Kromatografi

Teknik dasar pemisahan

 Tujuan

• Pengantar Kromatografi
• Arti kromatografi
• Sejarah/Dasar pemisahan pada kromatografi
• Pembagian kromatografi
• Kromatografi Planar (K.Kertas; KLT dan K
Desitometer)
 KOMPETENSI
• Mampu menjelaskan arti kromatografi
• Mengetahui memahami prinsip dasar pemisahan
pada kromatografi
• Mampu menyebutkan jenis-jenis kromatografi,
kegunaan nya pada analisis kualitatif dan kuantitatif
• Memahami prinsip kerja alat dan cara pembuatan
lempeng KLT/KK
• Mengetahui cara penanganan sampel, teknis
pengembangan analisis KLT,KK, KLT Densitometer
 KROMATOGRAFI
• Adalah suatu teknik untuk memisahkan
campuran senyawa menjadi komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fisika dan
kimia masing-masing komponen.
• Metode pemisahan beberapa senyawa
berdasarkan partisi antara dua fase pada
waktu bersamaan, dimana salah satu fase
disebut fase diam yang bersifat statis dan fase
lainnya adalah fase yang bergerak melalui
permukaan fase diam.
 Chromatography
(Kromatografi)

Bahasa Yunani

“Chroma” “Graphein”
(Warna) (menulis)
 Percobaan M.S. Tswett

Pemisahan pigmen tumbuh-

tumbuhan

Tabung gelas  kolom

Mikhail Semenovich Tswett Serbuk CaCO3  Packing
(1872 – 1919) Ekstrak daun  sampel
Petroleum eter  fase gerak
Kromatografi:

Merupakan teknik pemisahan yang paling

banyak digunakan untuk analisis
• Qualitative and quantitative
• Jenis campuran senyawa
• Memiliki akurasi dan presisi yang baik
• Dapat dikombinasikan dengan metode lainnya
 Pemisahan dengan kromatografi

• lebih baik dari pada ekstraksi.

• diibaratkan dengan corong pisah yang saling
berhubungan, yang bergerak dari atas ke
bawah dimana pada setiap corong pisah
terjadi pemisahan  terjadi berulangkali
• karena permukaan antar fase pada
kromatografi lebih besar disebabkan luas
permukaan kontak lbh besar.
lanjutan
• pemisahan senyawa dapat diamati dengan
perbedaan waktu retensi (tR) pada
kromatogram
• Waktu retensi = time of retention (tR) adalah
waktu yang diperlukan oleh analit dari awal
pemisahan hingga akhir terjadinya pemisahan
• Semakin lama analit berinteraksi dengan fase
diam –> semakin lama analit keluar dari
sistem –> tR semakin besar
lanjutan
• Sehingga ada suatu konstanta yang
menyatakan kecepatan migrasi solut melalui
fase diam.
• Kecepatan migrasi solut dipengaruhi oleh
perbandingan distribusinya (Kd atau kadang
disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif
solut pada fase diam dibanding fase gerak:

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak

 lanjutan
• Dari persamaan

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam:Kadar senyawa dalam fase gerak

semakin besar harga Kd suatu senyawa maka

waktu retensinya (tR) akan semakin besar
karena interaksi dengan fase diam besar dan
migrasinya semakin lambat.
KLASIFIKASI KROMATOGRAFI
KROMATOGRAFI

KROM. GAS KROM. CAIR

PLANAR KOLOM

KERTAS LAPIS TERBUKA TERTUTUP

TIPIS (TSWETT) (KCKT)
12
Klasifikasi berdasarkan Mekanisme Pemisahan

Kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)

Kromatografi Partisi (partition

chromatography)

Kromatografi Pertukaran ion

(ion exchange Chromatography)

Size Exclusion Chromatography (SEC)

Kromatografi Permeasi Gel; Kromatografi Filtrasi Gel
Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa
gerak dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis
bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya

Kriteria Nama
Kromatografi cair, kromatografi
gas
Fasa mobil
Kromatografi pertukaran ion
kromatografi gel, Kromatografi
Mekanisme adsorpsi, kromatografi partisi

