KROMATOGRAFI

LAPIS TIPIS (KLT)

Imelda Fajriati
Artanti Melly Octaviani

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Merupakan kromatografi cair-padat dengan fasa diam berupa
padatan. Fasa diam yang seragam disalutkan pada plat (lapisan
tipis) padatan pendukung yang terbuat dari loam, gelas atau
plastik.
Contohnya fasa diam padat yaitu alumina (Al2O3) atau silica gel
(SiO2).

Fasa diam
Contoh

Digunakan utk memisahkan

Silica gel

Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak,

lipida, minyak essensial, anion dan kation organik,
sterol, terpenoid

Alumina

Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin, karoten,

asam-asam amino

Kieselguhr

Gula, oligosakarida, asam-asam lemak, trigliserida,

asam-asam amino, steroid

Bubuk selulosa

Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida

Pati

Asam-asam amino

SILIKA GEL: SiOH, SiO2

Sifat polar
Silika jenis gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15%

Silika jenis gel S (mengandung pengikat starch =pati

Silika jenis gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator
fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat aktif, yang
berfluoresensi pada 254 nm
Silika jenis gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat)
biasanya untuk kromatografi vakum

Silika jenis gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung indikator

floresensi)
Silika jenis gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif &
mengandung indikator floresensi)

Alumina Al2O3
Kurang polar dibanding silika gel
Almunina basa, netral, asam
Alumina G, F, H, P

Membuat plat (lapisan tipis)

Afasa diam padat (bubuk) dicampur dgn air hingga menjadi
bubur (slurry). Pembuatan lapisan tipis adsorben di atas plat
dilakukan dgn cara penyemprotan atau pencelupan.
Tebal lapisan 250 m 2mm. Plat yg sudah dilapisi kemudian
dipanaskan dgn suhu 100C.

Foto mikroskop elektron lapisan

silica pada lembaran (plat)
aluminium

Mekanisme KLT (fase diam Silika /Alumina):

1.

Interaksi solut dengan fase diam/ adsorben/penjerap/

2.

Kompetisi fase gerak & solut untuk berikatan dengan

fase diam, dimana solut lepas dari permukaan fase diam
=> desorbsi

3.

Senyawa dielusi oleh eluen/pengembang/fase gerak

Fasa gerak (eluent)

Interaksi antara fasa diam dengan fasa gerak sangat menentukan
terjadinya pemisahan komponen. Fasa gerak dapat digolongkan
menurut ukuran kekuatan interaksinya pelarut /campuran
pelarut pada fasa diam (alumina atau silica gel). Penggolongan
ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.
Deret eluotropik pelarut :
Air > metanol > etanol > aseton > piridin > etil asetat > dietil eter >
kloroform > benzena > karbon tetraklorida > sikloheksana >
heptana > n-heksana

Cara kerja:
Larutan sampel ditotolkan pada plat menggunakan pipet mikro dan
dibiarkan mengering.
Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi sampel ke dalam pelarut.
Fasa gerak (pelarut) akan merambat ke atas (mengembang) dengan
daya kapiler , dan komponen sampel akan bergerak naik dengan
kecepatan yang berbeda.

Komponen yg memiliki interaksi lebih besar terhadap fase diam

akan tertahan lebih lama.
Komponen yg memiliki interaksi lebih besar terhadap fase gerak
akan bergerak lebih cepat.

Pada permukaan silica gel, atom silikon (Si) membentuk ikatan

hidrogen dgn senyawa yang sesuai di sekelilingnya. Senyawa yg
dpt membentuk ikatan hidrogen akan melekat/teradsorb pada
silica gel lebih kuat dibanding senyawa lainnya.
Semakin kuat senyawa diadsorb, semakin kurang jarak yang
ditempuh pada plat.

Analisis sampel
Jika tidak terlihat noda pada plat, deteksi noda dapat dilakukan
dengan:
a. Penyinaran dengan lampu UV
Jika plat terdiri atas komponen
yang dapat berfluoresensi (silica
gel mengandung fosfor), noda
dideteksi dgn penyinaran sinar
UV. Noda yg terbentuk ditandai
dgn pensil.

b. Reagen pembentuk warna

Sampel dari golongan asam amino mampu membentuk
senyawa berwarna, sehingga menghasilkan noda/s[pt yg
kontras pada plat bila ditambahkan pereaksi tertentu.
Antara lain:
Pereaksi Ninhidrin:
- Asam amino dan amina dideteksi dgn menyemprotkan
larutan ninhidrin pada kertas terbentuk warna
biru/ungu/coklat.
Kristal Iodin:
- plat diletakkan dalam chamber tertutup yang telah diberi
kristal iod. Uap iod dalam chamber akan bereaksi dengan
spot memberi warna coklat.

The TLC Reagent Spray

Efek Penjenuhan plat pada pengembangan plat

Pemisahan KLT 2 dimensi

KLT untuk Identifikasi

Umumnya parameter yang digunakan Rf

Totolkan, Jika ada senyawa pembanding

Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase gerak
Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda
Jika mungkin gunakan penampak bercak yang
khas

Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka sebagai pembanding

Anda dapat menggunakan KLT Scanner untuk melihat identitas analit
Jika perlu, anda dapat kerok dan dilakukan iden secara fisikokimia

KLT untuk Preparatif

Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang lebih tebal

Totolkan, jika ada senyawa pembanding

Anda dapat menotolkan sampel secara bergaris

Setelah pengembangan, masing-masing hasil pemisahan dikerok
dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai.

