Kromatografi Lapis Tipis

Oleh: Vriezka Mierza, S.Farm., M.Si., Apt.

Pokok Bahasan
• Pengertian KLT
• Fase diam KLT
• Macam-macam fase diam
• Pembuatan fase diam
• Fase gerak KLT
• Macam-macam fase gerak
• Hubungan fase diam n fase gerak
• Penotolan sampel
• Proses pengembangan
• Deteksi bercak (visualisasi)
• Jenis-jenis deteksi bercak (visualisasi)
• Analisis KLT
• Penggunaan KLT secara kualitatif
• Penggunaan KLT secara kuantitatif
• Teknik melakukan KLT
• Manfaat KLT
 Setelah mengikuti kuliah, mahasiswa program s1-
Farmasi , akan dapat menganalisis dan
mengisolasi senyawa kimia bahan alam dengan
teknik kromatografi lapis tipis (KLT).
 Menjelaskan kromatografi lapis tipis.
 Menjelaskan fase diam kromatografi lapis tipis.
 Menyebutkan fase diam kromatografi lapis tipis.
 Melakukan pembuatan fase diam kromatografi lapis tipis.
 Menjelaskan fase gerak kromatografi lapis tipis
 Menyebutkan fase gerak kromatografi lapis tipis.
 Menjelaskan hubungan fase diam dan fase gerak.
 Menjelaskan parameter penotolan sampel.
 Melakukan penotolan sampel.
 Menjelaskan proses pengembangan.
 Menjelaskan deteksi bercak (visualisasi) kromatografi lapis
tipis.
 Menyebutkan deteksi bercak (visualisasi) kromatografi lapis
tipis.
 Menjelaskan penggunaan kromatografi lapis tipis.
 Mengidentifikasi senyawa obat menggunakan kromatografi
lapis tipis.
Pengertian Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
 KLT (Izmailoff dan Schraiber-1938)
Merupakan bentuk kromatografi planar yang mempunyai fase diam berupa lapisan
yang uniform pada permukaan bidang datar yg didukung oleh lempeng kaca,
alumunium atau plastik dan fase gerak berupa cairan (pengembang/pelarut) yang
bergerak disepanjang fase diam karena pengaruh gaya kapiler.

• Kromatografi dikembangkan pertama sekali oleh seorang

botani Rusia Michael Tsweet (1903) untuk memisahkan pigmen
berwarna dalam tanaman dgn. Cara perkolasi ekstrak
petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi CaCO3.
SejarahPerkembangan Kromatografi (Sumber: Adamovics, 1997)

Tahun Ilmuwan Sumbangan

1903 Tswett, M. Memisahkan pigmen dari hijau daun menggunakan CaCO3
dan menamakan proses ini “kromatografi”
1938 Izmailov, N.A. dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Shraiber, M.S.
1940 Tsielius, A. Mengembangkan analisis penjerapan (adsorpsi) dan
elektroforesis.
1941 Martin,A.J.P. dan Synge, Mempresentasikan suatu model yang dapat mengembangkan
R.L.M. efisiensi kolom, mengembangkan kromatografi cair-cair.
1944 Consden, R., Gordon, Kromaatografi Kertas (KKt)
A.H. dan Martin, A.J.P.
1951 Cremer, E. Kromatografi gas padat
1952 Martin, A.J.P. dan James, Kromatografi gas cair
A.T.
1957 Golay, M. Mengembangkan kolom tubular terbuka
1958 Stahl, E. Mengembangkan lagi KLT
1965 Giddings, J.C. Mengembangkan teori kromatografi
1967 Huber, J.F.K. dan Memperkenalkan kromatografi cair kinerja tinggi
Hulsman, J.A.R.J. (KCKT/HPLC)
Berdasarkan mekanisme pemisahan:
 Kromatografi adsorbsi
 Kromatografi partisi
 Kromatografi pasangan ion
 Kromatografi penukar ion
 Kromatografi eksklusi ukuran
 Kromatografi afinitas
Berdasarkan pada alat yang digunakan:
 Kromatografi kertas
 Kromatografi lapis tipis
 Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT/HPLC)
 Kromatografi gas
Pembagian Kromatografi
Teknik Fase Diam Fase Gerak Bentuk Mekanisme
Sorpsi yang
utama
KKt Kertas (selulosa) Cair Planar Partisi (adsorpsi,
pertukaran ion,
eksklusi)
KLT Silika, Selulosa Cair Planar Partisi (adsorpsi,
pertukaran ion,
eksklusi)
KGC Cair Gas Kolom Partisi
KGP Padat Gas Kolom Adsorpsi

