METODE PEMISAHAN OBAT 5

KROMATOGRAFI
Pengertian Kromatografi
• Kata “chromatography” dikenalkan oleh tswett (1906)  “chroma”
atau“color” artinya warna dan “ graphein” atau “write” artinya menulis.
• Pemisahan klorofil dan pigmen dari tanaman menggunakan tabung
( kolom) yg diisi padatan kalsium karbonat dan dielusi dengan pelarut
organik  terjadi pemisahan yg berupa pita pita yg berwarna pada kolom
• Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut
diantara dua fase, yaitu ;
1) fase diam (padat atau cair) padatan berpori yg digunakan sendi
rian atau dilapisi dgn fase diam zat cair ( disebut dgn padatan
pendukung)
2) fase. Mobil atau fase gerak disebut eluent atau pembawa
3) elusi yaitu proses pergerakan eluent sepanjang fase diam
• Kemudian dilakukan identifikasi, setelah terjadi pemisahan, dgn ;
1) Reaksi warna.
2) Sinar Ultra violet.
Macam Kromatografi ;

1. Berdasarkan fase diam terdiri dari;

1.1 Padat.
1.2 Pertukaran ion.
1.3 Gel.

2. Berdasarkan fase gerak, terdiri dari ;

2.1 Gas.
2.2Cair.

3
 Berdasarkan macam fase diam dan gerak, terdapat macam-
macam type dari metode kromatografi, yaitu ;

• ada 4 type berdasarkan fase gerak -- fase diam :

cair – cair ; cair – padat ; gas – cair ; gas – padat

• kromatografi gas (gc) termasuk dalam type gas – cair (glc) dan
gas – padat (gsc)

• kromatografi cair (lc) termasuk dalam type cair- cair (llc) dan cair
– padat (lsc)

• kromatografi penukar ion termasuk type cair padat

• kromatografi kertas (pc) dan kromatografi lapis tipis (tlc)

termasuk type cair –cair (llc) dengan menggunakan padatan
pendukung yg berupa kertas/selulosa atau silika gel.
5
Jenis-Jenis Kromatografi
1) Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatogra
fi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu ;
a) gas chromatography dan
b) liquid chromatography.

Masing-masing golongan dapat dibagi lagi seperti

yang telah disebutkan pada definisi di atas.
 2. Kromatografi di dalam bentuk tempat

• Komatografi Kolom : Kromatografi kolom merupakan

teknik pemisahan di mana tempat stasioner dalam
tabung.

• Kromatografi Planar.
merupakan tehnik dimana tempat stationer berbentk
datar, terdiri dari ;
– Kromatografi Kertas
– Kromatografi Lapisan Tipis
3. KROMATOGRAFI BERDASARKAN ASAS TERJADINYA
PROSES PEMISAHAN :
a. ADSORPSI (FASE DIAM : PADAT & FASE GERAK : CAIR /
GAS), pemisahan tergantung perbedaan polaritas molekul.
contoh :
 Kromtografi kolom konvensional
 Kromtografi lapis tipis
 Kromtogrfi Penukar Ion
 Kromtografi gas padat
 Kromtografi cair kinerja tinggi
b. PARTISI (FASE DIAM: CAIR & FASE GERAK : CAIR),
pemisahan tergantung perbedaan koefisien distribusi.
Contoh:
 Kromtografi kolom
 Kromtografi kertas
 Kromtografi gas cair
 Kromtografi cair kinerja tinggi

8
c. filtrasi (fase diam: padat & fase gerak : cair),
pemisahan tergantung perbedaan struktur
dan ukuran molekul

d. suhu kritik (pengembangan kromatografi gas

dan hplc & fase gerak : co2 superkritik ),

sistem kesetimbangan dalam kromatografi lebih

ditekankan pada sistem kesetimbangan
partisi( sifatnya ideal) dari pada adsorpsi
(sufatnya non ideal)

9
 KROMATOGRAFI YANG DIBAHAS
1. Kromatografi gas-cair (Gass-Liquid Chromatography)
Menggunakan alat GLC
2. Kromatografi cair.
2.1 Kromatografi partisi cair-cair.
Fasa diam cair, dan mobil juga cair.
Prinsipnya partisi kedua zat cair.
2.2 Kromatografi pertukaran ion.
Prinsipnya, terjadi perpindahan kation, atau anion.
2.3 Kromatografi adsorbsi.
a) Kromatografi kolom.
b) Kromatografi kertas.
c) Kromatografi lapisan tipis
3. HPLC (Hight Performance Likuid Chromatography
Kromatografi cair
Kromatografi cair adalah kromatografi dengan
fasa gerak berupa zat cair.

