KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

KROMATOGRAFI GAS
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Mata Kuliah : Kimia Farmasi I
Dosen PJ : Yusnita Usman, S.Si., M.Si., Apt.
PRODI : DIII Farmasi
Institusi : Stikes Nani Hasanuddin Makassar
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
Thin Layer Chromatography (TLC)

KLT/TLC dapat digunakan untuk teknik pemisahan,

analisa kualitatif dan analisa kuantitatif
 PENDAHULUAN
Kromatografi merupakan metode yang digunakan
secara luas untuk pemisahan, identifikasi dan
determinasi dari senyawa kimia dalam campuran
yang kompleks.
Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan
tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik,
aluminium.
Fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau
campuran cairan, biasanya pelarut organik dan
kadang- kadang juga air
 Fase Diam KLT
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang
lain berbeda karena strukturnya, ukurannya,
kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll.
Fasa diam yang digunakan KLT tidak sama dengan
yang digunakan untuk kromatografi kolom,
terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan.
Contoh : Silika gel, alumina, selulosa
 Fase Diam (Silika Gel)
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada KLT dan tersedia dalam ukuran
diameter 10-40m.
Makin kecil diameter silika gel, makin lambat kecepatan alir fase geraknya sehingga dapat
mempengaruhi kualitas pemisahan.
Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300-1000 m2/g.
Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-
macam silka gel yang dijual dipasaran:
1. Silika gel dengan pengikat, umumnya digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%).
Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati (starch) dan
dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan asam
sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.
2. Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama
seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV
A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah- kadmium sulfida atau mangan-
timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada ,
254nm).
3. Silika gel tanpa pengikat, dikenl dengan nama Silika gel H atau Silika gel N.
4. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi, digunakan untuk
keperluan pemisahan preparatif
 Fase Diam (Alumina)
Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk
kelompok fase diam yang beraktifitas tinggi.
Alumina yang digunakan pada KLT bersifat sedikit basa (pH
9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang
bersifat asam (pH 4).
Pada fase diam alumina digunakan CaSO4 sebagai pengikat
yang dapat menurunkan bebasaan pada tinggkat tertentu.
Sama dengan Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa
pengikat dan bahan indikator. Pemberian namapun identik
dengan silika gel dengan code G.H.P.F.
 Fase Diam (Selulosa)
Mekanisme pemisahan menggunakan selulosa sebagai fase diam,
memiliki mekanisme pemisahan yang sama pada kromatografi
kertas.
Perbedaannya hanya serat selulosenya pada KLT lebih pendek dari
pada serat selulosa kromatografi kertas.
Panjang serat bervariasi 2-20 . Serat lebih pendek menyebabkan
difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit
(lebih kecil).
Selulosa untuk KLT terdapat dalam bentuk selulosa serat asli
(contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel).
Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.
 Fase Diam (Selulosa)
Mekanisme pemisahan menggunakan selulosa sebagai fase diam,
memiliki mekanisme pemisahan yang sama pada kromatografi
kertas.
Perbedaannya hanya serat selulosenya pada KLT lebih pendek dari
pada serat selulosa kromatografi kertas.
Panjang serat bervariasi 2-20 . Serat lebih pendek menyebabkan
difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit
(lebih kecil).
Selulosa untuk KLT terdapat dalam bentuk selulosa serat asli
(contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel).
Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.
 Fase Gerak KLT
Fase gerak yang digunakan pada KLT adalah pelarut organik,
dapat digunakan satu macam pelarut organik saja ataupun
campuran.
Jika fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan
air maka mekanisme pemisahan adalah partisi.
Pemilihan pelarut organik sangat penting karena akan
menentukan keberhasilan pemisahan.
Pendekatan polaritas yakni pemilihan pelarut yang paling sesuai
dengan sifat fase diam dan solut.
 Pelarut organik digunakan
sebagai fase gerak pada KLT
Senyawa polar akan
lebih mudah terelusi
oleh fase gerak yang
bersifat polar dari
pada fase gerak yang
non polar.
Sebaliknya, senyawa
non polar lebih
mudah terelusi oleh
fase gerak non polar
dari pada fase gerak
yang polar.
Tahapan Kromatografi Lapis Tipis

