MODUL 6

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS OBAT DALAM SAMPEL

BIOLOGIS

6.1 Tujuan
Tujuan dari praktikum kali ini adalah:
1. Memahami berbagai metode pengembangan analitis obat dalam
sampel biologis beserta validasinya.
2. Mampu melakukan berbagai teknik/metoda analisis obat dalam sampel
biologis sesuai dengan tugas yang diberikan.

6.2 Prinsip
Prinsip dari praktikum kali ini adalah:
1. Berdasarkan berbagai metode pengembangan obat dan validasinya
sesuai struktur dan sifat farkmakokimia obat.
2. Berdasarkan metode analisis dengan metode kimia dan metode biologi.

6.3 Teori
Hewan percobaan yang umum digunakan dalam penelitian ilmiah adalah
tikus. Tikus (Rattus norvegicus) telah diketahui sifat-sifatnya secara sempurna,
mudah dipelihara, dan merupakan hewan yang relatif sehat dan cocok untuk
berbagai penelitian. Tikus termasuk hewan mamalia oleh sebab itu dampaknya
terhadap suatu perlakuan mungkin tidak jauh berbeda dibandingkan dengan
mamalia lainnya. Tikus juga merupakan hewan laboratorium yang banyak
digunakan dalam penelitian dan percobaan antara lain untuk mempelajari
pengaruh obat-obatan, toksisitas, metabolisme, embriologi maupun dalam
mempelajari tingkah laku (Malole dan Pramono, 2010). Makalah ini dibuat
dengan tujuan menambah wawasan dan pengetahuan pembaca tentang cara
pengambilan sampel darah pada hewan coba khususnya tikus dan mencit, karena
mencit atupun tikus adalah hewan coba yang sangat di butuhkan darahnya untuk
Animal research.

1
 Tikus merupakan hewan laboratorium yang banyak digunakan dalam
penelitian dan percobaan antara lain untuk mempelajari pengaruh obat-obatan,
toksisitas, metabolisme, embriologi maupun dalam mempelajari tingkah laku
(Calabrese, 2001). Tikus (Rattus norvegicus) berasal dari Asia Tengah dan
penggunaannya telah menyebar luas di seluruh dunia (Gay, 2009). Menurut
taksonomi tikus adalah:
Kingdom : Animalia
Filum : Chordata
Subfilum : Vertebrata
Kelas : Mamalia
Subkelas : Theria
Ordo : Rodensia
Subordo : Sciurognathi
Famili : Muridae
Subfamili : Murinae
Genus : Rattus
Spesies : Rattus norvegicus
Dalam dunia sains mencit dan tikus banyak digunakan sebagai hewan coba
karena struktur anatomi mencit dan tikus hampir sama dengan struktur anatomi
manusia selain itu juga perkembangbiakan mencit yang sangat cepat sehingga
memudahkan praktikan ataupun peneliti dalam mendapatkannya. Mencit ataupun
juga bukan termasuk hewan yang dilindungi dan dalam pemeliharaan dan
perawatannya tergolong mudah. Tikus laboratorium jantan jarang berkelahi
seperti mencit jantan. Tikus dapat tinggal sendirian dalam kandang, asal dapat
melihat dan mendengar tikus lain. Jika dipegang dengan cara yang benar, tikus-
tikus ini tenang dan mudah ditangani di laboratorium. Pemeliharaan dan makanan
tikus lebih mahal daripada mencit tetapi tikus dapat berbiak sebaik mencit. Karena
hewan ini lebih besar daripada mencit, maka untuk beberapa macam percobaan,
tikus lebih menguntungkan (Gay, 2009).
Selain itu juga ada dua sifat utama yang membedakan tikus dengan hewan
percobaan lainnya, yaitu tikus tidak dapat muntah karena struktur anatomi yang
tidak lazim pada tempat bermuara esofagus ke dalam lambung sehingga