Proses-proses distribusi fasa

1. Adsorpsi

2. Pertukaran Ion

3. Partisi Cair - Cair

Ad. 1. Adsorpsi
Adsorpsi adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran
dengan cara pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian
adsorben cair yang diikuti dengan pelarutan.

Persyaratan adsorben :
• Memiliki daya melarutkan bahan yang akan diabsorpsi yang sebesar
mungkin (kebutuhan akan cairan lebih sedikit, volume alat lebih
kecil).
• Selektif
• Memiliki tekanan uap yang rendah
• Tidak korosif
• Mempunyai viskositas yang rendah
• Stabil secara termis
• Murah
Alat Absorpsi Secara Skematis
Ad. 3. Partisi Cair - Cair
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara
dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu
diantaranya bertindak sebagai fasa diam dan yang
lainnya sebagai fasa gerak.
Ada dua macam sistem penggunaan dalam kromatografi cair-cair
:
1. kromatografi fasa normal
fase gerak → non polar ( ex: heksana, isopropil-eter)
fase diam → sangat polar (ex: air)
digunakan untuk memisahkan senyawa polar, sebab
senyawa polar akan tertahan lebih lama didalam kolom
yang polar, sedangkan senyawa yang non-polar akan
keluar lebih awal dari dalam kolom.

2. Kromatografi fasa terbalik

fase gerak → polar ( ex: air, metanol)
fase diam → non polar (ex: hidrokarbon oktadekana)
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa non polar.
Kegunaan Kromatografi cair-cair ;
1. Analisa Kualitatif
• Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi suatu
senyawa.
• Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang dianalisis
dengan t atau V suatu senyawa standar (yang telah diketahui)

2. Analisa Kuantitatif ;
Dengan metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar
senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran
tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu
segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas
kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga
kromatogram tersebut.
Analisa kuantitaf (lanjutan)
• Metode pengukuran luas puncak
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan
dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur
seperti menghitung luas segitiga yaitu :

Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika

kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan
rumus :
Diagram Analisa kuantitatif

Ada 2 Analisa kuantitatif, yaitu ;

1. Metode gunting dan timbang
2. Metode Integral
• Metode gunting dan timbang
Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas digun-
ting sesuai bentuknya, kemudian guntingan-guntingan
kertas kromatogram ini ditimbang. Berat dari masing-ma-
sing guntingan kromatogram ini akan sebanding dg kadar
senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.

• Metode Integrator
Integrator adalah peralatan elektronik yang sering dijumpai
pada peralatan kromatografi yang modern. Alat ini akan
mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu
gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas
kromatogram yang dibentuk secara elektronik.
• Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis
• Dilaksanakan dalam suatu kolom yg diisi dg
fase stasioner yg porous
• Digunakan cairan sbg fase mobil u/mengelusi
komponen sampel keluar dari kolom
• Kolom digunakan untuk memurnikan
senyawa / pemisahan campuran
• Dapat diterapkan pada skala besar
KROMATOGRAFI KOLOM
 RANGKAIAN DASAR
KOMPONEN KOLOM KROMATOGRAFI
1. Eluent, berfungsi sebagai fase gerak yang
akan membawa sampel masuk ke dalam
kolom pemisah.
2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluent
dan sampel masuk ke dalam kolom.
Kecepatan alir ini dapat dikontrol dan
perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan
perbedaan hasil.
3. Injektor, tempat memasukkan sampel dan
selanjutnya sampel dapat didistribusikan
masuk ke dalam kolom.
4. Kolom pemisah, berfungsi untuk memisahkan
ion-ion yang ada dalam sampel. Keterpaduan
antara kolom dan eluent bisa memberikan
hasil/puncak yang maksimal, begitu pun
sebaliknya, jika tidak ada "kecocokan", maka
tidak akan memunculkan puncak.
5. Detektor, berfungsi membaca ion yang lewat
ke dalam detektor.
6. Rekorder data, berfungsi merekam dan
mengolah data yang masuk
 JENIS KROMATOGRAFI KOLOM
• Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr
selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai
u/bhn isian kolom.
• Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara
lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg
fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil).
• Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen yg
berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner
scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobil.
• Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel
sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses
pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen
yg dipisahkan.
 KROMATOGRAFI ADSORBSI

