Sejarah kromatografi

Pemakaian Kromatografi:

Analitik:
= Kualitatif: Mengetahui identitatas suatu
analit
= kuantitatif : menentukan kadar analit
Preparatif:
= untuk mendapatkan komponen murni
Penggolongan kromatografi:
a. Berdasarkan fase gerak
=> kromatografi cair: KLT, KK, KKt, KCKT
=> Kromatografi gas: KGC, KGP

b. Berdasarkan fase diam

=> kromatografi Cair-Cair: KKt, KCKT
=> Kromatografi Cair-Padat: KLT, KK, KCKT
c. Berdasarkan penampang fase diam:
=> kromatografi datar / planar: KLT, KKt
=> kromatografi kolom: KK, KGC, KGP, KCKT
d. Kromatografi berdasarkan proses/mekanisme yang terjadi

=> Partisi
=> Adsorbsi
=> Pasangan Ion
=> Kromatografi Penukar Ion
=> size eksklusi
=> Permeasi gel
=> Filtrasi gel
=> afinitas biologi
Jika Kd besar konsentrasi analit dalam fase diam lebih besar
dari pada dalam fase gerak
Senyawa A lebih lama tinggal dalam fase diam

KD besar KD kecil
Kromatografi
suatu teknik pemisahan campuran menjadi
komponennya berdasarkan perbedaan migrasi
masing-masing komponennya dalam fase diam
akibat pengaruh dari fase gerak

Analyze
Separate Identify
Purify
Quantify
Mixture Components
Illustration of Chromatography
Stationary Phase

Separation

Mobile Phase

Mixture Components
Affinity to Stationary Affinity to Mobile
Components
Phase Phase
Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase

Black

Red

Yellow
Pemisahan dalam kromatografi terjadi karena
Perbedaan kecepatan migrasi dari berbagai
komponen dalam campuran
Dengan kata lain, pemisahan terjadi karena
perbedaan waktu tambat masing-masing analit dalam
fase diam
Penyebaran komponen campuran sepanjang fase
diam
Sampel
campuran
Arah aliran fase gerak

Kolom / fase diam

Analit dengan migrasi

paling cepat
Mengapa terjadi Perbedaan kecepatan migrasi ?

Dalam sistem kromatografi masing-masing analit akan

terdistribusi antara fase diam dan fase gerak sehingga
membentuk kesetimbangan.
Jumlah distribusi analit di antara 2 fase ditentukan oleh
konsntanta distribusi (Kd):
Kd A = [A]d / [A]g
[A]d = konsentrasi analit A dalam fase diam
[A]g = konsentrasi analit A dalam fase gerak
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi padat-cair
Kromatografi planar
Fase diam berupa lapisan tipis pada permukaan datar
di atas pendukung yang sesuai
Keunggulan dibanding KCKT: mudah, sederhana,
murah, cepat
Kekurangan dibanding KCKT: daya pemisahan dan
sensitivitas lebih rendah, terpengaruh lingkungan
Komponen penting pada analisis
dengan KLT
Peralatan (chamber)
Fase Diam
Fase gerak
Aplikasi sampel
Pengembangan
Deteksi bercak
Fase Diam
Fase diam pada KLT berupa fase yang polar (fase normal)
maupun fese non polar (fase terbalik).
Fase normal
1. Silica gel
Merupakan silica yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit
asam, fase ini lebih banyak digunakan. Untuk memperkuat
pelapisannya pada pendukung, silika gel ditambah gips
(Kalsium sulfat) sehingga dikenal dengan silica gel G.
Sebagai pendukung lapisan tipis digunakan kaca, dengan
ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20, atau 5 x 10 cm. Pendukung yang
lain berupa lembaran aluminium, atau plastik dengan
ukuran scperti diatas, yang umumnya dibuat oleh pabrik.
 Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa
flouresens, agar bila disinari dengan sinar UV
berflourosensi atau berpendar, sebingga dikenal
dengan silica gel GF254, yang berarti silica gel
dengan flouresen yang berpendar pada 254 nm
2.Alumina, (aluminium oksida)
Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih jarang
digunakan, bila akan digunakan diaktifkan kembali
dengan pemanasan. Alumina yang digunakan
sebagai fase diam untuk KLT umumnya yang bebas
air, schingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih
tinggi.
KLT:

Umum Alumina Al2O3

Kurang polar dibanding silika gel
Fase diam
Almunina basa, netral, asam

Mekanisme Alumina G, F, H, P

Penampak
bercak

Peralatan

Penggunaa
n

Rekayasa
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

Penampak
bercak

Peralatan

Penggunaa
n

Rekayasa
 3. Kiselguhr
Sebenarnya merupakan asam silica yang amorf, berasal dari
kerangka diatomeae, maka lebih dikenal dengan nama tanah
diatome, kurang bersifat adsorptif dibanding silica. Terdiri
dari SiO2 > 89% Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO, MgO, Na2O, dll
aktifitas rendah
4. Magnesium silicat
Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan floresil,
hanya digunakan bila adsor ben atau penjerab lain tidak
dapat digunakan.

