By : Chresiani Destianita Yoedistira, S.Farm., M.

Farm, Apt
Mikhail Tswett (1872-1919)
Ahli Botani dari Rusia
Pada tahun 1906 Tswtt menggunakan
kromatografi untuk memisahkan pigmen
pada tumbuhan.
Ia menyebut teknik pemisahan ini
sebagai Kromatografi karena dari hasil
analisis yang dihasilkan “ penulisan
warna” sepanjang kolom adsorben.

Chroma = Color (Warna)

Graphein = Write (Tulis)
Kromatografi = istilah umum yang digunakan
untuk berbagai macam teknik pemisahan
berdasarkan distribusi atau partisi dari sampel
(larutan) antara fase gerak atau fase diam.

*
* Berdasarkan macam fase gerak
* Berdasarkan pasangan fase gerak dan fase diam
* Berdasarkan mekanisme pemisahan

*
* Kromatografi Cair (KCKT/HPLC)
* Kromatografi Gas (KG/GC)
* Terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal
* Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati
keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang.
Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak
mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel
ke kolom.
* Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut atau
analit.
* Oktadesil silica (ODS atau C18) merupakan fase diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan
senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi.
* Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu
detektor universal dan detektor yang spesifik.
* Detektor universal mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif, sedangkan detektor
yang spesifik hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif
* Karateristik ideal yang harus dimiliki oleh suatu detektor adalah
sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yaitu dapat mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengoperasian.
4. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas.
5. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
6. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
* Kromatografi Gas ada 2, yaitu Gas Liquid
Chromatography (GLC) dan Gas Solid
Chromatography (GSC).
* Pemisahan pada GLC berdasarkan pada proses
adsorbsi partisi, sedangkan GSC padatan yang
digunakan adalah padatan yang berfungsi
sebagai bahan penyerap.
* Kromatografi Kolom
* Kromatografi Teknik Plannar : Kromatografi Kertas dan
Kromatografi Lapis Tipis (TLC)
* Mekanisme pemisahan kromatografi kolom merpakan
kromatografi serapan adsorpsi
* Digolongkan ke dalam kromatografi cair-padat (KCP)
kolom terbuka
* Fase Diam :
- Berupa adsorben yang tidak boleh larit dalam fase
gerak
- Ukuran partikel fase diam harus seragam
- Contoh : Aluminium, Silica Gel, Arang, Bauksit,
Magnesium Karbonat, Talk, Pati, dan Selulosa

* Fase Gerak :
- Dapat bberupa pelarut tunggal atu campuran
beberapa pelarut dengan komposisi tertentu
- Pelarut merupakan pelarut polar dan pelarut non
polar
* Kromatografi Planar mempunyai 2 Bentuk :
- Kromatografi Kertas
- Kromatografi Lapis Tipis
* Kedua teknik kromatografi ini digunakan untuk
memisahkan dan mengidentifikasi komponen analit dalam
jumlah kecil
* Pada kromatografi planar larutan cuplikan di teteskan
pada suatu titik pada permukaan fase diam planar.
Setelah pelarut menguap, kemudian dikembangkan
dengan fase gerak melalui permukaan tersebut dalam
ruang pengembang
* Gerakan fase gerak sebagai akibat dari efek kapiler pada
fase diam
* Berdasarkan mekanismenya, tergolong dalam
kromatografi partisi.
* Fase diam : Air yang terikat pada selulisa kertas
* Fase Gerak : Pelarut organik yang bersifat nonpolar.
* Dalam Kromatografi Kertas kemampuan penahanan komponen
(retensi) oleh fase diam dinyatakan dengan besaran Rf (Rate of
Flow). Harga Rf khas untuk setiap kompnen pada kondisi
tertentu.
Rf = Faktor Retensi
𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛
Rf =
𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑒𝑙𝑢𝑒𝑛

Harga Rf dipengaruhi oleh :