• Zat padat sbg adsorben / fase stasioner

Alumina & silika gel paling populer
Urutan dr kemampuan adsorbsi bsr ke kcl :
 Alumina
 Charcoal
 Silika gel
 Magnesium
 Kalium karbonat
 Sukrosa
 Starch
 Selulosa
• Zat cair sbg fase mobil
 Zat pelarut yg mampu mlakukn elusi terlalu cepat tdk mampu
memisahkan dg baik
 Elusi yg terlalu lambat mnyebabkan waktu retensi yg trlalu lama
 Golongan pelarut yg diurutkan dg dasar kenaikan adsorbilitasnya
pd kolom alumina :
 Perfluorokarbon
 Hidrokarbon jenuh
 Hidrokarbon tak jenuh
 Halida & eter
 Aldehid & keton
 Alkohol & thiol
 Asam & basa
• Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala yang lebih
besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah
kolom gelas vertikal.
PENGISIAN & CARA KERJA KOLOM

• Pemasukan absorben kedlm kolom.

• Kepadatan diseragamkan dg vibrator/plunger/
dlm bntuk larutan (slurry) & partikelnya
dibiarkan mngendap.
• Fungsi glass wool di atas & dasar kolom sbg
penyangga isian.
• Kecepatan elusi dibuat konstan 1 cm/mnt
• Penggunaan kolom

 u/memisahkan campuran dari dua senyawa

dg membuat larutan jenuh dari campuran
menggunakan pelarut yang lebih disukai
dalam kolom.

 Membuka kran penutup untuk

membiarkan pelarut yang sudah berada
dalam kolom mengering sehingga material
terpadatkan rata pada bagian atas
 Menambahkan larutan secara hati-hati dari
bagian atas kolom. Kmdn kran dibuka
kembali sehingga senyawa campuran akan
diserap pada bagian atas material
terpadatkan, sehingga akan tampak seperti
gambar brkt ini:
• Selanjutnya ditambahkan
pelarut baru melalui bagian
atas kolom & cegah sedapat
mungkin jangan sampai
merusak material
terpadatkan dalam kolom.
• Kmdn kran dibuka, supaya
pelarut dapat mengalir
melalui kolom
• Pelarut dikumpulkan dalam
satu gelas kimia atau labu
dibawah kolom.
• Pelarut mengalir kontinyu,
shg tetap ditambahkan
pelarut baru dari bagian
atas kolom sehingga kolom
tidak pernah kering.
 Kromatografi Kolom

Kolom kromatografi
berkerja berdasarkan skala
yang lebih besar
menggunakan material
terpadatkan pada sebuah
kolom gelas vertikal.
Penggunaan kolom
Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu
kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau.
Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang sudah berada
dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas,
dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu
buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian
atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar disamping.
menamambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, jangan sampai
merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut
dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu
dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan
pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.
Perubahan yang mungkin terjadi sejalan perubahan waktu
Kolom Pemisahan Ion.