Penyiapan dan Penotolan Sampel

Pengembangan (Elusi)

Pengamatan (mendeteksi) bercak /

visualisasi
 Penyiapan & Penotolan Sampel
Sampel /cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai
Larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk
menghindari penguapan.
Menggunakan pipa kapiler/pipet mikro, sampel ditotolkan 1-20 l larutan
yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak untuk kromatografi
absorbsi dan 5-2Qg sample untuk kromatografi partisi.
Untuk memudahkan penotolan dibuat garis lemah dengan pensil, disebut
garis awal dan diameternya diusahakan seragam. Di ujung plat juga dibuat
batas akhir dahulu sebelum pengembangan
Penotolan sampel yang terlalu banyak (over loaded) menyebabkan bercak hasil
pengembangan berbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan harga Rf.
Bila totolan sample telah kering maka plat siap untuk dielusi /
dikembangkan.
 Pengembangan (Elusi)
Umumnya pengembangan dilakukan dengan cara menaik dalam bejana (chamber)
pengembang dari gelas.
Di dalam bejana ini dimasukkan fase gerak hingga kedalaman 0,5 cm, pada dinding sebelah
dalam bejana ditempelkan kertas saring setinggi 20 cm yang ujung bawahnya tercelup fase
diam.
Fase diam akan merambat ke atas membasahi kertas saring, dengan demikian ruangan
dalam bejana tertutup ini akan lebih cepat dijenuhi dengan uap pelarut.
Setelah ruangan dalam bejana jenuh, plat KLT dimasukkan dimulai pengembangan atau
elusi.
Bercak sampel pada garis awal jangan sampai tercelup dalam fase gerak.
Fase gerak akan merambat naik membawa komponen sampel.
Komponen yang membentuk ikatan hidrogen lebih kuat dengan fase gerak akan terelusi
lebih cepat atau merambat lebih cepat. Sebaliknya kalau ikatan hidrogennya lebih kuat
dengan fase diam, komponen akan lebih lama tertahan fase diam atau merambat
lambat.
Pengembangan dihentikan pada saat fase gerak mencapai jarak tertentu, biasanya 1 cm
sebelum ujung akhir plat (batas akhir).
 Pengamatan Bercak/Visualisasi
1. Dengan cara merusakkan / mereaksikan komponen/senyawa yang ada bercak itu
Pereaksi semprot yang umum untuk senyawa organik adalah asam sulfat dalam
metanol.
Bercak dipanaskan di dalam oven, sebaiknya digunakan oven yang ada jendela
kacanya sehingga dapat diikuti perubahan bercak selama pemanasan menjadi bercak
warna hitam.
Umumnya reaksi oksidasi pada senyawa organik oleh asam sulfat. Pereaksi lain
adalah dengan disemprot dengan larutan lodium dan paling mudah adalah dengan
memasukkan plat kedalam bejana yang berisi uap lodium (kristal lodium diletakkan
dalam bejana, tidak merusak 75% senyawa).
2. Kedua tanpa merusakkan komponen / senyawa. Cara pertama dengan
menyemprotkan pereaksi penanda. Cara ini digunakan untuk senyawa berwarna atau
berpendar dibawah lampu UV (berfluoresensi). Tidak ada masalah menggunakan silika
tanpa tambahan zat berpendar. Sedang untuk senyawa yang tidak berpendar dibawah
lampu UV digunakan fase diam dengan tambahan zat berpendar.
Tabel Pereaksi Warna /Penanda & Penggunaannya
No. Pereaksi warna Jenis senyawa Warna
1. Anilina ftalat Gula mereduksi Berbagai warna

