MATA KULIAH METODE FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

"IDENTIFIKASI EKSTRAK SECARA KROMATOGRAFI”

Oleh :

NAMA : SRI SEMINARWATI

STAMBUK : 15020190205
KELAS : C10

DOSEN : Apt. Dr.Asni Amin,S.Si.,M.Farm

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA
MAKASSAR
2021
 REVIEW
IDENTIFIKASI EKSTRAK SECARA KROMATOGRAFI

A. Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan

perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul).
Kromatografi adalah teknik pemisahan komponen dari campuran analit
dengan struktur berbeda menggunakan prinsip perbedaan distribusi
komponen tsb dalam 2 fase yang terdiri dari fase gerak dan fase diam.
 Fase diam atau adsorben : bahan –bahan yang tetap berada dalam
penyangga , bentuk : cair atau padat
- Penyangga : Bahan tempat melekatnya fase diam, contoh lempeng ,
kaca, kolom (kaca atau aluminium)
 Fase gerak : pelarut yang bergerak melalu fase diam , bentuk : cair atau
gas

Sifat fisika senyawa yang di pisahkan

1. Kepolaran

2. Adsorbsi/penjerapan dan partisi

3. Keatsirian/tingkat penguapan

MEKANISME PEMISAHAN KROMATOGRAFI

Interaksi fase diam dan fase gerak (terjadi interaksi antar molekul); namun
interaksinya berbeda pemisahan dapat terjadi diakibatkan oleh lebih dari
satu hal dibawah ini :

1. perbedaan daya serap (adsorption)

2.pertukaran ion (ion exchange)

3.partisi (partitioning)

4. Ukuran partikel
 Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain:

 Kromatografi Adsorbsi
Adsorbsi terjadi krn adanya ikatan hydrogen antara gugus fungsi dan
gugus hidroksil pada permukaan fase diam untuk silanol group (silica gel)
Senyawa polar bergerak lebih lambat drpd komponen nonpolar jika
fase geraknya silica gel atau alumina (karena senyawa polar akan lebih
terikat pada fase diam silica gel yang bersifat polar)
Interaksi antara komponen kimia dan gugus fungsi yang ada pada fase diam ,
silica gel , silanol OH (hidroksil bebas pada silica gel) dan gugus senyawa
lain .

 Kromatografi partisi
Mekanisme : Kelarutan relative komponen antara fase diam
(sorbent/stationary phase) dan fase gerak (solvent/mobile phase).
Komponen yang lebih larut dalam fase gerak akan bergerak keatas lebih
cepat dengan jarak yang lebih besar dibandingkan komponen yang lebih larut
pada fase diam
KLT fase balik adalah menggunakan fase diam dimana komponen
akan terpartisi diantara fase diam dan fase gerak
Fase diam lemak (lipid) dan fase gerak yang berair
Fase balik  fase diam adalah silica yang direaksikan dengan alkil
rantai lurus C-18 mbtk fase octadecasilyl (ODS)  Rp 18 ODS
Senyawa yang nonpolar akan bergerak lebih lambat karena fase diam pada
Rp 18 bersifat non polar, Sebaliknya senyawa polar akan bergerak lebih
cepat Karena larut dalam fase gerak

 Kromatografi pemisahan berdasarkan Ukuran Partikel

Pemisahan berdasarkan ukuran partikel dan masuk/keluar (terperangkapnya
partikel) ke fase diam
fase diam : ex : dextran gels,
Lifofilik jenis yang tersedia : Sephadex LH-20,
Sephadex : adsorbs, partisi, mungkin ion bermuatan (BM yg lebih besar
duluan turun)
 Kegunaan : pemisahan komponen hidrofobic terhadap komponen
kontaminan yang besar cth chlorophylls, fatty acids, and glycerides.
Pelarut organic (chloroform and methanol) -> these gel ini mengembang
membtk matrix.
Komponen bergerak dengan pelarut melalui gel, molekul yang kecil akan
masuk kedalam matriks gel.
Molekul yang besar akan berada diluar dan bergerak dengan kecepatan yang
lebih tinggi

 Kromatografi Pertukaran ion

Metode ini utk komponen yang bermuatan
Fase diam : resin polimer (bermuatan)
Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan afinitas antara komponen ion dan
fase diam

 KLASIFIKASI KROMATOGRAFI
Berdasarkan fasa geraknya:
• Liquid Chromatography
• Gas Chromatography

Berdasarkan fasa diamnya (interaksi komponen dengan fasa diam):

• Partition Chromatography
• Adsorption Chromatography

B. Pemilihan fase gerak dalam

kromatografi Metode kromatografi

Berdasarkan fase gerak – fase diam:

