KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Sony Eka Nugraha, S.Farm.,M.Si., Apt

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
 KLT
Kromatografi lapis tipis
(KLT) dikembangkan oleh
Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938.
Cara pemisahan dengan
adsorbsi pada lapisan tipis
adsorben
Merupakan kromatografi
adsorpsi dan partisi
Fase stasioner: adsorben
Fase mobil: pelarut
Biasanya untuk analisis
kualitatif
KLT
Lapis Tipis terdiri dari:
 Plat: kaca, Alumunium, plastik
 Adsorben: silika gel, alumina, selulosa, dll

Macam-macam adsorben di pasaran:

 Silika gel G, silika gel GF, silika gel H
 Alumina H, Alumina HF
 Selulosa
 Fase diam
SILIKA GEL: SiOH, SiO2 Alumina Al2O3
 Sifat polar
 Silika gel G (mengandung pengikat gipsum
 Kurang polar dibanding
CaSO4: 5-15% silika gel
 Silika gel S (mengandung pengikat starch =pati  Almunina basa, netral,
 Silika gel GF254 (mengandung pengikat
gipsum & indikator fluoresensi timah kadmium
asam
sulfida/mangan timah silikat aktif, yang
berfluoresensi pada 254 nm
 Alumina G, F, H, P
 Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung
pengikat)biasanya untuk kromatografi vakum
 Silika gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung
indikator floresensi)
 Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan
preparatif & mengandung indikator floresensi)
MEKANISME KLT
1. Adsorbsi senyawa pada
adsorben/penjerap/fase diam
2. Kompetisi fase gerak & solut untuk
berikatan dengan fase diam, dimana solut
lepas dari permukaan fase diam =>
desorbsi
3. Senyawa dielusi oleh
eluen/pengembang/fase gerak
 PENAMPAK BERCAK
 Penampak Bercak kimia, berdasarkan
 Penampak Bercak: sifatnya:
1. Permanen: Asam sulfat pekat,
1. Visual => analit ninhidrin
berwarna 2. Sementara: Uap Iodium

2. Penampak bercak  Penampak Bercak kimia, berdasarkan

spesifisitasnya:
kimia
1. Spesifik:
◦ Misalnya: Uap Iodium,  ninhidrin: untuk zat dengan atom N
Asam sulfat (protein, Alkaloid dll)
pekat, ninhidrin  2. Umum:
3. Lempeng diberi  Uap Iodium, Asam sulfat pekat
(hampir semua zat)
fluoresensi
The TLC Reagent Spray
METODE PENGEMBANGAN PADA KLT
Berdasar arah pengembangan
 Menaik
 Menurun

Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
 Pengembangan 2 dimensi
PENGGUNAAN KLT
Untuk penentuan jumlah komponen dalam
campuran.
2. Untuk penentuan identitas antara dua
 campuran.
3. Untuk memonitor perkembangan reaksi.
4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
5. Untuk penentuan kondisi yang sesuai
untuk pemisahan pada kromatografi kolom.
6. Untuk memonitor kromatografi kolom .
Kromatografi Lapis Tipis merupakan
kromatografi adsorbsi dan adsorben
bertindak sebagai fase stasioner
(fase diam). Fase diam yang
digunakan dalam KLT merupakan
penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm
(Gandjar dan Rohman, 2007)
 NILAI R F
 Pada KLT, identifikasi senyawa dapat dilakukan dengan
menghitung harga Rf
Rf pembanding vs Rf sampel

Harga R F=
Jarak yang ditempuh noda
Jarak yang ditempuh eluen

Harga Rf dipengaruhi oleh :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
2. Sifat penyerap dan derajad aktivitasnya
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
4. Pelarut (dan derajad kemurniannya) fasa bergerak
5. Derajad kejenuhan dalam uap
6. Teknik percobaan
7. Jumlah cuplikan yang digunakan
8. Suhu
9. Kesetimbangan
Pereaksi semprot Komposisi Perlakuan Keterangan