Jangan semprot dengan bahan kimia, sebagai penampak bercak

(gunakan UV atau uap Iod)

KLT untuk Kuantitatif

Totolkan senyawa pembanding yang diketahui kadarnya

Gunakan pipet kapiler terukur volumenya / microsiringe

Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel dan bandingkan

dengan senyawa pembanding
Untuk menghitung intensitas anda bisa gunakan KLT scanner
atau dikerok dan gunakan spektrofotometer

KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION

KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian

senyawa spesifik di dalam larutan campuran. Prinsip metode ini
didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara larutan
yang analit dengan matriks yang barada di dalam kolom
kromatografi. Dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu:

Kromatografi pertukaran kation, bila larutan analit yang akan

dipertukarkan dengan ion matriks dalam kolom bermuatan positif .
Matriks dalam kolom disebut sebagai fasa diam, biasanya berupa
dekstran yang mengandung gugus karboksil (-CH2-CH2-CH2SO3- dan
-O-CH2COO-).

Kromatografi pertukaran anion, bila bila larutan analit yang akan

dipertukarkan dengan ion matriks dalam kolom bermuatan. Matriks
dalam kolom disebut sebagai fasa diam, biasanya berupa dekstran
yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+(CH3)3

Fasa diam = ion exchanger; resin, zeolit

Fasa gerak = larutan yang dialirkan melalui kolom untuk
mengambil ion yang terikat pada fasa diam.

Mekanisme kromatografi pertukaran ion melibatkan

penggantian satu spesies ionik Y pada gugus bermuatan dari
fasa diam R.

Mekanisme pertukaran ion :

Pertukaran anion
X- + R+Y
Pertukaran kation
X+ + R-Y+

Dengan:
X = Analit/ ion cuplikan/ sampel
Y = ion fasa gerak
R = bagian ionik pada resin

Y- + R+XY+ + R-X+

Resin
Resin senyawa polimer organik berupa padatan berpori dgn
luas permukaan per satuan berat yg cukup besar.
Pada permukaan pori terdapat gugus-gugus aktif yg dapat
mengikat kation atau anion lain.
Resin memiliki ikatan yg kuat dan tidak mudah larut dalam
suasana asam atau basa.

Resin Penukar Kation

Resin Penukar Anion

Contoh gugus fungsi pada permukaan fasa diam (resin)

Larutan yang melalui kolom disebut influent, sedangkan larutan yang keluar kolom disebut
effluent.
Proses pertukarannya adalah serapan dan proses pengeluaran ion adalah desorpsi atau elusi.
Mengembalikan resin yang sudah terpakai kebentuk semula disebut regenerasi, sedangkan
proses pengeluaran ion dari kolom dengan reagent yang sesuai disebut elusi dan
pereaksinya disebut eluent. (Khopkar, 1990).

Contoh : pemisahan dan recovery ion Ag (perak) dari

limbah fotografi

Resin Amberlite IR-120

Dikeringkan dalam oven dengan suhu 105C
Ditimbang 10 gram resin

Direndam dalam HNO3 4M

Resin dimasukkan ke kolom yg bagian bawahnya ditutup kapas
Kmdn dielusikan dgn 25 mL HNO3 4M

100 mL lar sampel limbah larutan pencuci film

Dielusikan ke kolom penukar kation

Ag dalam resin dielusikan keluar kolom dgn 100

mL HNO3 4M
Eluat ditampung dalam erlenmeyer
Penentuan konsentrasi Ag dalam eluat

Kapasitas Pertukaran Ion (Kapasitas Kolom)

Yang disebut dengan kapasitas pertukaran total adalah jumlah gugusan-gugusan yang
dapat dipertukarkan di dalam kolom, dinyatakan dalam miliekivalen.
Kapasitas kolom adalah bilangan yang menyatakan jumlah banyaknya ion
di dalam kolom yang dapat dipertukarkan untuk setiap 1 (satu) gram
resin (ekivalen).

Kapasitas kolom berkaitan dengan kemampuan penukar ion

dalam kolom kromatografi dalam menukarkan kation atau
anion.
Kapasitas kolom yang kecil, artinya diperlukan resin dengan
jumlah yang lebih banyak untuk dapat mengadakan
pertukaran ion sampel atau eluen.
Kapasitas kolom yang besar, artinya diperlukan resin dengan
jumlah yang lebih sedikit untuk dapat mengadakan
pertukaran ion sampel atau eluen.

Penentuan secara umum:

1. Fasa diam ditambahkan NaCl jenuh, kemudian diaduk.
2. Pisahkan residu dan filtrat.
3. Filtrat dititrasi dgn NaOH + indikator pp.
4. Titrasi dihentikan ketika titrat berubah warna.

KPI =

v.N
W

v = volume titran yang digunakan dalam titrasi

N = Normalitas NaOH
W = bobot resin (gram)