2
mempermudah proses pencekokan perlakuan menggunakan sonde lambung, dan
tidak mempunyai kandung empedu (Smith dan Mangkoewidjojo, 2008). Selain
itu, tikus hanya mempunyai kelenjar keringat di telapak kaki. Ekor tikus menjadi
bagian badan yang paling penting untuk mengurangi panas tubuh. Mekanisme
perlindungan lain adalah tikus akan mengeluarkan banyak ludah dan menutupi
bulunya dengan ludah tersebut (Sirois, 2015).
Pengambilan Darah pada Mencit dan Tikus
Cara pengambilan darah pada mencit hampir sama yaitu melalui plexus
reorbitalis pada mata, vena ekor (V. Lateralis ekor), pada vena saphena yang
terdapat pada bagian kaki dan pengambilan langsung dari jantung. Pada umumnya
pengambilan darah yang terlalu banyak pada hewan kecil akan menyebabkan shok
hipovolemik, stress dan bahkan dapat menyebabkan kematian. Tetapi
pengambilan darah yang tidak sesuai aturan juga dapat menyebabkan anemia pada
hewan coba. Pada umumnya pengambilan darah hanya dilakukan sekitar 10% dari
total volume darah dalam tubuh dalam selang waktu 2-4 minggu.Atau sekitar 1%
dari berat tubah dengan interval 24 jam. Total darah yang hanya boleh diambil
sekitar 7,5% dari bobot badan. Cara pengambilan darah pada mencit dan tikus:
1. Plexus Retroorbitalis pada mata
Tikus dipegang dan dijepit bagian tengkuk dengan jari
tangan.setelah itu tikus dikondisikan senyaman mungkin, kemudian
Mikrohematikrit digoreskan pada medial canthus mata dibawah bola mata
ke arah foramen opticus. Kemudian mikrohematokrit diputar sampai
melukai plexus, jika diputar 5X maka harus dikembalikan 5X. Darah
ditampung pada Eppendorf yang telah diberi EDTA untuk tujuan
pengambilan plasma darah dan tanpa EDTA untuk tujuan pengambilan
serumnya,bisa juga dengan penambahan heparin sebagai antikoagulan.
2. Pada Vena Ekor (V. Lateralis ekor)
Tikus dimasukkan dalam selongsong yang sesuai ukurannya tubuh
tikus. Ekor tikus dijulurkan keluar dan vena lateralis pada ekor di Incisi
(dipotong) 0,2 – 2 cm dari pangkal ekor dengan silet atau gunting yang
steril. Darah ditampung pada eppendorf, kemudian diletakkan miring 45º

3
 dan dibiarkan mengendap pada suhu kamar, selanjutnya dilakukan
sentrifugasi untuk mendapatkan serum yang dimaksud.
3. Pengambilan darah melalui vena sapena pada kaki
Mencit dipegang pada posisi setengah tegak,jarum diinjeksikan
pada paha belakang sebelah dalam agar posisi jarum tidak berubah, perlu
bantuan untuk memegang kaki hewan tersebut lalu tampung darah pada
eppendorf.
4. Pengambilan darah langsung ke jantung
Teknik ini umumnya dilakukan jika darah yang dibutuhkan banyak
dan tikus yang diambil darahnya ini akan sekalian dibedah untuk diambil
organnya. Cara memperoleh darah dari jantung tikus lebih sering dipakai
dari pada mencit. Diperlukan anastesi dan cara ini sama pada mencit.
Prinsip ini umumnya dilakukan jika darah yang dibutuhkan banyak dan
tikus yang diambil darahnya ini akan sekalian dibedah untuk diambil
organnya. Caranya dengan menusukkan syringe langsung ke jantung dan
disedot perlahan (Yokozawa, et al, 2012).

6.4 Alat dan Bahan

6.4.1 Alat
Alat yang digunakan berupa tikus putih, uretan, aquadest, dan etanol.
6.4.2 Bahan
Bahan yang digunakan berupa suntikan, sentrifugasi, tabung
sentrifugasi, pipa kapiler, beaker glass, pinset, gunting bedah, pisau bedah,
dan papan bedah.