Vanilin asam 1 gram vanilin dalam Disemprot dan Pereaksi umum yang
sulfat asam sulfat pekat dipanaskan hingga digunakan. Terpen
muncul warna akan menghasilkan
warna merah atau biru

Asam Asam fosfomolibdat 5% Disemprot dan Untuk mendeteksi

fosfomolibdat b/v dalam etanol dipanaskan hingga terpen dengan bercak
muncul warna biru berlatar kuning

Reagen 10 mL larutan KI 40% Jika reaksi tidak Deteksi alkaloid

Dragendorff ditambahkan dengan 10 spontan maka menghasilkan warna
mL larutan 0,85 gram diperlukan oranye pekat hingga
bismuth subnitrat dalam pemanasan merah
10 mL asam asetat dan
50 mL air. Larutan
tersebut diencerkan
dalam 10 mL asam
asetat dan 50 mL air
 PRINSIP KERJA

Proses pemisahan dengan

kromatografi lapis tipis, terjadi
hubungan kesetimbangan antara
fase diam dan fasa gerak, dimana
ada interaksi antara permukaan
fase diam dengan gugus fungsi
senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah
berinteraksi dengan fasa geraknya
FASE DIAM & FASE
GERAK
Fase diam biasa digunakan
adalah alumina dari aluminium
oksida. Selain fasa diam, dalam
KLT juga diperlukan fasa
gerak/eluent yang berperan
penting pada proses elusi bagi
Empat macam adsorben larutan umpan (feed) untuk
yang sering dipakai ialah
silica gel (asam silikat),
melewati fasa diam (adsorbent).
alumunia (alumunium
oxyde), selulosa dan
kieselguhr.
N ILAI KONSTANTA DIELEKTRIKUM PELARUT

Pelarut Konstanta dielektrikum

N-heksan 2,0
Etil asetat 6,0
Kloroform 4,8
Asam Asetat 6,2
Benzena 2,3
Etanol 24,3
Metanol 33,1
Air 80,4
Asam formiat 59
Asetonitrit 38
Aseton 21
Dietil eter 4,3
Karbontetraklorida 2,2
SILIKA GEL = Sifat polar

 Silika gel G
 Silika gel GF254
 Silika gel H/silika gel N
 Silika gel S
 Silika gel PF 254 & 366
 Silika gel F254
A LUMINA K URANG POLAR

Alumina Al 2 O 3

 Alumina G
 Alumina F
 Alumina H
 Alumina P
 Alumina HF
S IFAT - SIFAT DASAR BEBERAPA ADSORBEN UNTUK
TLC
Adsorben Keasaman Aktivitas Efek Senyawa
Pemisahan Yang Dapat
Dipisahkan
Silika gel Asam Aktif Adsorbsi + Hampir
Partisi semua zat
Alumina Basis Aktif Adsorbsi + Steroid,
Partisi senyawa
bersifat basis
Magnesium - Lemah Adsorbsi Karetonoid,
Trisilikat toko ferol
Kalsium - Lemah Adsorbsi Asam lemak,
Sulfat gliserida
(K 2 SO 4 )
Kieselghur Netral Inaktif Partisi Gula,
farmasetika
 F ASE G ERAK
 Petroleum eter
 Petroleum dietileter
 Metanol
 Etil asetat
 Kloroform CHCl 3 / 119,38
 Asetonitril
 Benzena C 6 H 6 / 78,11
 Karbon tetraklorida CCl 4 / 153,82
M ACAM - MACAM PENYERAP UNTUK KROMATOGRAFI
LAPISAN TIPIS(K EALEY DAN H AINES , 2002)

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Silika Asam- asam amino, alkaloid, gula,

asam-asam lemak, lipida, minyak
esensial, anion, dan kation organic,
sterol, terpenoid.

Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,

vitamin-vitamin, karoten, asam-asam
Amino

Kieselguhr Gula, oligosakarida, asam- asam

lemak, trigliserida, asam -asam
amino, steroid.

