PRINSIP DASAR ANALISIS BIOMEDIK DAN

FORENSIK

Kenapa perlu analisis cairan tubuh? BILE (EMPEDU)

Drugs in Use - Cairan empedu digunakan untuk
- Forensic toxicology menganalisis perkusi ke hati untuk melihat
- Overdosis kerja dari suatu enzim
- Drug abuse - Konsistensi cairan empedu berbeda dengan
- Penggunaan obat dalam olahraga darah sehinggu dalam preparasi peru
- Therapeutic drug monitoring (Penggunaan tahapan spesifik yaitu dengan membasakan
long-term dan indeks terapi yang sempit) cairan empedu dan mengekstraksi dengan
- Farmakokinetik diklorometan : propanol
Drugs in Reasearch and Development SALIVA
- Farmakologi - Saliva dapat mengkolerasi obat di dalam
- Toksikologi darah dengan kadar dalam saliva
- Uji Klinis fase 1 dan Fase 2 (Bedanya jumlah - Kelemahan → jumlah saliva yang tidak
subjek dan tujuan penelitian konsisten. Kenapa? Karena jika ingin
Fase 1 → dosis, subjek orang sehat mengembangkan metode untuk analisis obat
Fase 2 → uji efek terapeutik ataupun racun dalam saliva harus
- Metabolisme memastikan repeatability dari hasilnya Ketika
- Farmakokinetik jumlah nya naik turun
- Pengembangan Formula - Saat sampel saliva akan diambil → orangnya
- Farmakodinamik akan diberikan parafilm atau 1-2 tetes asam
MILK (SUSU) sitrat → membuat mengeluarkan saliva lebih
- Jenis cairan yang tidak terlalu umum banyak
digunakan Rumus Basic Drugs
- Digunakan Ketika menganalisis kemungkinan 1 + 10 (𝑝𝐾𝑑 − 𝑝𝐻𝑠) 𝑓𝑝
𝑆/𝑃 = +
obat tertransfer dari ibu ke bayi (dari plasenta 1 + 10 (𝑝𝐾𝑑 − 𝑝𝐻𝑝) 𝑓𝑠
ke bayi yang dikandung) Rumus Acidic Drugs
- Kelemahan → adanya keberadaan lemak 1 + 10 (𝑝𝐻𝑠 − 𝑝𝐾𝑎) 𝑓𝑝
𝑆/𝑃 = +
sehingga perlu dilakukan tahapan spesifik 1 + 10 (𝑝𝐻𝑝 − 𝑝𝐾𝑎) 𝑓𝑠
yaitu deffating step Keterangan
CEREBROSPINAL FLUID (CAIRAN SEREBROSPINAL) S → konsentrasi obat di saliva
- Digunakan jika ingin mengetahui efek suatu P → konsentrasi obat di plasma
obat yang kemudian langsung ke sisi aksi pKd → log dari konstanta ionisasi (BD)
- Metode → bisa menggunakan preparasi atau pKa → log dari konstanta ionisasi (AD)
metode analisis yang sudah dilakukan untuk pHs → pH saliva
darah pHp → pH plasma
- kelemahan → pengambilan sampel sulit fp → fraksi ikatan protein obat di plasma
fs → fraksi ikatan protein obat di saliva
 SYNOVIAL FLUID (CAIRAN SINOVIAL)
- Sampel yang tersedia terbatas
- Digunakan ketika ingin melihat
• Septic Arthritis
• Inflammatory Arthritis
o RA
o Gout
o Lyme
o Pseudogout
• Lupus
• Osteoarthritis
- Pengkodisian analisis dapat menggunakan
metode yang sama seperti pada plasma
atau serum
- Kelemahan → pengambilan sampel yang sulit
karena diambil pada bagian lutut
VOMITUS AND GASTROLAVAGE FLUID
- Digunakan untuk melihat
keracunan → kemungkinan isi
mengandung toksin tingkat tinggi yang tidak
berubah
- Kelemahan → konsistensi muntahan dan
cairan lambung sehingga butuh metode
preparasi tambahan
- Cairan muntahan dan cairan lambung harus
disimpan dalam jumlah sebanyak mungkin
- Sodium fluoride atau sodium azide dapat
ditambahkan sebagai pengawet.
HAIR AND NAIL
- Digunakan untuk melihat drug abuse atau
penyalahgunaan obat secara long term
- Sampelnya berupa padat sehingga perlu
preparasi berbeda
MECONIUM
- Biasanya dikeluarkan ketika bayi baru lahir →
saat BAB yang pertama kali keluar adalah
Meconium
- Analisis zat pada bayi baru lahir
- Warna → hijua, coklat, kuning
- New born mengeluarkan meconium 24-28 jam
setelah lahir
SWEAT
- Kelemahan → Cara pengambilan sampel sulit,
jumlah keringat tidak konsisten
- Sweet patch → alat untuk mengambil sampel,
adsorbing sweet component → lalu diekstraksi
untuk analisis
PERICARDIAL FLUID
- Digunakan untuk analisis inflamasi
(peradangan) atau akumulasi atau
penumpukan cairan seperti sirosis
- Kelemahan → pengambilan sampel sulit
- Perikardium terdiri dari 2 lapisan → lapisan
berserat luar dan lapisan serosan bagian
dalam
- Serangkaian tes awal yang dilakukan pada
sampel cairan perikardial membantu
menentukan apakah cairan tersebut
penyebab transudat atau eksudat.
lambung - Transudat → paling sering disebabkan oleh
gagal jantung kongestif atau sirosis. Hasil
analisis fluida yang khas meliputi:
Ciri-ciri fisik :
• Cairan tampak jernih
• Kadar protein atau albumin rendah
• Jumlah sel hanya sedikit sel
- Eksudat dapat disebabkan oleh berbagai
kondisi dan penyakit. Hasil tes awal mungkin
menunjukkan:
Karakteristik fisik
• Cairan mungkin tampak keruh
• Protein atau kadar albumin tinggi
• Jumlah sel meningkat
VITREOUS HUMOR
- Cairan jernih yang mengisi diantara lensa dan
retina
- Untuk analisis post mortem → konfirmasi
analisis darah atau urin
SKELETAL MUSCLE
- Unutk analisis konsentrasi alkohol
- Konsentrasi alkohol dapat menjadi indikator
keracunan dan perkiraan jumlah yang di
konsumsi
 BLOOD
Darah utuh → diambil dari bagian tubuh langsung Kandungan Anorganik Plasma
dianalisis (tanpa treatment) 1. Anion
Plasma → ada fibrinogen (clotting), penambahan - Bikarbonat
EDTA - Klorida
Serum → tidak ada fibrinogen, cukup - Fosfat
disentrifugasi - Sulfat
- Darah utuh jarang dipakai karena paling - Iodin
kompleks dan mudah terjadi lisis 2. Kation
- Mengandung protein, lemak, padatan, dan - Kalsium
sel tersuspensi - Magnesium
PLASMA DAN SERUM - Potassium

