High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)
By : Chresiani Destianita Yoedistira, S.Farm., M.Farm., Apt
 Mikhail Tswett (1872-1919)
Ahli Botani dari Rusia
Pada tahun 1906 Tswett menggunakan
kromatografi untuk memisahkan pigmen
pada tumbuhan.
Ia menyebut teknik pemisahan ini sebagai
Kromatografi karena dari hasil analisis yang
dihasilkan “ penulisan warna” sepanjang
kolom adsorben.

Sejarah
Chroma = Kromatografi
Color (Warna)
Graphein = Write (Tulis)
 Definisi
• Merupakan suatu teknik pemisahan untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel.
• Merupakan metode yang dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif dan kualitatif.
• Termasuk kromatografi kolom karena fase diam yang
diisikan ke dalam suatu kolom.
• Proses pemisahannya tergolong sebagai kromatografi
adsorbsi atau kromatografi partisi.
Instrumentasi HPLC
 Instrumentasi HPLC

 Wadah Fase Gerak

 Fase Gerak
 Pompa pada HPLC
 Injektor
 Kolom
 Detektor
 Komputer
 Wadah Fase Gerak
 Merupakan tandon berisi fase gerak, yang
mempunyai sistem penyaring.
 Harus inert, tidak berinteraksi dengan bahan.
 Harus dapat menampung sejumlah tertentu fase
gerak.
 Fase Gerak
 Berisi campuran pelarut / pelarut tunggal yang
berperan dalam daya elusi dan resolusi secara
keseluruhan.
 Polaritas pelarut, fase diam dan sifat dari komponen
sampel sangat menentukan daya elusi dan resolusi
dari suatu fase gerak.

Fase Terbalik
Fase Normal
(fase diam Pelarut polar,
(fase diam Polar) Pelarut polar,
Kurang Polar) menurunkan
meningkatkan
kemampuan elusi kemampuan elusi
 Menyiapkan Fase Gerak
 Sebelum digunakan fase gerak harus dihilangkan
gasnya (degassing).
 Sangat dianjurkan untuk pelarut, dapar dan reagen
degan kemurnian yang tinggi. (HPLC grade)
 Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari partikel-pertikel kecil /
Pengotor.
 Pompa
 Pompa yang digunakan adalah inert terhadap fase
gerak.
 Bahan yang dipakai : gelas, baja tahan karat, teflon,
atau batu nilam.
 Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
dapat mengalirkan fase gerak sampai 3 ml/menit.
 Tujuan : menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung cepat, reprodusibel, konstan dan bebas
gangguan.
 Injektor
 Volume injeksi untuk semua sampel pada satu
percobaan harus sama.
 Volume injeksi dalam mikro liter
 Sampel harus bebas dari partikel
 Sampel injeksi harus tidak memiliki gelembung udara
 Injeksi dilakukan ketika fase gerak berada dalam laju
aliran konstan dan tekanan yang konstan melalui
kolom
Penyaringan Sampel
 Injektor
Sampel dimasukkan ke dalam
HPLC menggunakan syringe

Syringe terbuat dari bahan

gelas dan tembaga tahan karat
 Cara :
- Masukkan sampel / larutan standar ke dalam syringe
- Bersihkan ujung syringe dengan menggunakan tisu
- Posisikan syringe pada injektor dalam posisi “LOAD”
- Kemudian posisikan katup ke posisi “INJECT” kemudian
suntukkan sampel / larutan sampel ke dalam injektor.
 Load Position Inject Position

 Untuk injeksi sampel, posisikan  Katup di putar ke posisi

katup pada posisi “LOAD”. “INJECT”. Maka aliran fase
Kemudian dengan syringe gerak akan melewati loop dari
suntikkan sampel ke dalam pompa kemudian akan
loop sampel. membawa sampel ke kolom.
 Kolom
 Merupakan bagian HPLC yang terdapat fase daiam,
sebagai tempat pemisahan Solut dan Analit.
 Kolom bisa terbuat dari jenis plastik disebut cartridge,
atau terbuat dari stainless steel.
 Jenis –jenis Kolom
Konvensional

Ditinjau dari
ukurannya
Kolom
(panjang dan
HPLC
diameternya)
Microbore High Speed

Jenis Kolom Panjang (cm) Diameter (mm) dp (µm)

Konvensional 10 - 20 4,5 10
Microbore 10 2,4 5
High Speed 6 4,6 3
 Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran
rendah, sedang, dan tinggi, sehingga ODS merupakan fase
diam yang paling sering digunakan (Gandjar dan Rohman,
2009).
 Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai
untuk solute yang polar
 Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok
sebagai pengganti silica yang tidak dimodifikasi. Silika yang
tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang
bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.
 Jenis – jenis Kolom
Kolom Fase Normal
- Kromatografi dengan kolom konvensional,
Kolom memiliki fase diam normal yang bersifat polar,
Fase misalnya silika gel. Sedangkan fase geraknya
Normal bersifat non polar, sehingga analit yang
dipisahkan bersifat non polar.
- Senyawa polar akan melekat lebih lama pada
Dilihat dari silika yang polar dibanding senyawa yang non
Kolom fase gerak polar
HPLC dan fase
diamnya

Kolom Fase Terbalik

- Kolom fase terbalik adalah kolom yang fase
Kolom
Fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase
Terbalik geraknya bersifat polar, kebalikan dari fase normal
 Pre Kolom
 Pengaman kolom disebut Pre Kolom, karena
diletakkan sebelum kolom.
 Pre kolom dilengkapi dengan filter (saringan).
Sehingga pemisahannya sempurna serta menghindari
terjadinya penyumbatan (blocking) di dalam kolom
sehingga umur kolom lebih panjang.
 Detektor

Detektor Universal Detektor Spesifik

 Detektor universal mampu  Detektor yang spesifik hanya

mendeteksi zat secara umum, akan mendeteksi analit secara
tidak bersifat spesifik, dan spesifik dan selektif
tidak bersifat selektif.
 Karakteristik Detektor
 Karateristik ideal yang harus dimiliki oleh suatu detektor adalah
sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yaitu dapat mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengoperasian.
4. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas.
5. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
6. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8µl atau
lebih kecil, sedangkan kolom mikrobor selnya bervolume 1µl atau lebih
kecil lagi.
 Detektor spektrofotometri UV-Vis merupakan
detektor yang paling sering digunakan untuk
analisis di bidang farmasi karena sebagian besar
senyawa obat mempunyai struktur yang dapat
menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini menyerap
radiasi ultraviolet dan sinar tampak pada kisaran
panjang gelombang 190-800 nm oleh solut yang
mempunyai struktur-struktur atau gugus-gugus
kromoforik
Komputer, integrator, atau rekorder

 Komputer, integrator atau rekorder merupakan alat

pengumpul data yang terhubung dengan detektor.
Alat ini mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan
oleh detektor lalu akan memberikan suatu hasil
berupa kromatogram yang nantinya akan dievaluasi
oleh analis
Terimakasih