Bubuk selulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida

Pati Asam-asam amino

Sephadex Asam-asam amino, protein

PROSEDUR KERJA
 Meneteskan Sampel

Sampel merupakan campuran senyawa

yang akan dipisahkan, dilarutkan dalam zat
pelarut yang mudah menguap, misalnya
kloroform atau zat pelarut lain yang serupa
yaitu memiliki titik didih antara 50-100oC.
larutan sampel tersebut ditetskan pada plat
dengan menggunakan pipet mikro atau
pipa kapiler. Garis batas bawah kira-kira
1,5-2.0cm dari dasar, jumlah sampel yang
diteteskan dapat berkisar antara 5-100mg
dari larutan 0,1%.
PROSEDUR KERJA

 Pengembangan

Penegmbangan dilaksanakan dengan mencelupkan dasar

plat KLT yang telah ditetesi sampel dalam system pelarut
untuk proses pengembangan. Umunya dikerjakan dalam
tempat yang tertutup dalam chamber yang ssebelumnya
telah dijenuhkan dengan menggunakan kertas saring.
Alasan penjenuhan chamber sebelum digunakan yaitu untuk
menghilangkan uap air didalam chamber agar nantinya tidak
mempengaruhi perambatan noda pada lempeng, selain itu
agar tekanan yang ada didalam chamber tidak
mempengaruhi proses perambatan noda dengan adanya
penjenuhan chamber.

Pengembangan dalam ruangan tertutup tersebut diakhiri

setelah ujung zat pada plat telah mencapai kira-kira ¾ tinggi
adsorben. Plat KLT-nya kemudian diambil dan dikeringkan,
sebaiknya dengan menggunakan aliran gas N2.
M ETODE P ENGEMBANGAN (D EVELOPMENT ) PADA KLT

Berdasar arah pengembangan

 Menaik
 Menurun
Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
 Pengembangan 2 dimensi
CARA MENDETEKSI BERCAK

Menggunakan
Penampak Penunjukkan
flourosensi bercak secara
kimia
 M ENGGUNAKAN PENAMPAK
FLOUROSENSI

– Ultraviolet light at 254

nm (shortwave UV).
– Long wave UV (340 nm)
is used less commonly.
Penampakan noda pada pegujian
Kromatigrafi yaitu :

 a. Pada UV 254 nm
 Pada UV 254 nm, lempeng akan
berflouresensi sedangkan sampel akan
tampak berwarna gelap.Penampakan
noda pada lampu UV 254 nm adalah
karena adanya daya interaksi antara
sinar UV dengan indikator fluoresensi
yang terdapat pada lempeng.
Fluoresensi cahaya yang tampak
merupakan emisi cahaya yang
dipancarkan oleh komponen tersebut
ketika elektron yang tereksitasi dari
tingkat energi dasar ke tingkat energi
yang lebih tinggi kemudian kembali ke
keadaan semula sambil melepaskan
energi.
 b. Pada UV 366 nm
 Pada UV 366 nm noda akan
berflouresensi dan lempeng akan
berwarna gelap. Penampakan noda pada
lampu UV 366 nm adalah karena adanya
daya interaksi antara sinar UV dengan
gugus kromofor yang terikat oleh
auksokrom yang ada pada noda tersebut.
Fluoresensi cahaya yang tampak
merupakan emisi cahaya yang
dipancarkan oleh komponen tersebut
ketika elektron yang tereksitasi dari
tingkat energi dasar ke tingkat energi
yang lebih tinggi kemudian kembali ke
keadaan semula sambil melepaskan
energi. Sehingga noda yang tampak pada
lampu UV 366 terlihat terang karena
silika gel yang digunakan tidak
berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.
 c. Pereaksi Semprot H2SO4 10%
 Prinsip penampakan noda
pereaksi semprot H2SO4 10%
adalah berdasarkan kemampuan
asam sulfat yang bersifat reduktor
dalam merusak gugus kromofor dari
zat aktif simplisia sehingga panjang
gelombangnya akan bergeser ke
arah yang lebih panjang (UV menjadi
VIS) sehingga noda menjadi tampak
oleh mata.
P ENUNJUKKAN BERCAK SECARA KIMIA

kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia
dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi
dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada
lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai
bercak-bercak kecoklatan.