5 Selulose
Polaritasnya tinggi dapat digunakan sebagai pemisah sccara
partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk Icmpeng.
Keduanya masih sering dipakai misalnya untuk pemi sahan
flavanoid.
KLT:

Umum Selulosa = polimer

Mekanisme : kromatografi kertas = partisi
Fase diam
Serat lebih pendek, bercak lebih kecil dari KKt
Mekanisme Waktu lebih lama daripada adsorben lain, tapi
lebih singkat dari KKt
Penampak Tidak bisa menggunakan H2SO4
bercak

Peralatan

Penggunaa
n

Rekayasa
KLT:

Umum

Penampak Bercak:
Fase diam
1. Visual => analit berwarna
Mekanisme 2. Penampak bercak kimia
Misalnya: Uap Iodium, Asam sulfat
Penampak pekat, ninhidrin
bercak
3. Lempeng diberi fluoresensi
Peralatan

Penggunaa
n

Rekayasa
KLT:

Umum
Penampak Bercak kimia, berdasarkan
Fase diam sifatnya:
1. Permanen: Asam sulfat pekat, ninhidrin
Mekanisme
2. Sementara: Uap Iodium

Penampak Penampak Bercak kimia, berdasarkan

bercak spesifisitasnya:
1. Spesifik:
Peralatan
ninhidrin: untuk zat dengan atom N (protein,
Alkaloid dll)
Penggunaa
n 2. Umum:
Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir semua
Rekayasa
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

Penampak
bercak

Peralatan

The TLC Reagent Spray

Penggunaa
n

Rekayasa
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

Penampak
bercak

Peralatan
A Spray Cupboard Suitable for Sufuric Acid Spray
Penggunaa
n

Rekayasa
 Fase diam
Umumnya digunakan silika
Dapat ditambahkan pengikat dan indikator fluoresensi
Mekanisme dominan: adsorbsi kadang partisi
Fase gerak/eluen/pelarut
Berdasarkan polaritas
Biasanya campuran
Studi pustaka dan coba-coba
Prinsip: like dissolves like
Senyawa polar lebih tertahan oleh fase diam
Senyawapolar lebih mudah larut dalm fase gerak yang polar
Simbol-simbol Pelat KLT
S, Si atau Sil Mengandung silika
60 Ukuran pori
F atau UV Mengandung indikator fluoresensi
254 atau 366 Setelah simbol F atau UV untuk menunjukkan
panjang gelombang eksitasi indikator fluoresensi
G Pengikat gipsum (kalsium sulfat)
H atau N Tanpa pengikat
RP Reversed Phase, silika yang dimodifikasi dengan
hidrokarbon
2, 8, 18 Panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika
P Untuk preparativ
KLT:

Umum
Istilah

Kromatografi Lapis Tipis = Thin Layer Chromatography

Fase diam
Pengembangan = development = eluasi = elusi
Mekanisme Eluen = pelarut untuk pengembangan
Eluat = pelarut yang mengandung analit hasil pemisahan
Penampak dengan kromatografi
bercak
Kromatogram = gambar hasil pemisahan
Peralatan Kromatograf = alat untuk kromatografi
Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik aw
Penggunaa / jarak migrasi fase gerak setelah pengembangan
n
RRf = 100 x Rf
Rekayasa
Kekuatan elusi pelarut pada silika dan polaritas pelarut
Aplikasi sampel
Totolan bercak sekecil mungkin
Biasanya 1- 2 mm, totolan besar: bercak menyebar dan
bertumpuk
Digunakan pelarut sampel yang bisa melarutkan
sampel dengan baik, tetapi mudah menguap dan daya
elusinya kecil
Secara manual/otomatis
Dapat digunakan pipa kapiler,
mikropipet, mikrosiring
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Deteksi Bercak
Berwarna atau tidak
Dengan lampu UV 254/366 nm
Jika menggunakan pelat KLT F: bercak yang tidak
berfluoresensi terlihat sebagai pemadaman (gelap)
pada latar belakang hijau/biru
Dengan penampak bercak
Disemprot/dicelup/diuapi
Destruktif/tidak
Umum/selektif
 Visualization (Detection of spots):
A- Universal methods:
1- Destructive methods:
The plated are sprayed with corrosive reagents and then heated
in oven where organic compounds will give charred spots. After
this treatment the materials can not be recovered.
e.g. Anisaldehyde / H2SO4
Vanillin / H2SO4
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

Penampak
bercak

Peralatan

The TLC Reagent Spray

Penggunaa
n

Rekayasa
 2- Non Destructive methods:
In these methods the materials can be recovered.
Day light for colour compounds.
UV light for fluorescent compounds (conjugated double
bonds).
I2 vapour for any compounds contain at least one double
bond
Spray with water where organic compounds appear as
white opaque spots.
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

Penampak
bercak

Peralatan

Penggunaa
n

Rekayasa
B- Specific Methods:

These reagents are used for the detection of certain

classes of compounds. They are usually
destructive.

Dragendorffs reagent for Alkaloids.