Prinsip Pemisahan Ion

Untuk memisahkan sejumlah anion dan kation
satu sama lainnya ;
a. Anorganik kation dipisahkan pada kolom
resin pemisah kation,
b. sementara anorganik anion dipisahkn pada
kolom resin pemisah anion.
Resin Pemisah Ion
 Contoh
Pemisahan ion
Na+, NH4+, K+, Mg2+ dan Ca2+

Resin-SO3-H+ + Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ ↔ Resin-SO3-Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ + H+
KROMATOGRAFI PLANAR
Kromatografi Planar (Kertas dan KLT) ;
Parameter pengukuran kualitatifnya adalah harga Rf, harga ini
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada
kromatografi, dan pada kondisi konstan.
Dengan demikian Rf adalah perbandingan antara jarak senyawa
dari titik awal, dengan jarak tepi muka pelarut dari titik awal;
Jika dibuat rumus ;
Jarak titik tengah noda dari titik awal
Rf =
jarak tepi muka pelarut dari titik awal

Rf adalah kepanjangan dari Relatif to front atau Ratio of front

Harga Rf selalu antara >0, dan <1
Kromatografi cair
Kromatografi cair adalah kromatografi dengan
fasa gerak berupa zat cair.

Proses-proses distribusi fasa

1. Adsorpsi

2. Pertukaran Ion

3. Partisi Cair - Cair

Ad. 1. Adsorpsi
Adsorpsi adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran
dengan cara pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian
adsorben cair yang diikuti dengan pelarutan.

Persyaratan adsorben :
• Memiliki daya melarutkan bahan yang akan diabsorpsi yang sebesar
mungkin (kebutuhan akan cairan lebih sedikit, volume alat lebih
kecil).
• Selektif
• Memiliki tekanan uap yang rendah
• Tidak korosif
• Mempunyai viskositas yang rendah
• Stabil secara termis
• Murah
Kromatografi cair
Kromatografi cair adalah kromatografi dengan
fasa gerak berupa zat cair.

Proses-proses distribusi fasa

1. Adsorpsi

2. Pertukaran Ion

3. Partisi Cair - Cair

Ad. 1. Adsorpsi
Adsorpsi adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran
dengan cara pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian
adsorben cair yang diikuti dengan pelarutan.

Persyaratan adsorben :
• Memiliki daya melarutkan bahan yang akan diabsorpsi yang sebesar
mungkin (kebutuhan akan cairan lebih sedikit, volume alat lebih
kecil).
• Selektif
• Memiliki tekanan uap yang rendah
• Tidak korosif
• Mempunyai viskositas yang rendah
• Stabil secara termis
• Murah
Faktor-faktor yang memepengaruhi harga Rf, adalah ;
1. Pelarut.
2. Bahan pengemban (jenis dan ketebalan lapisan).
3. Temperatur.
4. Kejenuhan ruangan akan pelarut.
5. Kelembaban udara.
6. Konsentrasi dan komposisi larutan yang diperiksa.
7. Panjang trayek migrasi.
8. Senyawa asing dan pencemaran pelarut.
9. Ketidak homogenan kertas atau lapisan tipis.
10. Arah serabut kertas.
11. Mutu lapisan tipis atau mutu kertas.
12. Jumlah senyawa yang ditotlkan.
Macam-macam Harga Rf ;
1. hRf adalah harga Rf dikalikan 100, sehingga harganya
selalu dalam bilangan bulat.
2. Rst. Karena banyak faktor yang mempengaruhi Rf, maka
dianjurkan pada saat melakukan percobaan disandingkan
dengan larutan baku pembanding. Dengan demikian Rst
adalah perbandingan jarak tempuh senyawa terhadap
jarak tempuh senyawa pembanding, dalam rumus sbb ;

Jarak tempuh senyawa.

Rst = jarak tempuh senyawa pembanding
 Kromatografi Kertas
fase diam → kertas serap

Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap
senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Prosesnya disebut pengembangan, dibedakan 3 jenis
pengembangan yaitu ;
1. Kromatografi menaik.
2. Kromatografi menurun.
3. Kromatografi horizontal.
Kromatografi Kertas (lanjutan)
Kromatografi Kertas Dua Arah
Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahansubstansi yg memiliki
nilai Rf yang sangat serupa. Menggunakan dua pelarut yang berbeda
Kromatografi kertas pada pelaksanaannya lebih rumit dan
lama dibandingkan dengan Kromatografi Lapisan tipis.
Saat ini digunakan hanya untuk golongan senyawa yang
sangat hidrofil, dimana Penggunaan Kromatografi Lapisan
tipis tidak dapat digunkan, antara lain untuk senyawa ;
1. Gula.
2. Alkohol polivalen.
3. Asam alfa Amino.
4. Fenol atau asam Fenil karboksilat.
5. Asam organik alipatik.
6. Glikosida.
7. Zat anorganik (kation).
 Kromatografi Lapis Tipis
Alat dan bahan utama yang digunakan ;
• Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam
pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.
• Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau substansi yang dapat
berpendarflour dalam sinar ultra violet.
• Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
• Bejana Kromatografi.
• Alat ukur.
• Zat warna atau Sinar ultra violet untuk digunakan sebagai
identifikasi.
KLT merupakan
1. Kromatografi cair
Fase diam: padat, fase gerak: cair
2. Kromatografi planar
3. Umumnya fase diam silika gel, alumina
Lapis Tipis terdiri dari:
Plat: kaca, Alumunium, plastik
Adsorben: silika gel, alumina, selulosa, dll

