner atau KLT Densitometri, dan KLT
Kinerja Tinggi (KLT-KT) atau HPTLC (High Performance Thin
Layer Chromatography)
KLT:

Umum KLT untuk Preparatif (untuk analisa kuantitatif)

Fase diam Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang

lebih tebal
Mekanisme Totolkan, jika ada senyawa pembanding
Anda dapat menotolkan sampel secara bergaris
 Penampak
Setelah pengembangan, masing-masing hasil
bercak pemisahan dikerok dan dilarutkan dengan
pelarut yang sesuai.
 Peralatan
Jangan semprot dengan bahan kimia, sebagai
penampak bercak (gunakan UV atau uap Iod)
Penggunaan

Rekayasa
Cara Menyari/ekstrasi hasil kerokan (langkah
ke-4)

Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi

tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian diambil
lapisan tipis bersama bercaknya.
Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala,
ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk,
dan setelah larut, disaring.
Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai
tepat tanda ( 10,0 ml - misalnya). Larutan siap diuji
dengan alat spektrofotometer.
Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
KLT:

Umum KLT untuk Kuantitatif

Fase diam
Totolkan senyawa pembanding yang diketahui
kadarnya
Mekanisme
Gunakan pipet kapiler terukur volumenya /
 Penampak
microsiringe
Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel dan
bercak bandingkan dengan senyawa pembanding
Untuk menghitung intensitas anda bisa gunakan
 Peralatan
KLT scanner/densitometer atau dikerok dan
gunakan spektrofotometer
Penggunaan

Rekayasa
 KLT – DENSITOMETRI atau KLT Scanner

Metoda analisis instrumental yang berdasarkan

interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang
merupakan noda pada KLT
Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang
mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang
diatur dari 200 - 700 nm.
Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi
sinar atau emisi sinar (flouresensi)
Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan
(hanya untuk KLT dengan pendukung gelas/kaca),
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.

Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda

dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer
digunakan alat khusus reflection photomultiplier,
sebagai pengganti  photomultiplier pada
spektrofotometer.
Pada era perkembangan teknik
kromatografi saat ini pemakaian "Thin
Layer Chromatograph Scanner" yang
lebih populer dengan nama
densitometer makin banyak dipakai .
lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan
noda pada KLT secara :
• Absorpsi
• Transmisi
• Pantulan (refleksi) pendar fluor
• Pemadaman pendar fluor
SUMBER SINAR

• Pada umumnya spektrofotodensitometer memberikan rentang

gelombang penentuan 200-630 nm.

• Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada daerah

ultra violet dan lampu tungstein pengukuran pada daerah sinar
tampak.

• Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor

dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi.

• Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau

absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang maksimal.
Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif
analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang
yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.

S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode

densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif ultramikro.
Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam
cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250)
ng, LSD dengan kadar (2-150) ng, dan kholesterol (4
-150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda
(kromatogram) KLT.
GAMBAR KLT-DENSITOMETER
 Cara Kerja KLT-Densitometer

Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan. diuji

dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X,Y). agar
sinar dapat tepat mengenai pusat bercak.
• Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat kan
pada satu garis deretan Y, bercak diatur, dan
gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan
bercak, menggunakan mikrokomputer.
• Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan
secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan
scanning lebih dulu.
HASIL SCANNING SATU BERCAK
 HPTLC (KLT-KT = KLT-Kinerja Tinggi)

Maksud:
Mendapatkan pemisahan dan hasil analisis yg
lebih baik dari KLT biasa.
Kelebihan:
Pada fase diamnya; berukuran sangat halus dan
pori-porinya seragam serta tebal lapisan nya
hanya 0,1 mm.
Ukuran partikel diam yang lebih kecil ini akan menye-
babkan semakin besarnya jumlah lempeng teoritis,
karenanya pemisahan menjadi lebih efisien.
Kelebihan lain;
 Sampel digunakan lebih sedikit (bercak penotolan-
nya berdiameter 0,1 – 0,5 mm)
 Lempeng dengan ukuran 10 x 10 cm sudah cukup
untuk analisis ( = hemat fasa gerak)
 Fasa diam yang digunakan hanya silika gel
KROMATOGRAFI KERTAS
Kromatografi planar atau bidang atau datar,
selain KLT juga ada satu lagi yaitu
kromatografi kertas (kertas = datar atau
planar permukaannya)
 KROMATOGRAFI KERTAS = PAPER
CHROMATOGRAPHY

Fasa diam = air, yang disokong oleh

molekul-molekul selulosa dari kertas
Fasa gerak = biasanya merupakan
campuran dari satu atau lebih pelarut
organik dan air
Perlu diperhatikan: fasa diam = air, bukan kertas
(fasa gerak=pelarut= cair) berarti partisi. Kalau
KLT=adsorbsi
Air tidak dengan sengaja ditambahkan , tp air
pasti akan secara otomatis ada pada kertas
saring karena selulosa adalah senyawa ber-sifat
polar dan bentuk polimernya berlobang-lobang,
akan dapat diisi oleh air dari udara.

Fasa diam air = polar artinya KKt berguna untuk

memisahkan senyawa yang bersifat lebih
nonpolar
Fase gerak/Eluen: biasanya campuran
pelarut organik dg air dan berbagai tambah-
an seperti asam,basa dll untuk memperbesar
kelarutan dari berbagai komponen dan me-
ngurangi kelarutan komponen lainnya.
Penyiapan kertas sebagai pendukung fasa
diam

Kertas yg berpori dari selulosa murni,

memiliki afinitas besar terhadap air atau
pelarut polar lain dengan membentuk ikatan
hidrogen
Yang banyak digunakan kertas saring
Whatman no. 1.
 Metoda pengembangan/elusi
1. Metoda Penurunan atau Descending
 Ujung kertas dicelupkan dalam fasa gerak. Pertama kali fasa
gerak mengalir oleh gaya kapilaritas, setelah melewati batang
gelas maka alirannya disebabkan gaya gravitasi
2. Metoda Penaikan atau Ascending
Kertas dicelupkan dalam fasa gerak dan sampel tidak
terendam. Fasa gerak akan naik melalui serat serat kertas dari
kertas oleh gaya kapilaritas. Biasanya perambatan makin
pelan, karena gaya berat
3. Metoda Mendatar atau horizontal
Noda dicelupkan ditempatkan pada pusat dari kertas
(umumnya kertas saring berbentuk bulat) yang diberi sumbu
Fasa gerak bergerak ke arah tepi kertas membawa komponen-
komponen campuran.
 Tugas

1. Jelaskan prinsip dasar bekerjanya kromatografi

planar/bidang?
2. Jelaskan beberapa jenis teknik pengembangan /
elusi KLT
3. Apa yang dimaksud dengan Rf, buatkan contoh
dengan gambar noda pada plat KLT,cara menghitung
nilai Rf