Metode Pemisahan

Pengantar Kromatografi
Ridho Asra, M. Farm, Apt
Email: ridhoasra@gmail.com
Pharmaceutical pharmacy analysis

Rujukan:
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2009, Suplemen I Farmakope
Indonesia Edisi IV, Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia

5/5/20 Ridho Asra 1

Definisi Kromatografi
Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan
zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis
dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah
satu di antaranya bergerak secara berkesinambungan
dalam arah tertentu dan di dalamnya zat tersebut
menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya
perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan
uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion.
Dengan demikian masing-masing zat yang terpisah
dapat diidentifikasi atau ditetapkan kadarnya dengan
prosedur analitik.
5/5/20 Ridho Asra 2
Istilah penting
Polaritas
Partisi
Adsorpsi
Pertukaran ion
Ekslusi ukuran
Polaritas
Penting untuk kromatografi
Molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul lain yang mempunyai
polaritas sama
Tingkat pemisahan dari molekul-molekul tersebut menentukan
polaritas dan daya tariknya
Polaritas digunakan sebagai petunjuk sifat:
Pelarut/solvent
Adsorben
Zat yang dipisahkan/solut
PRINSIP LIKE DISSOLVES LIKE
Pelarut polar cenderung melarutkan solut polar
Adsorben polar cenderung mengadsorpsi solut polar
POLARITAS RELATIF BERBAGAI JENIS PELARUT

KONSTANTA DIELEKTRIK JENIS PELARUT

1,89 Petroleum ringan (petroleum eter,
heksana, heptana)
2,023 Sikloheksana
2,238 Karbon tetraklorida, trikloroetilen, toluena
2,284 Benzena, diklorometana
4,34 Etil eter
4,806 Kloroform
6,02 Etil asetat
20,70 Aseton, n-propanol
24,30 Etanol
33,62 Metanol
80,37 Air
Polaritas pelarut sebanding dengan konstanta
dielektrik zat pelarut
Partisi dan adsorpsi
Pemisahan dengan proses partisi dan adsorpsi
dipengaruhi oleh perbedaan polaritas solut yang
dipisahkan
Polaritas merupakan faktor yang menentukan daya
larut (kemampuan partisi) dan adsorpsi solut
Adsorpsi
Penyerapan pd permukaannya saja.
Adsorpsi pd permukaan melibatkan interaksi2
elektrostatik (ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol,
penarikan yg diinduksi oleh dipol)
Solut akan bersaing dengan fase gerak untuk
berikatan dengan sisi2 polar pd permukaan adsorben
Silika gel : adsorben (fs diam)
Permukaan silika gel tdd gugus Si-O-Si dan gugus
silanol (Si-OH)
Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar
karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan
hidrogen dengan solut2 yg agak polar-polar
Adanya air yg diserap oleh permukaan silika gel
mampu mendeaktifkan permukaan silika gel, karena
air akan menutupi sisi aktif silika gel.
Hal ini dapat diatasi dengan memanaskan pad asuhu
1050C, meskipun demikian reprodusibilitasnya sulit
dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar2
dijaga secara hati2
Adsorben yg sering digunakan
Alumina Paling polar

Karbon aktif (Charcoal)