1. Cair – cair ; kromatografi cair (LC)

2. Cair-cair padat ;kromatografi cair (LC), Kromatografi penukaran ion ION ,

kromatografi kertas , Kromatografi lapis tipis

3. Gas-cair ; kromatografi gas (GC)

4. Gas – padat ; kromatografi gas

KROMATOGRAFI BERDASARKAN ASAS TERJADINYA PROSES PEMISAHAN :

1) Adsorpsi (fase diam : padat dan fase gerak : cair/gas)

pemisahan tergantung perbedaan polaritas molekul. contoh

 Kromt kolom konvensional

 Kromt lapis tipis

 Kromt Penukar Ion

 Kromt gas padat

 Kromt cair kinerja tinggi

2) Partisi (fase diam : cair dan fase gerak : cair )

pemisahan tergantung perbedaan koefisien distribusi. Contoh:

 Kromt kolom

 Kromt kertas

 Kromt gas cair

 Kromt cair kinerja tinggi

3) Filter ( fase diam : padat dan fase gerak : cair ), pemisahan tergantung
perbedaan struktur dan ukuran molekul
4) Suhu kritik (pengembagan kromatografi gas dan HPLC dan fase gerak
: CO2 super kritik)

Prinsip Kromatografi

Perbedaan afinitas komponen-komponen kimia sampel terhadap fase diam dan fase
gerak menyebab terjadinya perbedaan pemisahan kompenen kimia tersebut
Afnitas dipengaruhi oleh : adsorbsi dan kelarutan

Pemisahan : Pemilihan Fase diam dan fase gerak yang tepat dalam proses
pemisahan

a) jika lebih terikat pada fase padat: maka komponen kimia (noda) akan
lebih lambat terelusi
b) jika lebih larut dalam fase gerak, maka noda akan terelusi lebih dahulu
 - adsorbsi
Kemampuan komponen kimia untuk tetap melekat atau teradsorbsi pada
fase diam
- kelarutan
Kelarutan komponen kimia sampel dalam fase gerak

Pemilihan fase gerak berupa pelarut

a) isokratik : menggunakan satu sistem pelarut

b) gradient : dikembangkan dengan pelarut nonpolar kemudian
ditingkatkan kepolarannya setiap dielusi  berguna untuk memisahkan
pita yang berdekatan pada isolasi

Teknik pemilihan sistem kromatografi

a) pemilihan adsorben (fase diam) dan eluen tunggal (fase gerak)

b) pencarian kombinasi optimal dari eluen-eluen tinggal yang terpilih
berdasarkan model prisma
c) Pemilihan cara elusi ( sirkuler, antisirkuler, linar,metode kromatografi,
dan transfer eluen keberbagai teknik kromatografi lain

Tahap 2 : pencarian kombinasi optimal dari eluen-eluen tinggal yang terpilih

berdasarkan model prisma

RF = 0,2 -0,8

 Jika senyawa terelusi pada bagian atas lempeng maka kepolaran eluen harus
diturunkan (fase normal )

 Jika senyawa terelusi pada bagian bawah lempeng maka kepolaran eluen
harus dinaikkan (fase normal)

 Jika senyawa terelusi pada bagian atas lempeng maka kepolaran eluen
harus dinaikkan (fase balik)

 Jika senyawa terelusi pada bagian bawah lempeng maka kepolaran eluen
harus diturunkan (fase balik)
Pemilihan 2- 5 eluen disesuaikan kombinasi dari pelarut pada prisma

Dipilih 2 eluen untuk tahap pertama dan bisa dilanjutkan pada kombinasi lebih dari 2,
jika :

1. Jika kombinasi eluen memiliki kekuatan eluen yang berbeda utk pemisahan
senyawa-senyawa polar

2. Jika kombinasi eluen memiliki kekuatan eluen yang sama untuk pemisahan
senyawa2 yang bersifat nonpolar

Tahap 3 : Jika tidak didapatkan kombinasi eluen yang menghasilkan pemisahan

yang optimal dapat dipindahkan ke metode lain .

Perhitungan Polaritas campuran pelarut

 Dimana P’ab adalah index polaritas dari fase gerak

 ɸAdan ɸB adalah volume fraksi dari solven A dan solven B.
 P’a dan P’b adalah polaritas index dari solven murni A dan B.