Ferric Chloride (FeCl3) for phenolic compounds.

Aniline phthalate for sugars.

Ninhydrine for nitrogenous compounds as

Amines, Amino acids.
Tabel Beberapa penggunaan pelacak bercak pada
kromatografi kertas

Nama Analit Nama Analit

pereaksi pereaksi
l.Sinar UV254 nm Senyawa flouresen 9. Pereaksi Tur. morfin
Seny.Amin Marquis
2
lodoplatinat Fenol, aril
ter/kuaterner 10. Peraksi Millon amin Ikatan
Sebyawa
3.Pereaksi fiuoresen
furfural Amin
Turunan ter/kuater.
Karbamat Turunan
11 .KMn04 + karbamat
tak jenuh
HeterosikUk amin kanabinol, sulfonamida as.sulfet
4.Pereaksi Simon Heterosiklik
Alkaloid/Amin kuar Ter.Heksa(penta
amin 12 .Ninhidrin As. amino
klorfenol) Ikatan
13. Nitroso-naftol primer
rangkap, seny.organik Ergot

5.DABdlm etanol Karbinol/Sulfonamid 14. Pereaksi alkaloid

a Mandelin Turunan
6.Dragendorff Alkaloid/amin kuater, 15. Vanilinas. ajmalin
Barbiturat
Ter.Heksa/penta Sulfat fenetoin,
7. Uap iodium klorfenol
8. UapNO2 Ikatan rangkap/ S
senyawa organik 40
40
Rate of flow (Rf Value):
Distance traveled by the spots
Rf = -----------------------------------------
Distance traveled by the solvent
The Rf of any compound must be less than one.
Solvent front

Distance travelled by
the solvent

Distance travelled by
the spot

Start line
 Tailing in Paper Chromatography:
In some cases instead of getting round spots a Tailed or comet
like spots are obtained leading to overlapping of the spots and
poor resolution.

Tailed or comet like spot

Penggunaan KLT

1. Untuk penentuan jumlah komponen

dalam campuran.
2. Untuk penentuan identitas antara dua
campuran.
3. Untuk memonitor perkembangan reaksi.
4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
5. Untuk penentuan kondisi yang sesuai
untuk
pemisahan pada kromatografi kolom.
6. Untuk memonitor kromatografi kolom .
KLT:

Umum

Fase diam

Mekanisme

Penampak
bercak

Peralatan

Penggunaa
n

Metode normal Pengembangan plat KLT

Rekayasa
Efek Penjenuhan plat pengembangan plat
Metode Pengembangan pada KLT

Berdasar arah pengembangan

Menaik
Menurun

Berdasarkan Dimensi
Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
Pengembangan 2 dimensi
Pemisahan KLT 2 dimensi
Contoh Peningkatan Kepolaran secara
Gradien

Metanol:etil-asetat: (1:10)
Metanol:etil-asetat: (2:10)
Metanol:etil-asetat: (3:10)
Metanol:etil-asetat: (4:10)
Metanol:etil-asetat: (5:10)

Dst.
Tingkatkan kepolaran
Rf sebaiknya 0,5
Turunkan kepolaran
Rf sebaiknya 0,5
Berdasarkan jenis fase, pengembangan dibagi:
Fase normal: jika fase diam lebih polar dari fase
gerak
Fase terbalik: jika fase gerak lebih polar dari fase
diam

Contoh fase normal: KLT dengan fase diam

Silika dan fase gerak petroleum eter

Contoh fase terbalik: KLT dengan fase diam

C18 dengan fase gerak metanol
 KLT untuk Identifikasi
Umumnya parameter yang digunakan Rf
Totolkan, Jika ada senyawa pembanding
Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase
gerak
Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda
Jika mungkin gunakan penampak bercak
yang
khas
Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka
sebagai pembanding
Anda dapat menggunakan KLT Scanner
untuk melihat identitas analit
 KLT untuk Preparatif

Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam

yang lebih tebal
Totolkan, jika ada senyawa pembanding
Anda dapat menotolkan sampel secara
bergaris
Setelah pengembangan, masing-masing hasil
pemisahan dikerok dan dilarutkan dengan
pelarut yang sesuai.
Jangan semprot dengan bahan kimia,
sebagai penampak bercak (gunakan UV atau
uap Iod)
 KLT untuk Kuantitatif

Totolkan senyawa pembanding yang

diketahui kadarnya
Gunakan pipet kapiler terukur volumenya /
microsiringe
Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel
dan bandingkan dengan senyawa pembanding
Untuk menghitung intensitas anda bisa
gunakan KLT scanner atau dikerok dan
gunakan spektrofotometer
peralatan untuk penjenuhan plat KLT
Berdasarkan jenis fase, pengembangan dibagi:
Fase normal: jika fase diam lebih polar dari fase
gerak
Fase terbalik: jika fase gerak lebih polar dari fase
diam

Contoh fase normal: KLT dengan fase diam

Silika dan fase gerak petroleum eter

Contoh fase terbalik: KLT dengan fase diam

C18 dengan fase gerak metanol