KCKT/HPLC Padatan Cair Kolom Partisi modifikasi

Kromatografi cair Padatan dengan Cair Kolom Eksklusi

– kromatografi porositas yang
eksklusi ukuran dikendalikan
Kromatografi cair Resin penukar Cair Kolom Penukar ion
– kromatografi ion
penukar ion
Kromatografi cair Pemilih kiral Cair Kolom Adsorpsi selektif
– kromatografi
kiral
MEKANISME SORPSI
Sorpsi: proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam,
kebalikannya desorpsi.
 Adsorpsi: penyerapan pada permukaan saja.Melibatkan interaksi2
elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol2 dan penarikan
yang diinduksi oleh dipol. Solut akan bersaing dengan fase gerak
untuk berikatan dengan sisi2 polar pada permukaan adsorben, cth
silika gel (adsorben/fase diam) terdiri dr gugus silanol (Si-OH) dan (Si-
O-Si) bersifat polar.
 Partisi: solut akan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam
sesuai dengan kelarutan relatif diantara keduanya, cth : kromatografi
gas cair.
 Pertukaran ion: proses yang mana solut2 ion dalam fase gerak dapat
bertukar dgn. Ion2 yang bermuatan sama yang terikat secara kimiawi
pada fase diam. Prosesnya sbb.
Pertukaran anion: X- +R+Y- → Y- + R+X-
Pertukaran kation: X++R+Y- → X+Y- + R+
 Eksklusi: sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan
ukuran molekul dari zat padat pengepak (fase diam) dan fase gerak
(cairan).
Keuntungan KLT
 Lebih mudah pelaksanaannya n peralatan serta lebih
murah biayanya dari jenis kromatografi lain.
 Peralatan yang digunakan lebih sederhana.
 Hampir setiap lab. dapat melaksanakan setiap saat secara
cepat.
 Banyak digunakan untuk tujuan analisis.
 Identifikasi pemisahan dapat dilakukan dengan banyak cara,
mis: pereaksi warna dan fluorosensi/radiasi dgn sinar uv.
 Ketepatan penentuan kadar dapat terpenuhi.
Fase Diam KLT
Secara umum
• Penjerap berukuran kecil, d= 10-30 mikrometer.
• Ketebalan: 250 mikrometer
• Semakin kecil ukuran partikel, semakin baik kinerja
KLT.
• Cth.: silika, serbuk selulosa, alumina, kieselguhr, gel
sphadex.
• + pengikat, + fluoresen.
 Lempeng kaca dibersihkan dengan akuades lalu dibilas
dengan alkohol atau aseton, lalu dikeringkan.
 Pembuatan bubur silika: campur bagian zat penjerap
dengan akuades perbandingan (1:2), dikocok kuat2 dlm
labu erlenmeyer selama 30 detik. Massa kental dicetak
menjadi plat dengan cara (salah satu): penuangan,
pencelupan, penyemprotan dan memakai alat khusus
pembua plat.
 Persiapan di atas harus segera selesai dalam waktu 2 menit.
 Plat silika didiamkan sampai mengering (±24 jam).
 Kemudian plat diaktifkan pada suhu 105ºC selama 30 menit.
 Ditunggu sampai plat telah dingin, plat siap dipakai.
Tata Nama Lempeng KLT (Sumber: Adamovics, 1997)
Simbol/Singkatan Arti
G Pengikat gipsum (CaSO4.½H2O)
S Pengikat starch (pati)
O Pengikat organik: polimetaklirat, polikarboksilat, bersifat keras dan
tahan terhadap abrasi
H atau N Todak ada pengikat luar.
HL Lapisan keras yang tahan terhadap abrasi krn mengandung pengeras
organik
P Lapisan untuk preparatif
P + CaSO4 Lapisan preparatif yang mengandung kalsium sulfat
F atau UV Ditambah bahan yang berfluorosensi seperti seng silikat
254 dan 366 Digunakan setelah simbol F atau UV, untuk menunjukkan panjang
gelombang
60 Silika gel (E. Merck) yang mempunyai ukuran pori 60Aº
4,7,9 Bilangan yang dicantumkan setelah nama penjerap dan
menunjukkan pH bubur penjerap
Fase Diam pada KLT (Sumber: Kealey dan Haines, 2002)
Penjerap (Fase Diam) Mekanisme Sorpsi Penggunaan