6.5 Prosedur
6.5.1 Pengambilan darah melalui IV ekor tikus
Tikus putih dimasukkan ke dalam tabung dengan ekor menjuntai
keluar, lalu pangkal ekor tikus dibasahi terlebih dahulu dengan etanol yang
kemudian ditusuk pada bagian intravenanya dan plunger suntikan ditarik
untuk menarik darah. Darah yang di dapat dimasukkan ke dalam tabung

4
sentrifugasi dan disentrifugasi selama ± 30 menit dengan kecepatan 5000
rpm, kemudian bagian beningnya di ambil (plasma).

6.5.2 Pengambilan darah melalui ekor tikus yang digunting

Tikus putih dimasukkan ke dalam tabung dengan ekor menjuntai
keluar, lalu ekor tikus dibersihkan dengan etanol dan dijepit dengan pinset.
Kemudian sekitar 2-3 cm ujung ekor tikus dipotong dengan gunting bedah
dan ekor tikus di urut-urut agar darahnya keluar. Darah yang di dapat
dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan disentrifugasi selama ± 30
menit dengan kecepatan 5000 rpm, kemudian bagian beningnya di ambil
(plasma).

6.5.3 Pengambilan darah melalui mata

Tikus putih dibius dengan cara di suntik larutan uretan dengan dosis
tertentu. Setelah tikus tidak sadar, pada bagian ujung mata tikus ditusuk
dengan pipa kapiler sampai darah dari mata keluar melalui pipa tersebut.
Darah yang keluar di tampung dalam tabung sentrifugasi dan disentrifugasi
selama ± 30 menit dengan kecepatan 5000 rpm, kemudian bagian beningnya
di ambil (plasma).

6.5.4 Pengambilan darah melalui jantung

Tikus putih dimatikan terlebih dahulu dengan cara di suntik larutan
uretan dengan dosis tertentu. Setelah tikus tidak sadar dilakukan dislokasi
pada tengkuk tikus, kemudian dilakukan pembedahan pada bagian toraks.
Setelah rongga toraks terbuka, dilakukan pengambilan darah dari jantung
dengan cara pada bagian jantung ditusuk dengan suntukan yang kemudian
plunger suntikan ditarik untuk menarik darah. Darah yang di dapat
dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan disentrifugasi selama ± 30
menit dengan kecepatan 5000 rpm, kemudian bagian beningnya di ambil
(plasma).

5
6.6 Data Pengamatan
Tabel 6.6.1 Hasil Pengambilan Darah Tikus
Tempat Pengambilan Volume yang Didapat
Tikus Ke-
Darah (ml)
1 IV di Ekor -
1 Ekor (Digunting) -
2 Mata -
3 Jantung 1 ml

Tabel 6.6.2 Plasma yang Didapat dari Hasil Sentrifugasi Darah Tikus dengan
kecepatan 5000 rpm Selama ± 30 Menit
Plasma Warna Plasma Volume yang Didapat (ml)
1 Bening coklat 0,25
2 Merah muda 1
3 Merah tua 0,25
4 Jingga 0,2
5 Kuning bening 0,2
6 Merah cerah 0,75

6.7 Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pengambilan darah pada tikus. Tikus
merupakan hewan laboratorium yang banyak digunakan dalam penelitian dan
percobaan antara lain untuk mempelajari pengaruh obat-obatan, toksisitas,
metabolisme, embriologi maupun dalam mempelajari tingkah laku. Tikus
laboratorium jantan jarang berkelahi seperti mencit jantan. Tikus dapat tinggal
sendirian dalam kandang, asal dapat melihat dan mendengar tikus lain. Jika
dipegang dengan cara yang benar, tikus-tikus ini tenang dan mudah ditangani di
laboratorium. Pemeliharaan dan makanan tikus lebih mahal daripada mencit tetapi
tikus dapat berbiak sebaik mencit. Karena hewan ini lebih besar daripada mencit,
maka untuk beberapa macam percobaan, tikus lebih menguntungkan.
Selain itu ,juga ada dua sifat utama yang membedakan tikus dengan hewan
percobaan lainnya, yaitu tikus tidak dapat muntah karena struktur anatomi yang
tidak lazim pada tempat bermuara esofagus ke dalam lambung sehingga