Silika gel

Magnesium silikat

Selulosa

Resin2 polimerik (stiren/difenil benzen) Paling non polar

Semakin polar solut maka semakin tertahan kuar ke
dalam adsorben silika gel ini
Solut non polar (seperti hidrokarbon2 jenuh) tdk
mempunyai afinitas thdp adsorben polar, sementara
solu2 terpolarisasi (hidrokarbon tidak jenuh) mempunyai
afinitas kecil thdp adsorben polar disebabkan adanya
interaksi dipol/ interaksi yg diinduksi oleh dipol.
Solut polar akan terikat kuat pd adsorben karenanya
butuh fs gerak yg cukup polar utk mengelusinya
Urutan polaritas solut2 organik : alkana < alkena <
aromatis < eter < ester < keton dan aldehid < tiol < amin
dan amida < alkohol < fenol < asam2 organik
Adsorpsi solut oleh fs diam/ oleh adsorben sangat
tergantung pada :
Struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yg
berinteraksi dg adsorben
Ukuran partikel adsorben
 ukuran partikel adsorben <<<, luas permukaan >>> 
interaksi dengan solut juga semakin luas
Kelarutan solut dlm fs gerak
 Solut yang makin mudah larut dalam fs gerak akan semakin
mudah lepas dari fs diam
Contoh kekuatan adsorbsi : antara benzen dan
asetofenon
Benzen : tidak mampu membentuk ikatan hidrogen
dengan silanol
Asetofenon mampu berikatan hidrogen dengan
silanol, sehingga benzen akan terelusi lebih dahulu
baru kemudian asetofenon
Kedudukan gugus fungsional tertentu dlm suatu
senyawa juga menentukan interaksinya
Cont : pemisahan antara o-dihidroksi benzen, m-
dihidroksi benzen, dan p-dihidroksi benzen
Urutan kemampuan ikatan hidrogen : posisi o- >
posisi m- > posisi p-
Adsorpsi ini umunya terjadi pada kromatografi padat
cair sebagaimana dalam KLT dan KGP
Kromatografi yg bdsr adsorbsi bermanfaat untuk
memisahkan isomer2 posisi seperti senyawa aromatis
disubtitusi 1,2-, 1,3-, dan 1,4- dengan substituen berupa
gugus2 polar, sementara senyawa homolog dengan
polaritas yg hampir sama tidak dpat dipisahkan dg
kromatografi ini
K. kiral, salah satu jenis KCKT, tergantung pd perbedaan
interaksi adsorpsi dua atau lebih senyawa enansiomer
dengan fs diam kiral
Kromatografi gas padat merupakan k. gas yg
mendasarkan pd mekanisme adsorpsi ini
Peka terhadap bentuk stereometri dari solut yang
dipisahkan
Banyaknya solut yang dapat diadsorpsi pada
permukaan adsorben tergantung dari konfigurasi
solut
Kemampuan untuk diadsorpsi menentukan
kemudahan solut untuk dipisahkan dengan
kromatografi adsorpsi
Cocok untuk memisahkan campuran solut yang
serupa tetapi mempunyai perbedaan bentuk
sterometrik
Partisi
Proses sorpsi (pemindahan solut dr fs gerak ke fs
diam) yg analog dg ekstraksi pelarut
Fs diam cair diikatkan pd padatan lapis tipis yg inert
Solut akan terdistribusi di antara fase gerak dan fs
diam sesuai dengan kelarutan relatif diantara
keduanya
Cont : kromatografi gas-cair
Proses partisi tergantung dari daya larut solut dalam
dua macam cairan
Peka terhadap perbedaan BM solut
Zat yang terdiri dari satu seri deret homolog paling
baik dipisahkan dengan kromatografi partisi
Misal: pemisahan berbagai jenis asam amino, asam
lemak, gula
Jenis Kromatografi
Berdasarkan mekanisme pemisahan :
Kromatografi adsorpsi
Kromatografi partisi
Kromatografi pasangan ion
Kromatografi penukar ion
Kroatografi ekslusi ukuran
Kromatografi afinitas
Berdasarkan alat yg digunakan
Kromatografi kolom (KK)
Kromatografi kertas (KKt)
Kromatografi lapis tipis (KLT), termasuk kromatografi
lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
Kromatografi gas (KG)
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Kolom (KK)