Kromatografi kolom,
kromatografi lapis tipis,
Fasa stationer/diam kromatografi kertas
Lanjutan…………………

• Alat yang digunakan pada kromatografi konvensional biasanya

terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner
atau fase diamn(padatan atau cairan).
• Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan
campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang
cocok (fasa mobil).
• Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing
komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan
adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam
(stationer).
a. Kromatografi partisi

• Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum

partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen.
Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam
satu kali proses.
• Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa
stationer dan fasa mobil. Fasa stationer adalah adsorben dan
fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar
partikel yang ter adsorbsi.
• Contoh khas kromatografi partisi  kromatografi kolom yang
digunakan luas karena sangat efisien untuk pemisahan
senyawa organik
CARA KERJA KROMATOGRAFI KOLOM
Kolom(berupa tabung) diisi dengan bahan seperti:
- alumina,
- silika gel
- atau pati
yang dicampur dengan adsorben  dan pastanya diisikan
kedalam kolom.
Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas
sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut
(fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas
kolom.
CARA KERJA KROMATOGRAFI KOLOM (Lanjutan....)

Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke

bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh
adsorben (fasa stationer).
Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami
proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang.
Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat
terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-
masing zat terlarut.
Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk
beberapa lapisan.
Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan
spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan
berikut.
R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).
b. Kromatografi kertas
• Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas
prinsipnya sama dengan mekanisme pada
kromatografi kolom.
• Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas
saring, yakni selulosa.
• Cara Kerja: Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke
ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah.
Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam
pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil
(pelarut) dapat saja beragam: Air, etanol, asam asetat
atau campuran pelarut ini atau lainnya dapat
digunakan.
Lanjutan…………….

• Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam

amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat
yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan
tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan
asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi
kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan
kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi
mereka.
• Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas
yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses
secara dua dimensi dengan dua pelarut.
• Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-
1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda
analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat
campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara
vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino
antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada
selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai
ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino
bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R,
masing-masing asam amino diidentifikasi.
c. Kromatografi gas

• Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas.

Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat)
atau cairan (kromatografi gas-cair).
• Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil
padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi,
silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung
logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis.
• Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau
argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih
rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon
dioksida dapat menggunakan metode Kr Gas.
Lanjutan
• Dalam kromatografi gas-cair fase diamnya dapat
berupa :
- ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di
permukaan alumina teraktivasi,
- silika gel atau penyaring molekular, digunakan
sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom.
• Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur
dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan
setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil)
dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi.
• Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan
keluar lebih dahulu.
lanjutan
• Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis
senyawa organik yang mudah menguap seperti
hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan
minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses
dilakukan dengan teknik ini.
• Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya
interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan
untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif
untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan
yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda
deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini.
Metoda yang dipilih akan bergantung apakah
tujuannya analisik atau preparatif.
d. HPLC

• untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis)

senyawa organik skala besar, HPLC (high precision
liquid chromatography atau high performance liquid
chromatography) secara ekstensif digunakan.
• Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat
tersebut dapat dianalisis.
• Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk
mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan
memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi
pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.
Lanjutan………………

• Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada

silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa
stationer cair tidak populer. Kolom yang
digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada
kolom yang digunakan untuk kromatografi gas.
Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m.
• Kromatografi penukar ion menggunakan bahan
penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil
digunakan untuk analisis kation, anion dan ion
organik.
KROMATOGRAFI KOLOM
Liquid column
chromatography
Fase diam yang berada di dalam
kolom (tabung) berada dalam suatu
tabung yang terbuat dari kaca atau
polimer
Dengan adanya aliran FG, maka
gaya gravitasi akan bekerja bila
kolom pada posisi tegak.
Jika diperlukan tekanan positif
dari atas atau perlu adanya vacum
dari bawah, maka kolom dapat pada
posisi horizontal.
Dinding yang bening akan
membuat proses pemisahan dapat
diamati secara visual Untuk
senyawa bewarna) atau
menggunakan sinar UV
 Fasa Diam

Fasa diam atau adsorben (penjerap) - berupa zat padat.