6
mempermudah proses pencekokan perlakuan menggunakan sonde lambung, dan
tidak mempunyai kandung. Selain itu, tikus hanya mempunyai kelenjar keringat di
telapak kaki. Ekor tikus menjadi bagian badan yang paling penting untuk
mengurangi panas tubuh. Mekanisme perlindungan lain adalah tikus akan
mengeluarkan banyak ludah dan menutupi bulunya dengan ludah tersebut.
Cara pengambilan darah pada tikus yaitu melalui plexus reorbitalis pada
mata, vena ekor (V. Lateralis ekor) dan pengambilan langsung dari jantung. Pada
umumnya pengambilan darah yang terlalu banyak pada hewan kecil akan
menyebabkan shok hipovolemik, stress dan bahkan dapat menyebabkan kematian.
Tetapi pengambilan darah yang tidak sesuai aturan juga dapat menyebabkan
anemia pada hewan coba. Pada umumnya pengambilan darah hanya dilakukan
sekitar 10% dari total volume darah dalam tubuh dalam selang waktu 2-4 minggu.
Atau sekitar 1% dari berat tubah dengan interval 24 jam. Total darah yang hanya
boleh diambil sekitar 7,5% dari bobot badan.
Pada praktikum kali ini, digunakan 3 ekor tikus untuk percobaan
pengambilan darah. Satu ekor tikus untuk pengambilan darah melalui mata, dan
dua tikus lainnya untuk pengambilan darah melalui ekor dan jantung.
Pengambilan darah melalui mata dilakukan dengan menggunakan pipet
darah. Pipet darah dimasukkan ke jaringan dibawah mata. Pengambilan darah
dilakukan diatas tempat yang mudah dibersihkan karena akan banyak darah yang
keluar dan melebihi kapasitas pipet darah. Pengambilan darah melalui mata dapat
dilakukan secara berulang kali selama tikus masih dalam keadaan baik.
Pada pengambilan darah melalui mata, praktikan tidak memperoleh banyak
darah. Sedangkan pada teorinya, darah yang seharusnya dihasilkan cukup banyak,
karena pada mata terdapat banyak pembuluh darah. Hal ini diduga terjadi
kesalahan metode pengambilan darah pada mata, sehingga darah yang dihasilkan
sangat sedikit.
Pada vena ekor (V. Lateralis ekor), tikus dimasukkan dalam selongsong
yang sesuai ukuran tubuh tikus. Ekor tikus dijulurkan keluar dan vena lateralis
pada ekor dipotong 0,2–2 cm dari pangkal ekor dengan gunting yang steril. Darah
ditampung pada eppendorf, kemudian diletakkan miring 45º dan dibiarkan