Tetasan atau penotolan sampel harus sekecil mungkin

dengan meneteskan berulang kali dengan dibiarkan
mengering sebelum tetesan berikutnya dikerjakan.
Pengeringan tetesan sampel pada plat sebaiknya
dikerjakan dengan aliran gas N2, untuk mencegah
terjadinya kerusakan sampel karena oksida
SEBELUM SETELAH DISEMPROT
DISEMPROT NINHIDRIN
NINHIDRISE
 Penampak Bercak kimia, berdasarkan
sifatnya:
1. Permanen: Asam sulfat pekat dan ninhidrin
2. Sementara: Uap Iodium
 Penampak Bercak kimia, berdasarkan
spesifisitasnya:
 1. Spesifik:
 ninhidrin: untuk zat dengan atom N
(protein, Alkaloid dll)
 2. Umum:
 Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir
semua zat)
ALAT
A N AUTOMATIC TLC P LATE S AMPLER
KLT R EAGEN S EMPROT
M ETODE NORMAL P ENGEMBANGAN PLAT KLT
KROMATOGRAFI
KERTAS
KROMATOGRAFI KERTAS (KKt)
Kromatografi kertas (KKt) pada prinsipnya adalah Kromatografi Lapis
Tipis (KKLT) pada lapisan tipis selulosa atau kertas

Banyak digunakan untuk identifikasi kualitatif . Penemunya adalah

Martri , Consden dan Gordon.

KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah

larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat,
asam organik dan senyawa fenolat

KeuntunganKKt adalah mudah, murah dan sederhana, karena hanya

menggunakan kertas saring. Selain itu keterulangan bilangan Rf yang
besar.
Fasa diam dalam kromatografi ini berupa air yang
terikat pada selulosa kertas

Fasa geraknya berupa pelarut organik, dapat

digunakan air, etanol atau campuran pelarut tersebut

Kertas, biasanya digunakan kertas saring Whatman

No. 1, dipotong-potong menjadi beberapa carik, dan
cuplikan ditotolkan pada salah satu ujung kertas
tersebut

Selain kertas Whatman dalam teknik kromatografi

dapat pula digunakan kertas selulosa murni. Kertas
selulosa yang dimodifikasi dan kertas serat kaca.
Kertas asam asetil, kertas kieselguhr, kertas
silikon dan kertas penukar ion juga dapat
digunakan. Kertas asam asetil dapat
digunakan untuk zat–zat hidrofobik

Pengotor yang terdapat pada kertas saring

adalah ion-ion Ca2+, Mg2+, Fe3+, Cu2+
Nilai Rf merupakan perbandingan jarak perambatan suatu zat
terhadap jarak perambatan fase gerak dihitung dari titik
penotolan larutan zat

Seringkali nilai Rf mutlak sukar ditetapkan, dan berbeda dari

satu kertas ke kertas lainnya dikarenakan nilai Rf yang
diperoleh tergantung dari kondisi percobaan
Harga Rf tersebut dapat digunakan untuk
identifikasi pendahuluan zat kimia, dan
dilakukan dengan menggunakan pembanding

Jika zat yang diperiksa sama dengan zat

pembanding, maka kromatogramnya akan
memberika warna dan nilai Rf yang sama,
serta kromatogram campuran antara zat yang
dieriksa dengan pembanding akan
memberikan bercak tunggal
Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan
dengan cara berikut:
1. Pengamatan langsung, jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar
ultraviolet
2. Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar UV setelah kertas disemprot
dengan pereaksi yang dapat memberikan warna pada bercak (misal ditizon,
ninhidrin, kalium kromat, ammonium sulfide )
3. Menggunakan alat pencacah Geiger-Muller atau otoradiografik jika ada zat
radiografik
4. Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium perbiakan yang telah
ditanami, untuk melihat hasil stimulasi atau hambatan dari pertumbuhan bakteri

Dalam kromatografi kertas fasa gerak merembes ke dalam kertas karena efek
kapiler. Rembesan fasa gerak pada kertas dapat dilakukan dengan teknik menaik
( ascending ) atau dengan teknik menurun (descending) .
KROMATOGRAFI KERTAS MENURUN

