KOLOM KROMATOGRAFI

• Kolom merupakan bagian terpenting pada

sistem kromatografi, tempat terjadinya
pemisahan komponen cuplikan , yang
berwujud puncak-puncak kromatogram.
• Faktor yang berkaitan dengan keterpisahan
puncak kromatografi:
1. Efisiensi kolom
2. Efisiensi pelarut
 EFISIENSI KOLOM
• Berhubungan dengan pelebaran
kromatogram yang disebabkan oleh
rancangan kolom dan kondisi pengerjaan.
• Efisiensi kolom diukur oleh jumlah pelat
teori (N) dengan persamaan:
tR
N = 5.545 (-------)2
w1/2
EFISIENSI KOLOM
 EFISIENSI KOLOM
• Atau:
tR
N = 16(-------)2
wb

Dimana,
N = jumlah pelat teori
tR = waktu tambat
W1/2 = lebar setengah tinggi puncak
Wb = lebar dasar puncak
 EFISIENSI KOLOM
• Kolom dengan jumlah pelat tinggi lebih
efisien dari pada kolom dengan jumlah
pelat yang lebih rendah.
• Sebuah kolom dengan jumlah pelat teori
tinggi akan memberikan puncak yang
sempit pada waktu tambatnya dari pada
sebuah kolom dengan jumlah pelat teori
yang lebih rendah.
 EFISIENSI KOLOM
• Ukuran lain untuk keefisienan kolom adalah
jarak setara dengan pelat teori (JSPT =
HETP = height equivalent to a theoretical
plate).
• JSPT adalah panjang kolom yang diperlukan
untuk mencapai kesetimbangan zat terlarut
di antara fase bergerak dan fase diam.
 EFISIENSI KOLOM
• Hubungan JSPT dengan N adalah:

JSPT = H = L/N
Dimana,
L = panjang kolom (mm)
N = jumlah pelat teori

• Makin banyak jumlah pelat teori per meter

makin tinggi efisiensinya atau makin kecil H
makin besar keefisienan kolom.
 KEEFISIENAN PELARUT
• Keefisienan pelarut disebabkan oleh
interaksi analit-pelarut dan menentukan
letak relatif pada kromatogram.
• Keefisienan pelarut dinyatakan sebagai nilai
maksima puncak (waktu tambat yang
disesuaikan), ditentukan oleh koefisien
distribusi linarut yang bersangkutan dalam
pelarut pada suhu tertentu.
 KEEFISIENAN PELARUT
• Bila suhu naik koefisien distribusi
bertambah kecil, berarti bagian zat terlarut
dalam fase gerak bertambah besar, karena
itu waktu elusi bertambah pendek.
• Ini mengakibatkan pemisahan berkurang,
tidak sempurna, karena yang melakukan
pemisahan adalah fase cair.
 KEEFISIENAN PELARUT
• Untuk mencapai pemisahan yang lebih baik
harus digunakan suhu yang lebih rendah.
• Suhu rendah mengakibatkan antaraksi fase
cair lebih besar, pemisahan lebih baik dan
waktu analisis lebih lama.
KEEFISIENAN KOLOM DAN
PELARUT
 DAYA PISAH (RESOLUSI)
• Pemisahan dua puncak yang berurutan diukur
dengan resolusi, R.
R= tR2 – tR1
0.5 (w2 - w1)
• Resolusi adalah ukuran keefiesienan kolom
dan pelarut (fase diam).
• Resolusi adalah derajat pemisahan komponen
campuran dalam sistem kromatografi
(sempitnya puncak dan juga pemisahan
antara dua maksimum puncak).
DAYA PISAH (RESOLUSI)
DAYA PISAH (RESOLUSI)
Pelebaran puncak disebabkan
oleh:
1. Difusi Eddy
2. Difusi longitudinal
3. Transfer masa
 Difusi Eddy
• Disebabkan karena adanya ukuran partikel
kolom yg tdk merata
 Difusi longitudinal
• Difusi zat dalam kolom
• Semakin lama zat berada dalam kolom
maka semakin besar kecenderungan
berdifusi, hal ini menyebabkan melebarnya
puncak kromatogram.
 Transfer massa
• Menggambarkan keberadaan sebagian
molekul zat dalam fase gerak dan sebagian
berada dalam fase diam (ketidaksamaan
molekul zat meninggalkan kolom)
ADA PERTANYAAN?
UJI KESESUAIAN SISTEM
PADA HPLC
A. Resolusi (daya pisah)
Dalam kromatografi gas (GC) dan
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC),
resolusi didefinisikan sebagai perbedaan
antara waktu retensi 2 puncak yang saling
berdekatan (ΔtR = tR2-tR1) dibagi dengan rata-
rata lebar puncak
(W1 + W2)/2
Nilai Rs harus lebih dari 1,5 karena akan
memberikan pemisahan puncak yang baik (base line
resolution).
Sedangkan untuk kromatografi lapis tipis (KLT) atau
elektroforesis planar, resolusi dapat dihitung dengan:

d : jarak antar 2 pusat zona

W1 dan W2 : rata-rata lebar zona
B. Penentuan Presisi Sistem

Setelah larutan baku diinjeksikan beberapa kali,

simpangan baku relatif (relative Standard
deviation, RSD) respon puncak dapat diukur, baik
sebagai tinggi puncak atau luas puncak. Menurut
USP, selain dinyatakan lain, sebanyak 5 kali
injeksi harus dilakukan jika dinyatakan nilai RSD
yang disyaratkan adalah ≤ 2,0 %; sementara itu
jika dinyatakan nilai RSD boleh lebih besar dari
2,0 %, maka dilakukan 6 kali replikasi injeksi.
C. Faktor asimetri (Faktor
pengekoran/tailing factor)

Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri

(tidak simetri), maka suatu perhitungan asimetrisitas
merupakan cara yang berguna untuk mengetahui atau
sistem kromatografi.

Puncak asimetri muncul karena berbagai factor.

Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan
penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi.
Kromatogram yang memberikan harga TF =1
menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat
setangkup atau simetris. Harga TF > 1 menunjukkan
bahwa kromatogram mengalami pengekoran
(tailing).

Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai

semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF
dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom
kromatografi.
D. Efisiensi Kolom
Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng
(plate number, N) yang didasarkan pada konsep
lempeng teoritis pada distilasi. Jumlah lempeng
(N) dihitung dengan:
tR : waktu retensi solut
σt : simpangan baku lebar puncak
Wh/2 : lebar setengah tinggi puncak
Wb : lebar dasar puncak
Gambar dibawah menjelaskan bagaimana cara
menghitung tR; Wh/2; Wb; dan σ suatu puncak
kromatogram.
E. Kapasitas kolom
Faktor kapasitas kolom dirumuskan dengan:
Yang mana:
k’ = faktor kapasitas
tR = merupakan waktu retensi solut;
tM = waktu retensi fase gerak (waktu retensi solut yang
tidak tertahan sama sekali).
Volume retensi yang bersesuaian juga dapat digunakan
karena volume retensi berbanding lurus dengan waktu
retensi. Volume retensi kadang-kadang terpilih dibanding
waktu retensi karena tR bervariasi dengan kecepatan alir.
Volume retensi selanjutnya dihitung dengan rumus:
V = (Vr-Vm)/Vm
Yang mana Vr= volume retensi solut; Vm = volume
retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan
sama sekali).
Berbagai metode untuk menentuakan kapasitas
kolom telah diusulkan antara lain untuk KLT:
k’ = (1-Rf)/Rf
Yang mana Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh
analit terhadap jarak fase geraknya atau:

Jarak yang ditempuh solut

Rf = -------------------------------------
Jarak yang ditempuh fase gerak