Silika Gel Adsorpsi Asam Amino, Hidrokarbon,

Vitamin, Alkaloid

Silika yang dimodifikasi Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa nonpolar

dengan hidrokarbon

Serbuk Selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,

karbohidrat

Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam,

pewarna makanan, alkaloid

Kieselguhr (tanah Diatome) Partisi Gula, asam2 lemak

Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida,

halida dan ion2 logam

Gel sphadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks

logam

ᵝ-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansiomer

stereospesifik
 Pemilihan dan optimasi fase gerak
1. Mempunyai kemurnian yg sangat tinggi.
2. Daya elusi : harga Rf 0,2-0,8.
3. Peningkatan harga Rf dengan pelarut sedikit polar, mis dietil
eter kedalam metil benzen.
4. Penambahan asam atau basa untuk analit yang bersifat asam
atau basa.
Sumber pemilihan fase gerak:
1. Pustaka/literatur
2. Cara coba-coba dimulai dengan pemakaian 2 pelarut
Aplikasi Penotolan Sampel
 Syarat:
1. Ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
2. Penotolan sampel secara otomatis lbh dipilih.
3. Penotolan sampel yg tidak tepat: bercak menyebar dan puncak ganda.
4. Sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5µl.
5. Penotolan 2-10µl, penotolan dilakukan bertahap dan dilakukan
pengeringan.
6. Penotolan: pita dan noda.
Tujuan Diameter Bercak Konsentrasi Banyaknya
(mm) Sampel (%) Sampel (µg)
Densitometri 2 mm untuk 0,02 - 0,2 0,1 – 1 (untuk
volume sampel KLT-KT)
0,5µl 1 – 10
(konvensional)
Identifikasi 3 mm untuk 0,1 - 1 1 - 20
volume sampel
1µl
Uji kemurnian 4 mm untuk 5 100
volume sampel
2µl
 Teknik Pengembangan

 Fase gerak dalam bejana harus sudah jenuh.

 Tepi bawah fase gerak 0,5-1 cm, tinggi 0,5-1 cm dr
atas lempeng.
 Bejana harus tertutup rapat.
 Penjenuhan dengan mencelupkan sedikit ujung
kertas saring kedalam bejana.
 Penyemprotan dengan Reagen kromogenik, mis: asam sulfat, FeCl3
 Sinar uv : 254 dan 366 nm.
 Melakukan scanning (densitometri).
Beberapa Reagen Umum dan Spesifik yang Digunakan pada KLT

Metode Deteksi Warna Bercak Solut Penggunaan

Asam fosfomolibdat + Biru gelap Beberapa senyawa organik
pemanasan
Asam sulfat pekat + Hitam kecoklatan Semua senyawa organik
pemanasan
Uap iodium Coklat Beberapa senyawa organik
Ninhidrin Pink ke ungu Asam-asam amino dan
amina
Vanilin/asam sulfat Merah/hijau/pink Alkohol, keton
Anisaldehid Berbagai macam Steroid
 Perlakuan dan nilai Rf yang sama.
 Densitometri
 Pengerokan bercak lalu menetapkan kadar senyawa yg
terdapat dalam bercak.
 Preparatif.
Rf
PENGGUNAAN KLT
 Analisis Kualitatif: uji identifikasi dengan senyawa baku ataupun
reagen kimia (penyemprot/deteksi bercak) melalui parameter harga Rf
dan warna yang diukur pada kondisi KLT yang sama.
 Analisis Kuantitatif
1. Teknik densitometri: bercak diukur langsung pada lempeng
menggunakan ukuran luas.
2. Mengerok bercak, lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat
dalam bercak dengan metode analisis lain, seperti spektrofotometri.
 Analisis preparatif: untuk memisahkan analit dalam jumlah yang
banyak lalu dianalisis lebih lanjut, misalnya dengan
spektrofotometri atau dengan teknik kromatografi yang lain.
 Penggunaan Metode KLT untuk Analisis Obat
(Sumber: Adamovics, 1997)

Obat (sediaan) Fase Diam Fase Gerak Deteksi

Asetaminofen Silika Gel Heksan:aseton Uv
(serbuk) (75:25)
Ampisilin (kapsul, Silika Aseton:toluen:air:a ninhidrin
suspensi oral) sam
(650:100:100:25)
Vitamin C silika Metanol:aseton:air uv
(20:40:3)
morfin Silika (dijenuhkan Dikembangkan Uv 279
dengan natrium dengan cara 2
hidroksida 0,1N) dimensi,
sikloheksan:toluen:
dietilamin
(75:15:10) lalu
kloroform:metanol
(9:1)
 Digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik, terutama
di bidang biokimia, farmasi, klinis, forensik, baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif, dengan membandingkan nilai/harga
Rf, warna yang sama.
 Menentukan banyak komponen campuran.
 Identifikasi senyawa.
 Memantau berjalannya suatu reaksi.
 Menentukan efektifitas kemurnian.
 Menentukan kondisi sesuai untuk kromatografi kolom dan
memantau hasilnya.
 Melakukan screening sampel untuk obat.
Sekian dan Terima Kasih