C. Aplikasi dalam kromatografi lapis

tipis Prinsip KLT : partisi dan adsorbsi

Kromatografi padat – cair Disebut pula Kromatografi planar Fase diam berupa
lapisan tipis pada permukaan datar di atas pendukung (lempeng/plat) yang sesuai
Keuntungan secara umum dari KLT :Serbaguna, Cepat, Peka, Dapat dilakukan
identifikasi spesifik (disemprot dengan H2SO4 pekat)

- Keunggulan dibanding HPLC : mudah, sederhana, murah dan cepat

- Kekurangan : Daya pemisahan dan sensitifitas lebih rendah, terpengaruh
dengan lingkungan

KLT : Digunakan untuk pemisahan senyawa polar (tannins and phenols) and
nonpolar (lipids, chlorophylls, and waxes)
Simbol-symbol pada adsorben KLT

- Si atau Sil : Mengandung silika

- 60 : Ukuran pori
- F atau UV : Mengandung indicator Flouresensi
- 254 atau 366 : Untuk menunjukkan Panjang gelombang eksitasi
indicator flouresensi
- G : Pengikat gypsum (Kalsium sufat)
- H atau N : Tanpa pengikat
- RP : Reverse phase
- P : untuk preparatif

Perlengkapan dalam KLT

- Chamber
- Fase diam (Lempeng /plat KLT)
- Fase gerak
- Gegep/pinset
- Kertas saring
- Penggaris
- Pereaksi kimia spesifik
- Alat pendeteksi bercak (lampu

UV) Prosedur KLT

1. Persiapan

Chamber

- Tuangkan solven/eluen ke dalam chamber setinggi < 1 cm

- Penjenuhan chamber

Plat/lempeng KLT

- Potong plat KLT dengan ukuran tertentu (biasanya 2 x 10 cm)

- Buat garis penotolan
- ukur 1 cm dari bawah.
2. Penotolan sampel

3. Pengembangan KLT

- Masukkan ekstrak atau sampel yang telah ditotolkan pada plat KLT ke
dalam chumber berisi eluen yang telah dijenuhkan

- Elusi plat dengan eluen, hingga eluen mencapai garis atas

- Ambil plat jika eluen sudah mencapai garis batas atas.

4. Visualisasi bercak

- Pengamatan Langsung / mata telanjang

- Lampu UV 254 nm dan 366 nm

- Uap iodin

- Reagen penyemprot

Tailing : Spot yang dihasilkan berekor seperti komet atau spot saling tumpeng
tindih

Tailing dapat terjadi karena :

1. eluen tidak jenuh saat dimasukkan lempeng KLT yang telah ditotolkan sampel

2. kerapatan senyawa akibat kepolaran senyawa dalam sampel yang

dipisahkan

3. kombinasi eluen yang digunakan belum tepat untuk memisahkan senyawa

pada sampel

Pengamatan atau deteksi bercak

 Uap iodin, bercak mudah hilang, dapat dibuat permanen dgn disemprot 0,5%
benzidin dalam alcohol absolut
  Asam sulfat pekat pada pemanasan, bercak menjadi hitam. (asam sulfat 10
% dalam etanol / larutan asam sulfat dlam air , atau larutan asam sulfat 70-80
% dalam air

 Campuran asam sulfat dan kalsium bikromat atau campuran asam sulfat dan
asam nitrat

 Pereaksi khusus untuk golongan senyawa tertentu sesuai dengan literature

yang relevan

5. Interpretasi hasil

MACAM-MACAM PENGEMBANGAN KLT

- Pengembangan tunggal
- Pengembangan dua dimensi :
 Pengembangan ke 1 & ke 2 tak sama
 arah pengembangan ke 2 tegak lurus (90 0) pengembangan ke

1 Analisis kualitatif KLT

 Menggunakan grafik hubungan antara log konsentrasi dan luas bercak

 Mengunakan fotodensitometer
 Mengisolasi bercak, kemudian diidentifikasi dengan metode spektrofotometri

D. Aplikasi dalam kromatografi kertas (KKT)

Digunakan untuk pemisahan senyawa yang mudah larut dalam air ,
yaitu : Karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik, dan
senyawa fenolat
keuntungan : Mudah dan sederhana
 Kromatografi kertas analitik kualitatif
 Digunakan kertas Whatman No 1
 Tebal kertas 0,16 mm
 Untuk pemisahan senyawa polar
 Penjenuhan bejana 24 jam
  Waktu pengembangan : 30 ’ – 12 jam
 Kromatografi kertas
preparatif
 Kertas Whatman No. 3
 Tebal kertas 0,31 mm
 Sampel ditotolkan dalam bentuk pita
 Hasil : bentuk pita-pita
 Pita digunting
 Ekstraksi dengan pelarut

Kelebihan KLT selulosa dari pada kromatografi

kertas

• Pemisahan lebih tajam

• Waktu lebih singkat
• Difusi lebih sempit penyebaran bercak lebih sempit dari pada KKt
• Bermacama-macam penyangga
• Bisa menggunakan penampak bercak yang korosif
• Bisa untuk orientasi sistem pelarut yang akan dipakai dalam kromatografi
kolom
• Kapasitas lebih besar