2. Anisaldehida dalam Karbohidrat Berbagai warna

H2SO4 dan asam asetat
3. Stibium triklorida Steroid, glikosida steroid. Berbagai warna
dalam kloroform Lipid alifatik, vit. A dll.
4. Hijau brom kresol Asam karboksilat Bercak kuning pada dasar
hijau
5. 2,4-Dinitrofenilhidrazin Aldehida dan keton Bercak kuning sampai
merah
6. Deagendorf Alkaloid dan basa organik Jingga

7. Besi III klorida Fenol Berbagai warna

8. Flourescein; Br2 Senyawa tak jenuh Bercak kuning pada dasar

merah jambu
9. Ninhidrin Asam amino, gula amino, Biru
asamfosfatida
 Analisis Kualitatif dengan KLT
Analisis kualitatif dengan KLT diperlukan senyawa murni pembanding.
Sampel dan senyawa pembanding dilarutkan pada pelarut yang sama.
Larutan sampel ditotolkan pada ujung pelat KLT, 2 cm sejajar dengannya
ditotolkan larutan senyawa murni dan disebelahnya lagi ditotolkan campuran
sampel dan senyawa pembanding.
Kromatogram diangkat diberi tanda batas akhir yang ditempuh fase gerak.
Diinventarisasi nilai Rf dan Rr.
Senyawa yang mempunyai nilai Rf yang sama dengan nilai Rf senyawa pembanding
dan pada pengulangan elusi dengan sistim berbeda tetap memberikan nilai Rf yang
sama, maka dapat disimpulkan sementara senyawa tersebut identik dengan
senyawa pembanding.
Untuk keperluan mencari sistim KLT yang dapat digunakan untuk senyawa
obat dapat dicari pada beberapa literature. Satu diantaranya adalah dari buku
Isolation and Identification of drugs; E.G.C.Clarke, Judith Berle, M.Sc.
The Pharmaceutical Press, London, (1974).
 CARA MENGHITUNG
FAKTOR RETARDASI SOLUR (Rf)
Faktor Retardasi solut (Rf )
jarak tempuh solut 1
Rf = =
Jarak yang ditempuh fase gerak 1 + k

nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut

mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k)
sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan kecepatan
yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini
teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan
fase diam
 Gambaran
Cara Menghitung Nilai Rf
Analisis Kuantitatif dengan KLT
Ketepatan dan ketelitian KLT untuk analisis
kuantitatif lebih rendah bila dibandingkan dengan
kromatografi gas dan kromatografi kinerja tinggi.
Analisis kuantitatif dibedakan 2 cara, yaitu :
1. Bercak langsung diukur
2. Bercak diambil (dikerok)
 (1) Bercak langsung diukur
Dengan dasar adanya hubungan antara luas bercak dengan banyaknya senyawa terlarut maka senyawa dapat diukur
kadarnya dengan mengukur luas bercak. Cara ini dibedakan lagi menjadi 2, yaitu :
a. Tanpa menggunakan kurva baku
Menurut Purdy & Truter: akar luas bercak berbanding lurus dengan logaritma(lO) berat senyawa yang ada.
Untuk menghitung dengan cara ini maka perlu dibuat tetapan untuk senyawa pada sistem yang tertentu.
b. Menggunakan kurva baku
Dibuat kurva hubungan kadar dan luas bercak dari senyawa murni pembanding.
Akan diperoleh persamaan garis lurusY = bX + a. Selanjutnya luas bercak sampel dapat dihitung. Adapun
urutan kerja yakni sebagai berikut :
1. Dibuat larutan mengandung senyawa murni yang akan dianalisis dengan 3 macam konsentrasi yang
diketahui.
2. Dibuat larutan sampel pada kadar tertentu sehingga setelah dielusi memberikan bercak yang bulat
(ideal).
3. ( 1 sampel, 3 laruta baku) ditotolkan secara duplo pada lempeng yang sama (20X20 cm).
Perlu diperhatikan:
- penotolan tegak lurus dengan alat suntik mikro, gelas kapiler.
- banyak larutan 5-10 pi.
- sekali penotolan saja dengan volume yang sama.
4. Lempeng dielusi / dikembangkan sampai jarak yang telah ditentukan (10-20cm) di dalam bejana yang
dijenuhi fase gerak. Kemudian ditampakkan/ divisualisasikan degan cara yang sesuai.
5. Luas bercak diukur pada alat densitometer. Dibuat kurva hubungan kadar dan luas kemudian dibuat
persamaan garis lurus. Kadar senyawa dalam dapat ditetapkan.
 (2) Bercak diambil (dikerok)
Cara ini akan memberikan perbaikan yang timbul karena memindahkan /mengerok
dan elusi. Ditentukan letak bercak dengan cara yang tidak merusak, mengerok
bercak beserta fase diam, kemudian diekstraksi dengan alat yang diperoleh diukur
kadarnya dengan spektrometri atau cara lain yang sesuai. Urutan kerja dapat disusun
sebagai berikut:
1. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, demikian juga senyawa murni
(pembanding) dilarutkan dalam pelarut yang sama dengan pelarut untuk sample.
2. Banyak sample yang ditotolkan harus diketahui dengan tepat.
3.Dikembangkan secara biasa dan divisualisasikan dengan cara yang tidak merusak.
4.Bercak yang dikehendaki diberi tanda dengan alat tajam, dibandingkan dengan
bercak baku.
5.Bercak beserta fase diam dikerok kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai
secara kuantitatif.
6.Larutan yang diperoleh bila perlu diuapkan dibawah rotary evaporator dimasukkan
ke dalam labu takar, ditetapkan kadarnya dengan cara yang sesuai.
 KLT Preparatif
Cara ini ideal untuk memisahkan sampel dalam jumlah kecil (50mg-1gram).
Larutan sample ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat.
Dielusi seperti cara-cara biasa yang telah dijelaskan didepan. Akan terjadi
bercak berupa garis atau pita.
Visualisasi dipilih cara yang tidak merusak. Jika terpaksa digunakan cara-cara
merusak misalnya, disemprot dengan pereaaksi, maka pelat ditutup sebagian
dan bagian kecil lain yang disemprot. Sehingga dapat diperkirakan letak
bercak berbentuk pita/garis lurus.
Pita yang diinginkan dikerok dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai.
Fase diam yang sering digunakan adalah silikagel dengan atau tanpa
indikator flouresensi 254 nm.
Sebaiknya menggunakan plat preparatif jadi karena kualitasnya lebih baik
daripada lapisan fase diam yang dibuat sendiri. Tebal optimumnya berkisar a1-
1,5 mm.
 KROMATOGRAFI GAS (GC)

