KLT Densitometri:

Scanning Densitometri & Video Densitometri

Dr. Aiyi Asnawi & Dr. Fauzan Zein M., M.Si.,Apt.
.pengantar
KLT densitometri merupakan bentuk yang modern dari KLT biasa. Kedua KLT
ini memiliki prisip teori yang sama.
Kegunaan:
1. Biomedis: asam organik, lemak, steroida, karbohidrat, asam amino
2. Farmasi: stabilitas dan pengotor dari obat sintetis, antibiotik, pemantauan obat, alkaloid
3. Makanan: mikotoksin dan santoksin, residu obat, antioksidan, pengawet, pewarna makanan,
pigment alami, bumbu, savonoida
4. Forensik: penyalahgunaan obat, racun, alkaloid, tinta
5. Klinis: pemantauan obat terapi, identifikasi metabolik obat
6. Lingkungan: residu pestisida
7. Industri: keseragaman produk, profil pengotor, surfaktan, pewarna sintetik.
Keunggulan:
1. Visualisasi berupa kromatogram;
2. Sederhana;
3. Dapat digunakan untuk berbagai sampel;
4. Biaya operasional dan perawatan yang murah;
5. Dll.
Kromatografi lapis tipis
Pemisahan KLT terjadi karena fenomena adsorpsi atau partisi
atau gabungannya bergantung pada sifat adsorben plat dan sistem
pelarut pengembang yang digunakan.

Jenis kromatografi lapis tipis untuk KLT densitometri dapat dibagi

dua yaitu kromatografi lapis tipis (KLT) datar dan kromatografi
lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT).

KLT dilakukan menggunakan lembaran tipis dari kaca, aluminium

atau plastik yang dilapisi dengan lapisan fase diam, biasanya silika
gel. Namun, pelapis lainnya seperti alumina, florisil, poliamida,
selulosa, C-18, C-8, penukar ion,
dan lapisan amino terikat secara kimia, siano, diol, atau fenol juga
dapat digunakan.
KLTKT vs KLT
Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

A. Aplikasi sampel
• Aplikasi sampel adalah langkah pertama dalam alur kerja dari kromatografi planar
dan mempengaruhi secara signifikan kualitas hasilnya pada akhir proses. Pilihan
teknik aplikasi dan perangkat tergantung pada persyaratan presisi, volume
sampel, jumlah analisis dan otomatisasi grade yang diinginkan.
• Dua jenis bentuk aplikasi sampel yang sering digunakan yaitu bulat dan pita; baik
manual maupun otomatis.
Camag Linomat
PIPA KAPILER VOLUMETRIK
Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

B. Pengembangan kromatogram: vertikal dan horizontal

Dalam chamber pengembang empat proses parsial bersaing terjadi:
• Antara komponen pelarut pengembang dan uapnya, keseimbangan
akan dibentuk secara bertahap. Proses ini disebut penjenuhan
chamber. Tergantung pada tekanan uap komponen pelarut ,komposisi
fase gas dapat berbeda (1).
• Bagian dari lapisan yang sudah dibasahi dengan fase gerak
berkontribusi untuk pembentukan keseimbangan (2).
• Fase diam yang masih kering mengadsorbsi molekul dari fase gas (3).
• Selama migrasi pelarut, komponen fase gerak dapat dipisahkan oleh
fase diam dalam kondisi tertentu, menyebabkan pembentukan front
sekunder, yang biasanya tidak diinginkan (4).
Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

C. Pengembangan vertikal dan horizontal

Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

D. Derivatisasi pra dan pasca

kromatografi
Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

E. Evaluasi kromatogram → Yang sering digunakan:

• Pemeriksaan kromatogram dibawah sinar UV: Lampu UV
• Dokumentasi, akusisi gambar: Visualizer
• Deteksi bioakti: Bioluminizer
• Densitometri klasik: TLC Scanner 4
• TLC/MS coupling: TLC-MS Interface
Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

F. Prinsip densitometri
Selama evaluasi densitometri dari kromatogram datar, jalur
pemisahannya dipindai dengan cahaya dalam bentuk celah yang dapat
diatur panjang dan lebarnya. Fotosensor dari densitometer
mengukur difusi cahaya yang dipantul. Perbedaan antara sinyal optik
dari sampel-bebas latar belakang dan dari area sampel (fraksi)
dihubungkan dengan jumlah fraksi masing-masing dari kalibrasi baku
kromatogram melalaui absorbansi maupun fluorescensi.
Prinsip dan instrumentasi kromatografi lapis tipis

G. Keunggulan densitometri:
✓Pemindaian multi panjang gelombang
✓Perekaman spektrum secara in situ
▪ untuk menentukan panjang gelombang maksimum untuk pemindaian
kuantitatif;
▪ untuk mengidentifikasi fraksi-fraksi dengan membandingkan dengan spektrum
baku/pustakanya;
▪ untuk mengecek spekrum fraksi dengan Rf nya;
▪ untuk mengecek kemurnian fraksi spektrum pada berbagai posisi bercak.
✓Scanner validation
 KLT Densitometri

Jalur pemindai linier bercak pada plat klt Pemindaian Kromatogram

JENIS PEMINDAIAN OPTIK DAN Sumber cahaya

Jenis pemindaian optik:

• Satu panjang gelombang, satu berkas caharya
• Satu panjang gelombang, berkas cahaya ganda
• Dua panjang gelombang, bercas cahaya tunggal

Sumber cahaya:
• Lampu deuterium (190-400 nm)
• Lampu halogen tungsten (350-800 nm)
• Lampu xenon atau uap merkuri tekanan tinggi (254-578 nm)
Pemindaian multi panjang gelombang
KLT videodensitometri
Video densitometri menggunakan sistem pencitraan yang terdiri
dari:
• Kamera CCD resolusi tinggi dengan zoom untuk fokus dan memperbesar kromatogram,
jika diperlukan dan sistem pencahayaan yang sesuai.
• Kamera ini dihubungkan ke komputer (biasanya PC) dan printer video.
• Perangkat lunak untuk mengatur kamera dan semua parameter seperti kecerahan,
kontras, keseimbangan warna dan intensitas.
• Kromatogram dapat disajikan dalam bentuk gambar pada printer video dan dapat diukur
untuk mengetahui konsentrasi analit seperti pada pemindaian densitometri.
• Untuk analit yang lemah berfluoresen, digunakan aperture kamera yang kecil (F: 22)
dapat digunakan dengan integrasi lama.
PRINSIP KLT videodensitometri
Pemindaian optik berlangsung secara elektronik,
Menggunakan komputer dengan video digitial, sumber cahaya,
monokromator, dan optik yang tepat untuk menerangi plat dan fokus
gambar ke perangkat charge-coupled (CCD) kamera video.
Daya tarik utama video densitometri untuk deteksi dalam kromatografi lapis
tipis adalah akuisisi data cepat dan simultan, desain instrumen sederhana
tanpa bagian yang bergerak, peningkatan sensitivitas, akuisisi lebih lama dan
kompatibilitas dengan analisis data.
Video densitometri tidak dapat menyaingi pemindaian densitometri dalam
hal sensitivitas, resolusi dan ketersediaan pengukuran berbagai panjang
gelombang.
Analisis data
dengan perangkat
lunak video
densitometri
Perangkat lunak videodensitometri
1.Sorrbfil videodensitometer
2.TLC Analyzer
3.ImageJ
4.Just TLC
Perangkat KLT Videodensitometri