Fasa diam yang paling umum : silika gel (SiO2), Alumina (Al2)3) , serbuk selulosa.
Kromatografi kolom dapat juga menggunakan teknik kromatografi pertukaran ion,
kromatografi fase terbalik, kromatografi pertukaran ion.

Fase Diam berbentuk :

1. serbuk halus atau gel, mikropori untuk peningkatan luas permukaan.
2. Perlu diperhitungkan rasio antara berat fasa diam dan berat kering campuran analit
yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom.
Untuk kolom silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada
kedekatan jarak elusi antar komponen analit.

Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom dipercepat biasanya lebih halus
daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel untuk kromatografi
dipercepat berukuran antara (40 – 63 µm), sementara untuk kromatografi gravitasi
antara (63 – 200 µm)
 Fase Gerak

Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut.
Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai faktor retensi senyawa
yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,8 untuk meminimalkan waktu
dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi.

Eluen dapat dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang

berbeda dapat dipisahkan secara efektif.

Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya

menggunakan lempeng KLT dengan fasa gerak yang sama namun ukuran
yang diperkecil.
 Fase Gerak
• Laju alir dapat dibuat optimum untuk masing-masing pemisahan.

• Semakin cepat laju alir eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk
melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih
baik. Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu
tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak,

• Kolom laboratorium sederhana bekerja dengan prinsip aliran grafitasi. Laju aliran
kolom semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas
fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah.

• Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas
bertekanan (misalnya: udaranitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui
kolom (kromatografi kolom kilat)
 Fase Gerak berupa campuran dari
dua atau lebih FG berikut:
• Polaritas pelarut yang dilewatkan melalui kolom
mempengaruhi tingkat pemisahan di mana senyawa bergerak
melalui kolom.
• Pelarut polar dapat lebih efektif digunakan untuk molekul
polar campuran untuk fase diam polar pada permukaan
adsorben dan juga akan lebih baik meloloskan konstituen
polar.
• Akibatnya, pelarut yang sangat polar akan bergerak bersama
molekul yang sangat polar dengan cepat melalui kolom. Jika
pelarut terlalu polar, gerakan menjadi terlalu cepat, dan
sedikit atau tidak ada pemisahan komponen campuran akan
dihasilkan.
 Fase Gerak berupa campuran dari
dua atau lebih FG berikut:
• Jika pelarut tidak cukup polar, tidak ada senyawa yang akan
terelusi dari kolom. Pilihan yang tepat dari jenis pelarut sangat
penting untuk keberhasilan penerapan kromatografi kolom
sebagai teknik pemisahan.
• Thin-Layer Chromatography (TLC) umumnya digunakan untuk
menentukan sistem pemisahan kolom kromatografi. Seringkali
serangkaian sistem pelarut semakin polar digunakan untuk
mengelusi kolom. Pelarut yang kurang polar pertama kali
digunakan untuk mengelusi senyawa yang kurang polar.
Setelah senyawa yang kurang-polar berada di luar kolom,
pelarut yang lebih-polar ditambahkan ke kolom untuk
mengelusi senyawa yang lebih polar.
 Cara Pemisahan
• Buat larutan jenuh dari campuran dengan
menggunakan pelarut yang sesuai
• Buka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang
sudah berada dalam kolom mengering sehingga
material terpadatkan rata pada bagian atas,
• Kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari
bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga
campuran berwarna akan diserap pada bagian atas
material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti :
Tambahkan pelarut baru
melalui bagian atas kolom,
cegah sedapat mungkin
jangan sampai merusak
material terpadatkan dalam
kolom.
Buka kran, supaya pelarut
dapat mengalir melalui kolom,
kumpulkan dalam satu gelas
kimia atau labu dibawah
kolom.
Karena pelarut mengalir
kontinyu, tetap tambahkan
pelarut baru dari bagian atas
kolom sehingga kolom tidak
pernah kering.
Hal yang terjadi adalah :
Terima kasih