Kromatografi Kertas (KKt) Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

5/5/20 Ridho Asra 22
 Kromatografi Gas

5/5/20 Ridho Asra 23

Teknik kromatografi
Teknik Fase diam Fase gerak Bentuk Mekanisme
sorpsi yang
utama
K. Kertas Kertas Cair Planar Partisi
(selulosa) (adsorpsi,eksl
usi,
pertukaran
ion)
KLT Silika,selulosa, Cair Planar Partisi
resin penukar (adsorpsi,eksl
ion usi,
pertukaran
ion)
KGC Cair Gas Kolom Partisi
KGP Padat Gas Kolom adsorpsi
Teknik Fase diam Fase gerak Bentuk Mekanisme
sorpsi yang
utama
KCKT Padatan Cair Kolom Partisi yg
dimodifikasi
KC (K. Padatan dg Cair Kolom Ekslusi
eksklusi porositas yg
ukuran) dikendalikan
KC (K. Resin penukar Cair Kolom Pertukaran ion
penukar ion) ion
KC (K. kiral) Pemilih kiral Cair Kolom adsorpsi
padat secara selektif
Pemilihan jenis kromatografi
Kemudahan pelaksanaan
Tujuan pemisahan : preparatif/ analitik
Bentuk senyawa yang dipisahkan :
Volatilitas
Bentuk stereometri
Derivatisasi
Dll
Manfaat kromatografi
KKt dan KLT : identifikasi, karena mudah dan
sederhana
KK : memberikan pilihan fase diam yg lebih luas dan
berguna untuk pemisahan masing2 senyawa secara
kuantitatif dr suatu campuran
KLTKT, KG, KCKT : membutuhkan peralatan yang
lebih rumit dan umumnya memberikan hasil dengan
resolusi tinggi dan dapat mengidentifikasi serta
menetapkan secara kuantitatif bahan dalam jumlah yg
sangat kecil
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Merupakan kromatografi partisi, adsorpsi
Fase diam : adsorben
Fase gerak : pelarut
Biasanya untuk analisis kualitatif
PLAT TLC
PENGEMBANGAN
VISUALISASI
kuantifikasi
Dengan mengukur kepekatan warna spot
Alat yang digunakan TLC Scanner / Densitometry
KROMATOGRAFI GAS
Prinsip pemisahan: partisi
Fase diam : cairan yang dilapiskan pada zat penyangga
padatan
Fase gerak : gas seperti He, N2, H2
Contoh Kromatogram
IDENTIFIKASI
Dengan membandingkan dengan senyawa standar
Kondisi kromatografi harus sama dengan sampel
Diidentifikasi berdasarkan waktu retensi
KUANTIFIKASI
Integrator: persentase luas area puncak sampel
terhadap seluruh luas area puncak-puncak yang ada
pada kromatogram
KROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI (HPLC)
Kromatografi partisi
Fase diam : padat
Fase gerak : pelarut/cairan
SUSUNAN ALAT
KOLOM HPLC
KROMATOGRAM HPLC
IDENTIFIKASI dan KUANTIFIKASI
Identifikasi dengan membandingkan waktu retensi
sampel dengan standar
Kondisi HPLC sampel harus sama dengan standar
Kuantifikasi: seperti GC
Mekanisme Kerja Kromatografi
Teknik kromatografi umumnya membutuhkan zat terlarut
terdistribusi di antara dua fase, satu di antaranya diam (fase
diam), yang lainnya bergerak (fase gerak).
Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah
dari zat terlarut lainnya, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir.
Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh
aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut
eluen.
Fase diam dapat bertindak sebagai zat penjerap, seperti halnya
penjerap alumina dan silika yang diaktifkan, dan resin penukar
ion, atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga
terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak.
5/5/20 Ridho Asra 44
Mekanisme Kerja Kromatografi …
Dalam proses yang terakhir ini (partisi) suatu lapisan cairan
disalutkan pada suatu penyangga yang inert, atau secara kimia
terikat pada silika gel, atau terikat langsung pada dinding
kapiler leburan silika berfungsi sebagai fase diam.
Partisi merupakan mekanisme pemisahan yang utama dalam
kromatografi gas-cair, kromatografi kertas, kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis yang disebut pemisahan cair-cair.
Dalam praktek, seringkali pemisahan disebabkan oleh suatu
kombinasi efek adsorpsi dan partisi.
Prinsip pemisahan lain mencakup penukar ion, pembentukan
pasangan ion, eksklusi ukuran, interaksi hidrofobik dan
pengenal kiral.
5/5/20 Ridho Asra 45
Jenis-jenis Kromatografi
Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat dalam
analisis kualitatif dan kuantitatif yang digunakan
dalam prosedur pengujian Farmakope Indonesia
adalah:
Kromatografi kolom (KK)
Kromatografi gas (KG)
Kromatografi kertas (KKt)
Kromatografi lapis tipis (KLT), termasuk kromatografi
lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

5/5/20 Ridho Asra 46

 Pembagian kromatografi berdasarkan fase gerak, mekanisme pemisahan,
teknik pemisahan dan geometri tempat pemisahan
Dasar Kelompok Contoh
Pemisahan Kromatografi
1.   Fase Gerak (Fase Kromatografi Gas (GSC, GLC) GLC, GSC
Gerak dan Fase Kromatografi Cair (LLC,LSC) CC, PC, TLC, HPLC
Diam)
2.Mekanisme Kromatografi Adsorpsi (GSC, LSC) CC, GSC, TLC
Pemisahan Kromatografi Partisi (LLC) GLC, PC, TLC, HPLC
Kromatografi Pasangan Ion IPC
Kromatografi Pertukaran Ion IEC
Kromatografi Eksklusi GPC
3.  Teknik Pemisahan Kromatografi Menurun, Menaik, Melingkar PC
Kromatografi Dua Dimensi TLC
Kromatografi Isokratik HPLC
Kromatografi Gradien HPLC
Kromatografi Fase Normal HPLC
Kromatografi Fase Balik HPLC
Kromatografi Fase Terikat HPLC

4. Geometri Tempat Kromatografi Kolom CC, GC, HPLC

Pemisahan Kromatografi Bidang Datar PC, TLC, HPTLC
(Planar Chromatography)

5/5/20 Ridho Asra 47

Manfaat Kromatografi
KKt dan KLT umumnya lebih bermanfaat untuk
tujuan identifikasi, karena mudah dan sederhana.
KK memberikan pilihan fase diam yang lebih luas dan
berguna untuk pemisahan masing-masing senyawa
secara kuantitatif dari suatu campuran.
KLTKT, KG dan KCKT membutuhkan peralatan yang
lebih rumit dan umumnya memberikan hasil dengan
resolusi tinggi dan dapat mengidentifikasi serta
menetapkan secara kuantitatif bahan dalam jumlah
yang sangat kecil.