Prinsip :
Kromatografi elusi (komponen didorong oleh
penambahan pelarut segar)
Pengertian Kromatografi Gas
 Penerapan Kromatografi Gas
Kromatografi gas selain berfungsi dalam pemisahan, juga berfungsi dalam
analisa baik kualitatif maupun kuantitatif.
Analisa kualitatif dapat dilakukan dengan menambahkan komponen murni yang
sama dengan komponen yang diduga terkandung dalam cuplikan yang dianalisa.
Analisa kuantitatif dapat dilakukan menggunakan 3 metode :
1. Metode Kalibrasi
Dilakukan dengan membuat larutan standar dengan berbagai
konsentrasi dan mengukurnya dengan kromatografi gas.
Dari pengukuran tersebut dihasilkan kromatogram untuk setiap
larutan standar.
Dari kromatogram-kromatogram tersebut kemudian dibuat kurva linear
antara konsentrasi larutan dengan tinggi puncak/luas puncak.
Sumber kesalahan pada metode ini adalah volum cuplikan dan laju injeksi.
Penerapan Kromatografi Gas (Lanjutan)
2. Metode Standar Dalam
Berfungsi untuk menghilangkan pengaruh yang timbul dari variasi seperti laju pengemban, temperatur
kolom dan detektor.
Persyaratan untuk standar yang efektif adalah :
1. Harus menghasilkan peak yang terpisah semuanya, tetapi harus terelusi dengan komponen-komponen
yang akan diukur.
2. Tinggi atau luas peak harus kira-kira sama dengan tinggi atau luas peak dari komponen yang akan
diukur.
3. Secara kimiawi harus serupa dengan contoh, tetapi tidak terdapat dalam contoh aslinya.
Persyaratan untuk standar yang efektif adalah :
Prosedur :
1. Penambahan standar dalam yang kuantitatifnya konstan ke volum tetap dari beberapa campuran
sintetik yang mengandung komponen yang akan ditetapkan dengan kuantitas yang diketahui yang
diubah-ubah.
2. Campuran tersebut dianalisis dengan kromatografi gas dan dibuat kurva kalibrasi dari persen
komponen dalam sampel versus angka banding luas peak komponen/luas peak standar.
3. Metode Normalisasi Area
Area setiap peak yang muncul dihitung dan dikoreksi terhadap respon detektor untuk jenis senyawa yang
berbeda.
Konsentrasi analit ditentukan dengan membandingkan area suatu peak terhadap total area semua
komponen.
 Mekanisme Kromatografi Gas
1. Gas bertekanan tinggi
dialirkan ke dalam kolom
yang berisi fasa diam
2. cuplikan diinjeksikan ke
dalam aliran gas dan ikut
terbawa oleh gas ke
dalam kolom.
3. Di dalam kolom akan terjadi
proses pemisahan cuplikan
menjadi komponen-
komponen penyusunnya. 5. Hasil pendeteksian direkam oleh rekorder dan
dikenal sebagai kromatogram.
4. Komponen-komponen
tersebut satu per satu akan 6. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah
keluar kolom dan mencapai komponen yang terdapat dalam cuplikan dan
detektor yang diletakkan di kuantitas suatu komponen ditentukan berdasarkan
ujung akhir kolom. luas peaknya.
 Komponen Kromatografi Gas (1)
1. Gas Pembawa
Gas pembawa adalah fase gerak/eluen/pelarut yang bergerak cepat.
Syarat : - Stabil
- Inert
- Murni
- Cocok dengan detektor
Contoh : Ar, He, H dan N
Gas pembawa memerlukan kecepatan aliran yang berbeda-beda untuk mencapai
efisiensi yang optimum dengan HETP (High Eficiency Theoretical Plate) minimum.
N = (10 cm/detik)
H = (35 cm/detik)
He = (25 cm/detik )
Kotoran yang terdapat dalam carrier gas dapat bereaksi dengan fasa diam. Sebagai
solusinya gas yang digunakan sebagai gas pembawa yang relatif kecil agar kolm tidak
rusak dan dilengkapi saringan (molecular saeive) untuk menghilangkan kotoran yang
berupa air dan hidrokarbon dalam gas pembawa
Komponen Kromatografi Gas (2)
2. Sistem Injeksi Sampel/Cuplikan
Syarat cuplikan
Mudah menguap saat diinjeksikan
Stabil pada suhu operasional (50-300 C).
Injektor berada di dalam oven dan suhunya
50oC lebih tinggi dari titik didih cuplikan
Volume cuplikan
- gas : 0,5 50 mL
- cairan : 0,2 20 L
Alat pemasukan cuplikan untuk kolom
terbuka dikelompokkan 2 kategori yaitu :
a. Injeksi split (split injection) dimaksudkan
untuk mengurangi volume cuplikan yang
masuk ke kolom
b. Injeksi splitless (splitless injection) lebih Gambar Sistem injeksi split
cocok digunakan untuk analisa renik
Komponen Kromatografi Gas (3)
3. Kolom
Kolom adalah tempat berlangsungnya proses pemisahan komponen yang terkandung
dalam cuplikan. Umumnya terbuat dari baja tahan karat atau terkadang dapat terbuat
dari kaca.
Di dalam kolom terdapat fasa diam (cairan, wax, atau padatan) dengan titik didih
rendah.
Syarat Fasa diam : - sukar menguap
- tekanan uap rendah
- titik didihnya tinggi (minimal 100 C di atas suhu operasi kolom)
- stabil secara kimia.
- Pemilihan fasa diam harus disesuaikan dengan sifat sampel
Contoh cairan untuk fasa diam: hidrokarbon bertitik didih tinggi, silicone oils, waxes,
ester polimer, eter dan amida.
Fasa diam ini melekat pada adsorben. Syarat Adsorben :
- Memiliki ukuran yang seragam
- Cukup kuat agar tidak hancur saat dimasukkan ke dalam kolom.
- Terbuat dari celite yang berasal dari bahan diatomae.
 Tabel Struktur fasa diam & sifatnya