Pemisahan zat dengan cara

kromatografi kertas menurun
dilakukan dengan
membeiarkan fase gerak
merambat turun pada kertas
kromatografi
fasa gerak disamping
bergerak karena efek kapiler
juga dibantu oleh efek
gravitasi sehingga rembesan
berjalan lebih cepat.
Alat
 BEJANA KROMATOGRAFI;
• bertutup kedap uap yang mempunyai lubang untuk penambahan pelarut
• Terbuat dari kaca, baja tahan karat atau porselen

 BAK PELARUT, terbuat dari kaca . Panjang bak pelarut harus lebih
besar dari lebar kertas kromatografi

 BATANG KACA ANTISIFON, digunakan untuk menahan kertas

kromatografi

 KERTAS KROMATOGRAFI, digunakan kertas saring, panjang kurang

lebih sama dengan tinggi bejana, lebar kertas tidak kuang dari 2,5 cm
tetapi tidak boleh lebih lebar dari panjang bak pelarut
CARA KERJA
Zat yang diperiksa dilarutkan dalam pelarut yang cocok
Sejumlah volumer larutan zat ( 1 mcg – 20 mcg), ditetskan
pada titik titik tertentu pada garis pinsil, garis tengah tetesan
6-10 mm dengan jarak masing masing tidak kurang dari 3 cm
Kertas digantungkan di dalam bejana dengan menggunakan
batang kaca antisifon
Dasar bejana digenangi dengan fase diam, yang teretra pada
masing masing monografi
Bagain kertas yang tergantung dibawah batang kaca
antisifon, harus tergantung bebas didalam bejana
Bejana ditutup sehingga bejana dan kertas jenuh dengan uap
pelarut
Jenuhkan fase gerak dengan fae diam dengan cara pengocokan,
kemudian masukan kedalam bak pelarut melalui lubang
Lubang ditutup, dan biarkan fase gerak merambat turun pada
kertas sejauh yang dikehendaki
Pada waktu membuka tutup bejana dan mengangkat kertas ,
usahakan agar pelarut tidak merambat lagi .
Segera tandai batas perambatan dan kertas dikeringkan
Kromatogram diamati dan diukur langsung setelah disemprot
dengan pereaksi yang cocok
Kromatografi kertas MENAIK
Pada kromatografi kertas
menaik, ujung bawah kertas
dicelup ke dalam fase gerak,
dan merambat naik pada
kertas dikarenakan gaya
kapiler
CARA KERJA
Larutan zat yang diperiksa diteteskan pada kertas saring (volume larutan
zat umumnya 1 mcg -20 mcg)
Sejumlah volume pelarut campuran kedua fase dituangkan kedalam bejana
Bak pelarut kosong ditempatkan pada dasar bejana dan kertas
digantungkan pada penggantung berbentuk kail sehingga bagian ujung
kertas tergantung bebas tergantung bebas didalam bak pelarut kosong
Bejana ditutup dan kertas dijenuhkan dengan uap pelarut (pada waktu
penjenuhan kertas tergantung tepat diatas pelarut dan proses kromatografi
dimulai pada saat kertas diturunkan hingga tercelup dalam pelarut)
Kemudian pelarut dengan jumlah cukup dituangkan kedalam bak pelarut
melalui lubang-lubang kemudian ditutup
Jika batas perambatan pelarut mencapai ketinggian tertentu, bejana
dibuka, kertas dikeluarkan, batas perambatan segera ditandai dan kertas
dikeringkan
DAFTAR PUSTAKA
Materia Medika Indonesia. Jilid V.
Jakarta: Departemen Kesehatan; 1989:p.
525-528
Harborne JB. Metode Fitokimia;
Bandung: Penerbit ITB; p.10-12
Gritter RJ, Bobbit JM, Schawrting
AE.Pengantar Kromatografi. Terbitan
Kedua. Bandung:Penerbit ITB; 1991:p.
157-159
TERIMAKASIH
KROMATOGRAFI KOLOM
Sejarah
Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis
Dilaksanakan dalam suatu kolom yg diisi dg
fase stasioner
Digunakan cairan sbg fase mobil u/mengelusi
komponen sampel keluar dari kolom
Kolom digunakan untuk memurnikan senyawa
/ pemisahan campuran
Dapat diterapkan pada skala besar
Penggunaan Umumnya Kelebihan