- Jenis Kertas
- Tebal Kertas
- Jenis eluen
* Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0. Nilai Rf yang baik yang
menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah sekitar 0,2 – 0,8
* Berdasarkan mekanismenya, tegolong ke dalam
kromatografi adsorbsi.
* Medium pemisahannya berupa lapis tipis zat adsorben
(alumina, silica gel) pada lempeng keca, plastik, atau
aluminium.
* Digunakan untuk :
- Memisahkan senyawa-senyawa yang sifatya seperti lipida-
lipida dan hidrokarbon yang sukar dengan kromatografi
kertas
- Memisahkan substansu campuran menjadi komponennya.
*Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan
penjerap berukuran kecil dengan diameter
partikel antara 10 – 30 µm.
*Fase Gerak merupakan campuran pelarut organik
karena daya elusi campuran kedua pelarut ini
membuat pemisahan terjadi secara optimal.
*Untuk memperoleh reprodusibilitas sampel yang
ditotolkan paling sedikit 0,5µl
*Sampel yang ditotolkan dikembangkan dalam
bejana kromatografi yang sebelumnya dijenuhi
oleh uap fase garak, kemudian tepian bawah
lempeng tipis yang telah ditotoli dicelupkan ke
dalam fase gerak kurang lebih 0,5 – 1,0 cm
* Deteksi Bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia
dan fisika :
- Kimia : mereaksikan bercak dengan pereaksi melalui
cara penyemprotan
- Fisika : menampakkan bercak dengan cara pencacahan
radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet
* Kromatografi Partisi
* Kromatografi Adsorbsi
* Kromatografi Penukar Ion
* Kromatografi Ekslusi

*
* Merupakan pemisahan komponen yang didasarkan atas
perbedaan polaritas pada matriks (fase diam).
* Fase diam dan fase gerak berupa cairan atau gas.
* Fase diam tidak bercampur dengan fase gerak
* Sampel : Berbeda kelarutan dengan fase diam (Komponen
yang lebih besar kelarutannya dalam fase diam tertahan
lebih lama)
* Contoh kromatografi partisi adalah Kromatografi Kertas
* Merupakan Kromatgrafi dengan prinsip pemisahan
berdasarkan proses adsorbsi analit dalam
permukaan padatan fase diam.
* Padatan fase diam dapat berupa alumina atau silika
gel yang memiliki luas permukaan yang besar.
* Dalam cara ini zat terlarut diadsorbsi pada
permukaan partikel padat. Didasarkan pada adanya
perbedaan sifat afinitas adsorbsi dari komponen
sampel pada permukaan padatan.
* Kromatografi penukar ion merupakan pemisahan berdasarkan
interaksi elektrostatik antara kelompok protein bermuatan
dan material padatan pendukung (matrix).
* Matrix memiliki ion yang bermuatan berlawanan dengan
protein untuk terjadinya pemisahan dan afinitas proteind ari
kolom dicapai dengan adanya ikatan ion.
* Protein dipisahkan dari kolom berdasarkan perubahan pH,
konsentrasi garam ion atau kekutan ion larutan buffer.
* Pertukaran Ion bermuatan positif disebut sebagai Pertukaran
matriks anion, dan protein bermuatan negatif di serap.
* Ketika matriks berikatan dengan kelompok yang bermuatan
negatif yang dikenal sebagai matriks kation, maka protein
bermuatan positif akan di serap.
* Disebut juga kromatografi permeasi gel atau filtrasi gel
* Cara pemisahan didasarkan pada ukuran molekul zat
terlarut
* Molekul-molekul zat terlarut dengan ukuran lebih besar
dari pori-pori padatan fase diam akan tertahan
* Biasanya digunakan untuk menentukan berat molekul
dari protein, dan untuk menurunkan konsentrasi garam
dari larutan protein.
* Sampel akan melewati gel berpori dalam wujud za
cair/gas. Gel berpori digunakan untuk memerangkap
partikel berukuran kecil, sedangkan partikel yang
berukuran besar tidak akan terperangkap dalam pori
sehingga dapat bergerak lebih cepat.
* Sebutkan dan jelaskan macam-macam
kromatografi berdasarkan mekanisme
pemisahan?
* Jelaskan apa itu Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi?
* Jelaskan apa itu Kromatografi Gas?