7
mengendap pada suhu kamar, selanjutnya dilakukan sentrifugasi untuk
mendapatkan serum yang dimaksud.
Pengambilan darah melalui pembuluh darah yang terdapat di ekor memiliki
tingkat kesulitan yang tinggi. Metode ini sulit dilakukan karena pembuluh darah
pada ekor memiliki ukuran yang sangat kecil. Ukuran pembuluh darah ekor ini
masih lebih kecil jika dibandingkan dengan jarum yang digunakan untuk
pengambilan darah sehingga sulit dilakukan. Hal inilah yang menyebabkan
praktikan tidak dapat memperoleh banyak darah, baik dengan cara intravena
maupun dengan cara pemotongan ekor tikus.
Pengambilan darah langsung ke jantung, teknik ini umumnya dilakukan jika
darah yang dibutuhkan banyak dan tikus yang diambil darahnya ini akan sekalian
dibedah untuk diambil organnya. Cara memperoleh darah dari jantung tikus lebih
sering dipakai daripada mencit. Diperlukan anastesi dengan menggunakan uretan
sebanyak 1 mL dengan disuntikan secara intraperitonial. Prinsip ini umumnya
dilakukan jika darah yang dibutuhkan banyak dan tikus yang diambil darahnya ini
akan sekalian dibedah untuk diambil organnya. Caranya dengan menusukkan
syringe langsung ke jantung dan disedot perlahan.
Pada pengambilan darah langsung ke jantung, praktikan memperoleh darah
yang lebih banyak yakni 1 mL dibandingkan melalui mata dan ekor. Hal ini
dikarenakan jantung merupakan alat pemompa darah sekaligus organ sistem
peredaran darah, sehingga darah yang dihasilkan banyak. Untuk 2 ekor tikus
dengan pengambilan darah melalui mata dan ekor hanya didapatkan beberapa
tetes darah, sehingga tidak dapat dilakukan sentrifugasi. Sehingga kedua tikus
tersebut dikorbankan untuk diambil darahnya melalui jantung.
Setelah didapatkan sampel darah, sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan
alat sentrifuge sebesar 5000 rpm selama ±30 menit. Sentrifugasi dilakukan dengan
tujuan memisahkan plasma dan serum pada darah dengan kecepatan tinggi. Hasil
dari sentrifugasi, darah akan terbentuk menjadi tiga bagian, bagian bawah padatan
dan bagian atas cairan. Cairan bagian atas adalah plasma darah, sedangkan bagian
bawah adalah sel-sel darah. Plasma darah ditandai dengan terbentuknya warna
kuning di bagian atas, dibagian bawah yang berwarna merah sebagai sel darah
merah dan bagian tengah berwarna bening adalah sel darah putih dan trombosit.

8
 Hasil yang didapatkan setelah sentrifugasi sampel darah pengambilan di
jantung, praktikan memperoleh jumlah plasma sebanyak 0,45 mL, sel darah
merah sebanyak 2 mL dan sel darah putih serta trombosit sebanyak 0,2 mL.

6.8 Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa pengambilan sampel darah
pada tikus di jantung menghasilkan banyak darah daripada di mata dan ekor.

9
 DAFTAR PUSTAKA

Smith, B. J. dan S. Mangkoewidjojo. 2008. Pemeliharaan, Pembiakan dan

Penggunaan Hewan.

Yokozawa, T., T. Nakagawa dan K. Kitani. 2012. Antioxidative activity of green

tea polyphenol in cholesterol-fed rats. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 50:3549-35.

Gay, L. R. 2009. Research in Education. New York: McGraw Hill Book

Company.

Malole,, M. B. M. dan Pramono, C. S. U. 2010. Pengantar Hewan-Hewan

Percobaan di Laboratorium. Bogor: IPB.

Sirois, M. 2015. Laboratory Animal Medicine. United of State America: Mosby

Inc.

10
 LAMPIRAN

1. Dosis Uretan untuk manusia = 1,8 gram

Jumlah tikus yang dipakai = 1 ekor ~ 1 mL

Dosis Uretan untuk tikus dengan berat 200 gram = 360 mg/1 mL aquadest
Jumlah tikus yang dipakai (1 kelas) = 18 ekor ~ 18 mL
Dosis Uretan untuk 1 kelas = 360 mg x 18 = 6480 mg/18 ml aquadest

2. Bobot Tikus Kelompok 5

Bobot Tikus 1 = 89,44 gram

Bobot Tikus 2 = 61,75 gram
Bobot Tikus 3 = 98,06 gram

3. Perhitungan dosis uretan untuk masing masing tikus

Tikus 1 = x 1 mL = 0,4472 mL (Pengambilan darah di mata)

11
Tikus 2 = x 1 mL = 0,3087 mL (Pengambilan darah di jantung)

Tikus 3 = x 1 mL = 0,4903 mL (Pengambilan darah di ekor dan IV

ekor)

12