 Pemurnian / isolasi  Pembebanan: dapat banyak

senyawa bahan alam /  atau jumlah senyawa yang
Preparatif dipisahkan lebih banyak
 untuk analisis kuantitatif
(sedikit)

KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi Kolom Sederhana
Bergerak / aliran karena gaya grafitasi
↓
Pemilihan fase diam + fase gerak
↓
Kepolaran
↓
Pita-pita kromatogram
↓
Terbentuk fraksi-fraksi
↓
Dianalisis dengan KLT / KK↓
JENIS KROMATOGRAFI
KOLOM
 Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr
selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai
u/bhn isian kolom.
 Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara
lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg
fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil).
 Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen yg
berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner
scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobil.
 Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel
sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses
pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen
yg dipisahkan.
KROMATOGRAFI ADSORBSI
KROMATOGRAFI ADSORBSI

Zat padat sbg adsorben / fase stasioner

Alumina & silika gel paling populer
Urutan dr kemampuan adsorbsi bsr ke kcl :
 Alumina
 Charcoal
 Silika gel
 Magnesium
 Kalium karbonat
 Sukrosa
 Starch
 Selulosa
 Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala yang
lebih besar menggunakan material terpadatkan pada
sebuah kolom gelas vertikal.
Pengisian Kolom
• fase diam homogen
Fase diam • fase diam ukuran sama
• fase diam bentuk seragam
• bebas gelembung udara
Pasir

Kapas / glass
wool

Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

 Penggunaan kolom

 u/memisahkan campuran dari dua senyawa

dg membuat larutan jenuh dari campuran
menggunakan pelarut yang lebih disukai
dalam kolom.

 Membuka kran penutup untuk membiarkan

pelarut yang sudah berada dalam kolom
mengering sehingga material terpadatkan
rata pada bagian atas
 Menambahkan larutan secara hati-hati dari
bagian atas kolom. Kmdn kran dibuka
kembali sehingga senyawa campuran akan
diserap pada bagian atas material
terpadatkan, sehingga akan tampak seperti
gambar brkt ini:
 Selanjutnya ditambahkan
pelarut baru melalui bagian
atas kolom & cegah sedapat
mungkin jangan sampai
merusak material
terpadatkan dalam kolom.
 Kmdn kran dibuka, supaya
pelarut dapat mengalir
melalui kolom
 Pelarut dikumpulkan dalam
satu gelas kimia atau labu
dibawah kolom.
 Pelarut mengalir kontinyu,
shg tetap ditambahkan
pelarut baru dari bagian atas
kolom sehingga kolom tidak
pernah kering.
 Elusi dalam kolom kromatografi
Sp Solvent Elusi : proses terbawanya
E komponen dlm suatu camp,
B+E shg ada pemisahan
komponen yg dibawa oleh FG
kolom

E
A+E dari ujung atas kolom →
E bawah
D tR : waktu yg diperlukan oleh
komponen untuk bermigrasi
sepanjang kolom
Vr : volume FG yg
signal

dibutuhkan untuk membawa

komponen dari titik awal
tR
kolom → akhir kolom
PENGGUNAAN KOLOM
Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa yang
berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang
tampak adalah hijau.
Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut
yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga
material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian
tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom.
Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan
diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga
akan tampak seperti gambar disamping.
menamambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom,
jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom.
Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui
kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu
dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda
tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom
sehingga kolom tidak pernah kering.
Perubahan yang mungkin terjadi sejalan perubahan waktu
Kolom kromatografi sederhana (learning
kolom)
Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif
CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4

Isolat yang diambil

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT
CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4

A: isolat hasil isolasi I

B: isolat hasil isolasi II

A B
Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm.
fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
Hasil spektra Spektrofotometri UV