5/5/20 Ridho Asra 48

Penggunaan baku pembanding dalam uji
identifikasi
Dalam KKt dan KLT, rasio jarak rambat (diukur sampai titik
yang memberikan intensitas maksimum pada bercak) suatu
senyawa tertentu yang merambat pada media terhadap jarak
rambat fasa gerak (diukur dari titik penotolan) dinyatakan
sebagai harga RF senyawa tersebut.
Rasio jarak rambat suatu senyawa tertentu dengan jarak
rambat baku pembanding dinyatakan sebagai harga RR.
Harga RF berubah sesuai dengan kondisi percobaan, karena
itu identifikasi sebaiknya dilakukan dengan menggunakan
baku pembanding autentik pada kromatogram yang sama.

5/5/20 Ridho Asra 49

5/5/20 Ridho Asra 50
Penggunaan baku pembanding dalam uji
identifikasi …
Untuk maksud ini kromatogram dibuat dengan menotolkan
larutan uji, larutan baku pembanding dan suatu campuran zat
uji dan baku pembanding dalam jumlah yang lebih kurang
sama pada penjerap lapis tipis atau kertas, dalam suatu garis
lurus sejajar dengan tepi lempeng kromatografi atau kertas.
Tiap penotolan sampel mengandung zat uji yang bobotnya
lebih kurang sama.
Jika zat uji yang diidentifikasi dan baku pembanding itu sama,
terdapat kesesuaian dalam warna dan harga RF pada semua
kromatogram, dan kromatogram dari campuran
menghasilkan bercak tunggal, yaitu harga RR adalah 1,0.

5/5/20 Ridho Asra 51

Penggunaan baku pembanding dalam uji
identifikasi …
Larutan campuran ditotolkan sebagai bercak pada bagian bawah
plat KLT dan dibiarkan berpindah dengan pelarut ke atas plat.

Campuran Sampel+
Pembanding pembandin pembanding
g

• • • • • •

A B C A+B+C A+B+C SS
5/5/20 Ridho Asra 52
Penetapan Letak Komponen
Letak bercak pada KKt dan KLT dapat ditetapkan dengan:
Pengamatan langsung jika senyawa terlihat pada cahaya biasa,
cahaya ultraviolet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang
panjang (366 nm)
Pengamatan dengan cahaya biasa atau cahaya ultraviolet setelah
disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut
tampak (pereaksi sebaiknya disemprotkan melalui alat pengabut)
Menggunakan pencacah Geiger-Muller atau teknik
autoradiografi, jika terdapat zat radioaktif
Menempatkan potongan penjerap dan zat pada media pembiakan
yang telah ditanami untuk melihat hasil stimulasi atau hambatan
pertumbuhan bakteri.

5/5/20 Ridho Asra 53

Penetapan Letak Komponen …
Pada KK, KCKT dan KG, waktu retensi, t, didefinisikan sebagai
waktu antara saat penyuntikan sampel dan puncak sampel yang
terelusi, dapat digunakan sebagai parameter identifikasi.
Larutan uji atau turunannya, larutan baku pembanding serta
larutan campuran kedua zat tersebut sama banyak dapat
dikromatografikan berturut-turut menggunakan kolom dan
kondisi kromatografi yang sama.
Pada pengamatan campuran hanya boleh tampak satu puncak.
Rasio waktu retensi zat uji, baku pembanding dan campuran
keduanya terhadap waktu retensi baku internal disebut waktu
retensi relatif, RR dan sering digunakan sebagai parameter
identifikasi.
5/5/20 Ridho Asra 54
Penetapan Letak Komponen …
Penyimpangan harga RR, RF atau t yang diukur untuk
zat uji dari harga yang diperoleh untuk baku
pembanding dan campuran tidak boleh melampaui
estimasi kehandalan yang ditentukan secara statistik
dari penetapan berulang kadar baku pembanding.

5/5/20 Ridho Asra 55

Penetapan Letak Komponen …
Identifikasi dengan metode kromatografi ini pada kondisi tertentu,
memberikan petunjuk identitas yang jelas, namun bukan
merupakan suatu cara identifikasi yang pasti.
Kesamaan parameter identitas pada 3 hingga 6 perangkat kondisi
kromatografi yang berbeda (suhu, isi kolom, zat penjerap, eluen,
fase gerak, berbagai turunan kimia dan sebagainya) memperbesar
kemungkinan bahwa zat uji dan baku pembanding identik.
Sekalipun demikian banyak senyawa isomer yang tidak dapat
dipisahkan. Identifikasi secara kimia, spektroskopi atau fisikokimia
dari senyawa yang terelusi, digabung dengan identitas kromatografi
merupakan kriteria identifikasi yang paling absah. Untuk maksud
ini, masing-masing komponen yang dipisahkan secara kromatografi
dapat dikumpulkan untuk identifikasi lebih lanjut.

5/5/20 Ridho Asra 56