Stuktur Fase Diam Sifat

Rtx/MXT-1
100% dimethyl polysiloxane
Stable to 360C
Polarity: non-polar
Uses : solvents, petroleum products,
pharmaceutical samples, waxes

tx/MXT-1301,
Rtx/MXT-624
6% cyanopropylphenyl
94% dimethyl polysiloxane Stable to 280C
Polarity : slightly polar
Uses: volatile compounds, insecticides,
residue solvents in pharmaceutical products
Tabel Struktur fasa diam & sifatnya (Lanjutan)
Stuktur Fase Diam Sifat
Rtx/MXT/XTI-5
5% diphenyl
95% dimethyl Polysiloxane
Stable to 360C
Polarity : non-polar
Uses : flavors, environmental samples,
aromatic hydrocarbons
Rtx/MXT-35
35% diphenyl
65% dimethyl Polysiloxane
Stable to 300C
Polarity : intermediately polar
Uses : pesticides, Aroclors, amines, nitrogen
containing herbicides
Rtx/MXT-20
20% diphenyl
80% dimethyl Polysiloxane
Stable to 310C
Polarity : slightly polar
Uses: volatile compounds, alcohols
Tabel Struktur fasa diam & sifatnya (Lanjutan)
Stuktur Fase Diam Sifat
Rtx/MXT/XTI-5
5% diphenyl
95% dimethyl Polysiloxane
Stable to 360C
Polarity : non-polar
Uses : flavors, environmental samples,
aromatic hydrocarbons
Rtx/MXT-35
35% diphenyl
65% dimethyl Polysiloxane
Stable to 300C
Polarity : intermediately polar
Uses : pesticides, Aroclors, amines, nitrogen
containing herbicides
Rtx/MXT-20
20% diphenyl
80% dimethyl Polysiloxane
Stable to 310C
Polarity : slightly polar
Uses: volatile compounds, alcohols
Komponen Kromatografi Gas (3)
3. Kolom (Lanjutan)
Dua jenis kolom yang biasa digunakan dalam kromatografi gas, :
a. Kolom pak (packed column)
Terbuat dari stainless steel atau gelas Pyrex, digunakan jika cuplikan yang akan dipisahkan bersifat
labil secara termal. Biasanya dicuci dengan HCl terlarut, kemudian ditambah dengan air diikuti
dengan methanol, aseton, metilen diklorida dan n-heksana. Proses pencucian ini untuk
menghilangkan karat dan noda yang berasal dari agen pelumas yang digunakan saat membuat
kolom.
Diameter kolom pak berkisar antara 3 6 mm dengan panjang 1 5 m.
Isi kolom : zat padat halus sebagai zat pendukung
fasa diam berupa zat cair kental yang melekat pada zat pendukung.
Dapat menampung jumlah cuplikan yang banyak
Umumnya diisi dengan 5% polyethylene glycol adipate dengan efisiensi kolom sebesar 40,000
theoretical plates
b. Kolom terbuka (open tubular column)
Terbuat dari stainless steel atau quartz.
Berdiameter 0,1 0,7 mm dengan panjang berkisar antara 15 - 100 m.
Penggunaan kolom terbuka memberikan resolusi yang lebih tinggi daripada kolom pak.
Berbeda dari kolom pak, pada kolom terbuka fasa geraknya tidak mengalami hambatan ketika
melewati kolom sehingga waktu analisis lebih singkat daripada jika menggunakan kolom pak.
Komponen Kromatografi Gas (4)
4. Termostat
Termostat (oven) adalah tempat penyimpanan kolom.
Suhu kolom harus dikontrol, bervariasi antara 50C - 250C.
Suhu injektor < suhu kolom, sedangkan suhu kolom < daripada suhu
detektor. Suhu kolom optimum bergantung pada titik didih cuplikan dan derajat
pemisahan yang diinginkan.
Operasi kromatografi gas dapat dilakukan secara isotermal dan terprogram.
Analisis yang dilakukan secara isotermal digunakan untuk memisahkan cuplikan
yang komponen-komponen penyusunnya memiliki perbedaan titik didih yang
dekat.
Sistem terprogram digunakan untuk memisahkan cuplikan yang perbedaan
titik didihnya jauh.
 Komponen Kromatografi Gas (5)
5. Detektor
Detektor berfungsi untuk mendeteksi komponen-komponen yang telah terpisahkan yang mengalir
bersama fasa gerak keluar kolom.
Dipilih berdasarkan tingkat konsentrasi yang diukur dan sifat dasar komponen- komponen yang akan
dipisahkan.
Macam-macam detektor :
 Komponen Kromatografi Gas (5)
5. Detektor (Lanjutan)