Macam-macam adsorben di pasaran:

Silika gel G, silika gel GF, silika gel H
Alumina H, Alumina HF
Selulosa
SILIKA GEL: SiOH, SiO2
Sifat polar
Silika gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15%
Silika gel S (mengandung pengikat starch =pati
Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator
fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat aktif, yang
berfluoresensi pada 254 nm
Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat)
biasanya untuk kromatografi vakum
Silika gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung indikator
floresensi)
Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif &
mengandung indikator floresensi)
Alumina Al2O3
Kurang polar dibanding silika gel
Almunina basa, netral, asam
Alumina G, F, H, P
KIESELGUR

TERDIRI SiO2 > 89%

Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO, MgO, Na2O, dll
> Aktifitas rendah

Digunakan sebagai pendukung fase diam bukan sebagai

adsorben.
Contoh pemisahan beberapa Fenol dalam kondensat asap
tembakau. Pertama fenol-fenol dipasangkan dengan
diazotisasi dengan p-nitro aniline dan diekstrak dengan eter.
Larutan eter dipisahkan dengan KLT yang dilapisi kieselguhr
yang diempregnasi dengan formamide pemisahan
dikembangkan dengansolven benzene:cyclohexane
dipropylene glycol (30:70:3). Pemisahan ini menggunakan
sistem distribusi cair-cair
Mekanisme KLT (fase diam Silika
/Alumina):
1. Adsorbsi senyawa pada
adsorben/penjerap/fase diam
2. Kompetisi fase gerak & solut untuk
berikatan dengan fase diam, dimana solut
lepas dari permukaan fase diam =>
desorbsi
3. Senyawa dielusi oleh
eluen/pengembang/fase gerak
Selulosa = polimer
Mekanisme : kromatografi kertas = partisi
Serat lebih pendek, bercak lebih kecil dari KKt
Waktu lebih lama daripada adsorben lain, tapi lebih
singkat dari KKt
Tidak bisa menggunakan H2SO4
Perbandingan zat lapisan tipis dan efek pemisahannya
Adsorben Pemisahan melalui

Silika gel Adsorbsi dan partisi

Aluminium oksida, basa Adsorbsi dan pertumaran kation

Aluminium oksida, netral. Adsorbsi

Aluminium oksida, asam Adsorbsi dan pertukaran anion

Poliamida. Adsorbsi

Selulosa Partisi

Magnesium Silikat Adsorbsi

Aktifitas menurut Brockmann ;

Tingkat aktifitas Al2O3 Silika gel

(Kadar air dalam %) (Kadar air dalam %)
I - -

II 3 10

III 6 12

IV 10 15

V 15 20
Ukuran plat lapisan tipis ;
• Penotolan larutan uji 2,5 Cm dari bawah,
• minimal 2 cm dari sisi plat.
• Noda yang terjadi maksimal 6 mm.
• Jika lebih dari satu penotolan, maka jaraknya minimal 1,5
mm.
• Akhir dari elusi, kira2 1,5 Cm dari atas plat.

