Pada perkembangan metode Kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromato

Scanner" yang lebih dikenal dengan nama densitometer makin banyak dipakai secara luas
oleh peneliti/ilmuwan. Densitometri adalah metode analisi instrumental yang berdasarkan
interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak atau noda pada
lempeng KLT.
Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada lempeng KLT yang ditentukan
adalah adsorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari
radiasi semula. Keunggulannya adalah dititikberatkan untuk analisis analit-analit dengan
kadar sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT.
Metode ini yang banyak diguanak dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif di bidang
farmasi terutama di bidang analisis obat bahan alam.
B. TEORI DASAR
Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen
atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan pelarut
pengembang/pengembang campur.
Fase Diam
Bahan padat pada penyangga : pelat elas/logam atau plastik dengan ketebalan 0,25
mm. Fase diam yang banyak dipakai : silika gel yang dicampur CaSO4 ; adsorben lain yang
juga banyak dipakai : alumnia, kieselguhr, celite, serbuk selulose, serbuk poliamida, kanji
dan sephadex.
Jenis fase diam : sama seperti pada KCKT dikenal beberapa macam sifat polaritas.
Silikal gel dikenal sebagai fase diam polar, yang dapat dibuat menjadi non polar (RP =
Reversed Phase) setelah dilakukan pengikatan hidroksilnya dengan : C2, C8, atau C18.
Mekanisme pemisahan adalah : adsorpsi,partisi, penukar ion atau fase terbalik
(adsorpsi-partisi). Apabila sampel bersifat non polar maka pelarut pengembangnya non polar.
Sedangkan bila sample bersifat polar, maka pelarut pengembangnya bersifat polar.
Ukuran fase diam 1-25 million dalam keadaan uniform/seragam, akan menghasilkan
pemisahan baik dan aliran fase gerak cepat dan merata.
Pada prinsipnya pemisahan KLT diusahakan dilakukan dalam keadaan netral.

Image 1 : KLT

Image 2 : Thin Layer Chromatography

Profil Kromatogram
Kromatogram KLT akan tampak setelah visualisasi dengan cara fisika atau kimia. Bila
proses pemisahan baik akan menghasilkan bercak atau noda bulat. Bila pemisahan kurang
sempurna bercak atau noda berekor, penyebabnya antara lain : pemilihan fase gerak yang
tidak tepat dan ketidakjenuhan chamber.
Penotolan sample dengan mikropipet dan selama eluasi suhu harus dijaga, karena
kenaikan suhu berpengaruh kepada Rf.

Image 3 : Kromatografi Kertas Menaik

Image 4 : Kromatogram

Faktor retardasi : Rf
adalah jarak migrasi komponen (bercak) dibagi jarak migrasi fase gerak

Rf = dR / dM = hRf / 100

Desintometri

S. Levi dan R Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat

analisis kuantitatif ultra mikro. Keduanya telah berhasil menentukan antara
lain testosterone dalam cairan biologis pada rentang kadar 1-250 ng, dan
kolesterol 4 -150 ng dengan pendar fluor padanoda (kromatogram) KLT.

Prinsip penentuan dengan metode desintometri hampir sama dengan metode

spektrofotometri.
Penetuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area / luas noda pada KLT
akan lebih terjamin kesahihannya dibanding dengan metode KCKT atau KGC,
sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau "zigzag" menyeluruh.

Persamaan Kubelka-Munk

Secara teoritis Kubelka dan Munk telah berhasil menerangkan mengapa

hubungan antara kadar analit yang dirajah terhadap area / luas kromatogram
tidak merupakan garis lurus. Menurut kedua ilmuwan tersebut, apabila
radiasi elektromagnetik (REM) dengan intensitas semula (I) jatuh pada
permukaan lapis tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak
lurus, maka sebagian dari REM tersebut direflesikan (Is) dan sebagian diserap
oleh analit lapisan tipis (I0) dan sebagian lagi diteruskan (It).

I = I0 + Is + It

Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis

tips (E) yang dinyatakan sebagai
Is = I. E

Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya
akan didapat:

I0 = I -Is
I0 = I - I.E = (1-E)
Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka
akan berlaku hukum Lambert-Beer seperti pada spektrofotmetri.
It = I0.e-K.x
x = tebal medium lapis tipis , K = koefisien adsorpsi. Harga e-K.x menyatakan
berkurangnya intensitas REM yang melewati medium.
Harga tersebut dikenal juga sebagai kerapatan optik atau "optical

density" dan medium yang dilewati REM.

Pada semua pelat KLT tidak memberikan homogenitas fase diam karena
keitdaksamaan partikel-partikel fase diamnya disamping kerja penyerapan
REM juga terjadi percikan radiasi oleh partikel fase diam.

Pada metode Spektrofotodensitometri / densitometri dikenal parameter :

K = (Koefisien penyerapan)
S = (Koefisien penghamburan)
Karena parameter S itulah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk ke
medium lapis tipis karena hilangnya intenstitas radiasi (dihamburkan) oleh
partikel-partikel fase diam. Di sinilah letaknya mengapa terjadi lengkung pada
Kurva teoritas "Kubelka-Munk"

Image 5 : Kurva Kubelka-Munk

Setiap pelat KLT yang dipakai memberikan harga SX bebrbeda (tiap merek
berbeda) harga SX berkisar : 0-10
Spektro densitometer (Thin Layer Chromato Scanner) modern dilengkapi
mikro komputer dengan harga operasional SX = 0-3 untuk melinearkan kurva
teoritis Kubelka-Munk tanpa mempersoalkan SX lagi.

C. INSTRUMENTASI
Komponen penting dari densitometer antara lain :

1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang ( selector), beam

spliter, thin layer plate (end view), detector phototube (transmitance
position)
Sumber radiasi ada 3 macam tergantung rentang panjang gelombang dan
prinsip penentuan.
Pada umumnya densitometri memberikan rentang gelombang penentuan
200-630 nm. Lampu Deuterium (D2) dipakai untuk pengukuran pada daerah
cahaya tampak.
Untuk penetapan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu
busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada spektorfotometri, pada
densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau adsorpsi dan refleksi
pada panjang gelombang maksimal.
Pada penetapan pendar fluor dan pemadaman pedar fluor juga harus
dilakukan pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas
realitif pendar fluor yang optimal.

Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis

yang diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi
difraksi 1200 garis/mm.

Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan

detektor umum yang dipakai pada densitometer.

D. APLIKASI

Metode KLT-Densitometri digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

Analisis Kualitatif

Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada

nilai Rf(Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu :
membandingkan Rf analit dengan Rf baku pembanding atau membandingkan
bercak kromatogram sample dengan kromatogram "Reference Standart" yang
dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan
sample pada pelat yang sama.

Analisis Kuantitatif

Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar

analit dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :
1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding
yang diketahui konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding

2. Kurva kalibrasi :

Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap

konsentrasi dari satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk
harus linear, kemudian dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan
kadar analit.