Gambar Detektor Daya Hantar Panas Gambar Detektor Ionisasi Nyala

 Komponen Kromatografi Gas (5)
5. Detektor (Lanjutan)

Gambar Detektor Penangkap Elektron Gambar Detektor Nyala Alkali

(Modifikasi Detektor Ionisasi Nyala)
 Komponen Kromatografi Gas (6)
6. Recorder
Rekorder berfungsi sebagai pencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa
kumpulan puncak, yang selanjutnya disebut sebagai kromatogram.
Jumlah puncak dalam kromatogram menyatakan jumlah komponen penyusun
campuran. Sedangkan luas puncak menyatakan kuantitas komponennya.
Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang digunakan oleh komponen untuk bergerak
sepanjang kolom menuju detektor. Waktu retensi sangat bervariasi dan bergantung pada
titik didih senyawa, kelarutan dalam fasa cair dan temperatur kolom.
Faktor yang mempengaruhi pemisahan
- temperatur kolom
- laju alir gas pembawa
- pemilihan fasa diam
- panjang kolom.
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPY (HPLC)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa

juga disebut dengan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif.
 Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia
berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan
dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi
dari kromatografi kolom.
Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh
gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan
tekanan tinggi sampai dengan 400 atm.
Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat.
HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam
berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer,
dan industri-industri makanan.
 Penggunaan HPLC Secara Umum
Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik,
ataupun spesimen biologis
Analisis ketidakmurnian (impurities)
Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-
volatil)
Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter
ion
Isolasi dan pemurnian senyawa
Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang
mirip
Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace
elements)
 HPLC Fase jika fase diamnya lebih polar
Berdasarkan Normal dibanding dengan fase geraknya
pemisahan
fase HPLC Fase
jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase
Terbalik
geraknya

Kromatografi adsorpsi
Jenis-jenis
HPLC Kromatografi fase terikat
(Kromatografi Partisi)