Metode pengembangan KLT ;

1. Metode 1 dimensi.
2. Metode ganda.
3. Metode Fungsional..
4. Metode PRP (Pemisahan-Reaksi-Pemisahan)
5. Tehnik Gradien.
Ad 1 Metode 1 dimensi.
Seperti Kromatografi kertas Menaik.
Ad 2 Metode ganda.
Setelah pengembangan dan pengeringan, dilakukan kemba
pengembangan, dengan pelarut sama atau lain.
Ad 3 Metode Fungsional.
Larutan uji diberi perlakuan pereaksi golongan, misalnya
Brominasi, esterifikasi, hidrolisa, oksidasi, dll.
Ad 4 Metode PRP (Pemisahan-Reaksi-Pemisahan).
Dengan tehnik 2 dimensi, diantara dua pengembangan ter-
dapat perlakuan pemberian reaksi, antara lain halogenasi,
oksidasi, hidrolisa, pengkopelan atau perubahan foto-kimia
Ad 5 Tehnik Gradien.
Adanya perubahan fasa, perbedaan aktifitas, tebal lapisan
ukuran partikel adsorben.
Metode Pengembangan pada KLT

Berdasar arah pengembangan

 Menaik
 Menurun

Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
 Pengembangan 2 dimensi
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran
pewarna ditempatkan pada garis itu.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi
pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu
diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.

Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah kondisi

dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut.
Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf
untuk komponen berwarna merah
menjadi:
Penampak Bercak:
1. Visual => analit berwarna
2. Penampak bercak kimia
Misalnya: Uap Iodium, Asam sulfat
pekat, ninhidrin
3. Lempeng diberi fluoresensi
Penampak Bercak kimia, berdasarkan sifatnya:
1. Permanen: Asam sulfat pekat, ninhidrin
2. Sementara: Uap Iodium

Penampak Bercak kimia, berdasarkan spesifisitasnya:

1. Spesifik:
ninhidrin: untuk zat dengan atom N (protein,
Alkaloid dll)
2. Umum:
Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir semua zat)
The TLC Reagent Spray
A Spray Cupboard Suitable for Sufuric Acid Spray
An automatic TLC Plate Sampler
Metode normal Pengembangan plat KLT
peralatan untuk penjenuhan plat KLT
Efek Penjenuhan plat pengembangan plat
Metode Pengembangan pada KLT

Berdasar arah pengembangan

 Menaik
 Menurun

Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
 Pengembangan 2 dimensi
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis

seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana

bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika
dilihat dengan mata. Ketika sinar UV
diberikan pada lempengan, akan timbul
pendaran dari posisi yang berbeda dengan
posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai
bidang kecil yang gelap.
Analisis Sampel yang Tidak
Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat
bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya
dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang
berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram
yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan

larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino
menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat
atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan
kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas
kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada

kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak
daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Kegunaan ;
Penggunaannya sangat sederhana, maka sering digu-
nakan untuk pemeriksaan, khususnya di Apotik.
Proses yang dapat digunakan adalah untuk ;
1. Pemeriksaan identitas dan kemurnian senyawa
obat
2. Pemeriksaan simplisia tanaman dan hewani.
3. Pemeriksaan komposisis dan komponen aktif
sediaan obat menurut tabel deklarasi.
4. Untuk menentukan kuantitatif masing2 senyawa
aktif campuran senyawa obat dgn jalan dikerok.
 KLT untuk Identifikasi
Umumnya parameter yang digunakan Rf
 Totolkan, Jika ada senyawa pembanding
Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase gerak
Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda
Jika mungkin gunakan penampak bercak yang khas
Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka sebagai pembanding
Anda dapat menggunakan KLT Scanner untuk melihat
identitas analit
Jika perlu, anda dapat kerok dan dilakukan iden secara
fisikokimia
 KLT untuk Preparatif

Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang lebih tebal

Totolkan, jika ada senyawa pembanding
Anda dapat menotolkan sampel secara bergaris
Setelah pengembangan, masing-masing hasil pemisahan
dikerok dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai.
Jangan semprot dengan bahan kimia, sebagai penampak
bercak (gunakan UV atau uap Iod)
 KLT untuk Kuantitatif

Totolkan senyawa pembanding yang diketahui

kadarnya
Gunakan pipet kapiler terukur volumenya/microsiringe
Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel dan
bandingkan dengan senyawa pembanding
Untuk menghitung intensitas anda bisa gunakan KLT
scanner atau dikerok dan gunakan spektrofotometer