Kromatografi penukar ion

Berdasarkan Kromatografi Pasangan ion

pada
mekanisme Kromatografi Eksklusi Ukuran
sorpsi solut

Kromatografi Afinitas
 Prinsip Kerja HPLC
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada
HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan
kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-
puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan
hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan
ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
 Prosedur Penggunaan HPLC
1. Mula-mula solven diambil melalui
pompa, kemudian masuk ke dalam
katup injeksi berbutar, yang
dipasang tepat pada sampel loop.
2. Dengan pertolongan mikrosiring,
sampel dimasukan ke dalam sampel
loop yang kemudian bersama-sama
dengan solven masuk ke dalam
kolom.
3. Hasil pemisahan dideteksi oleh
detector, yang penampakannya
ditunjukan oleh perekam 5. Tekanan solven di atur dengan pengatur dan
(recorder). pengukur tekanan.
4. Pompa pemasuk solven pada 6. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang
tekanan konstan hingga tekanan dipisahkan dari suatu sampel. Tahap pemekatan
+ 4500 psi dengan laju alir dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk
rendah, yakni beberapa memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum
mL/menit. pengerjaan sampel dengan HPLC.
 Instrumen HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir),
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator
atau perekam.
 Instrumen HPLC (1)
1. Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan inert, biasanya menggunakan wadah
pelarut kosong yang dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter.
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas)
yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan
mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis.
Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur
yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,
polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan
elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sedangkan, untuk
fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
 Instrumen HPLC (1)
1. Persyaratan Fase Gerak (Lanjutan)
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan
yang akan dianalisis.
b. Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran
yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan
pada kolom.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar,
dan tidak beracun.
e. Zat cair tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP
f. Sesuai dengan detector.
 Instrumen HPLC (2)
2. Pompa
Syarat pompa : harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon,
dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Pompa berfungsi sebagai sistem penghantaran fase gerak secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa
dengan tekanan konstan.
 Instrumen HPLC (3)
3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom.
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara
otomatis atau manual melalui injeksi.
Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan
variabel volume (misalnya 20 500 L).
Syarat- syarat injektor yang baik :
a. Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit
mungkin
b. Mudah digunakan
c. Keberulangan tinggi
d. Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
 Tipe Injektor HPLC
1. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa
digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak
dipengaruhi
2. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang
digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan
pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil
dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
3. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis
(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksifan secara manual).
 Instrumen HPLC (4)
4. Kolom
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom pada HPLC ada 2 jenis yakni kolom mikrobor dan kolom konvensional.
Kolom mikrobor, mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin
 Fase Diam HPLC (4)
Umumnya fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol
(Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.
Silika- silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
 Instrumen HPLC (5)
5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
a. Detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias
b. Detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Karakteristik detektor HPLC :
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil;
Stabil dalam pengopersiannya;
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
 Perbandingan KCKT dengan KG

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap KG, keduanya dapat

digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama
baiknya.
Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis.
Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap,
KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti
KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih
besar dalam analisis.
 Keuntungan dan Kerugian KCKT
Waktu analisis cepat umumnya < 1 jam.
Namun, jika dibandingkan
Resolusi tinggi
Sensitivitas detektor, detektor absorbsi UV yang biasa dengan KLT, KCKT memiliki
digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar
dalam jumlah nanogram bahakan sampai picogram
beberapa kelemahan, yaitu :
kolom dapat digunakan kembali , berbeda dengan 1. Tidak dapat menganalisis lebih
kolom kromatografi klasik. Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu dari satu jenis sampel sekaligus
kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai
jenis sampel. 2. Kromatogram tidak dapat
Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah disimpan sebagai dokumen
Mekanisme pemisahan lebih variatif karena banyaknya
pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta otentik
interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak
memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai
mekanisme.
Mudah rekoveri sampel , umumnya detektor yang
digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan
pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detektor.