- Menreprensitasikan konsentrasi obat, melihat - Natrium

konsentrasi efektif suatu obat apakah - Besi

konsentrasi obat tsb sudah melibihi dari dosis - Tembaga

yang seharusnya BLOOD COLLECTION TUBE

- Untuk analisis perlu proses protein precipitator • Lavender → berisi EDTA

→ proteinnya diendapkan → kenapa? Karena • Green → berisi Heparin (untuk analisis plasma)

protein terikat kuat dengan obat → • Red → serum (plain)

konsentrasi yang menunjukkan kadar efektif • Yellow → berisi SPS (Stabilizes bacterial growth)

dari suatu obat Ketika obat dalam bentuk • Light blue → darah utuh
protein free. • Grey → berisi natrium fluoride untuk

- Cara pengendapan protein: mencegah glukosa rusak (digunakan untuk

• Asam → Ammonium sulfat, HCl tes toleransi glukosa)
• Basa → etanol, metanol • Royal blue → berisi natirum heparin atau

• Enzim natirum EDTA (untuk uji kimia)

Komposisi Plasma darah • Black → berisi natrium sitrat (untuk ESR

- 90% air pediatrik)

- 10% zat terlarut PENYIMPANAN SAMPEL DARAH

(1) Protein ≈ 7% Darah Utuh

(2) Inorganic salt ≈ 0,9% - Di kulkas, tidak boleh di freezer karena sel
(3) Senyawa yang berbeda dari protein darah merah bisa pecah

Kandungan dalam Plasma - Maksimal penyimpanan 1 bulan setelah

- Asam amino sampel diambil
- Karbohidrat Serum/Plasma
- Urea - Di freezer, maksimal penyimpanan 6 bulan

- Polisakarida - Di suhu -80°C, penyimpanan bisa bertahun-

- Bilirubin tahun
- Asam organic URINE

- Kreatin - Umumnya bebas dari protein dan lemak

- Lipid
- Kreatinin
- Memiliki rentang nilai pH yang luas, Obat Metode Gangguan
tergantung dari pola makan atau Asetaminofen Kolorimetri Salisilat
pengobatan Kloramfenikol HPLC Kodein, kafein
- Punya variasi yang luas di komposisinya Demoxepam HPLC Fenitoin
Metotreksat HPLC Triamterene
Phenylbutazone Kolorimetri Barbiturat
Procainamide HPLC Asetaminofen
Teofilin RIA Dimenhidrinat

2. Degradasi sebelum analisis

- Degradasi sebelum analisis sering kali
merupakan hasil dari dekomposisi kimiawi
langsung karena ketidakstabilan obat itu
sendiri, terutama dalam cairan seperti urin
(pH ekstrem) yang tidak memiliki efek
perlindungan karena terikat pada protein
plasma.
- Degradasi mungkin juga disebabkan oleh
aktivitas enzim yang berlanjut pada
sampel setelah pengumpulan.
- Contoh: ibuprofen prodrug (ibuprofen
Warna abnormal Penyebab
piconol) dihidrolisis oleh esterase dalam
Red Eritrosit, hemoglobin,
darah, plasma dan serum.
myoglobin
3. Konjugat
Red-brown Eritrosit, hemoglobin,
- Beberapa obat diberikan sebagai
myoglobin,
konjugat, tetapi banyak obat membentuk
methemoglobin
konjugasi in vivo.
Brown-black Methemoglobin dari
- Prosedur klasik dalam menentukan
hemoglobin atau
konjugat adalah menguji sampel untuk
myoglobin
obat yang tidak berubah dan kemudian
Yellow-orange Bilirubin
setelah prosedur hidrolitik yang sesuai
Yellow-green Bilirubin atau biliverdin
menentukan obat "total"; perbedaan
Yellow-brown Bilirubin atau biliverdin
antara kedua prosedur tersebut akan
- Ammonia, glukosa, keton, leukosit tidak
dianggap sebagai jumlah obat
terdapat dalam urin
terkonjugasi.
- Urin yang disimpan memiliki komposisi yang
Analisis Konjugat Utuh Obat Menggunakan
berbeda dengan urin yang segar
HPLC
KONDISI YANG PERLU DIPERTIMBANGKAN DALAM
Obat Konjugat Cairan Deteksi
BIOANALISIS
Equilin Sulfat Serum HPLC
1. Keberadaan obat lain
Estrone Sulfat Serum HPLC
Masalah → Struktur serupa
Morfin 3- dan 6- Plasma Fluoroescence
 glukuronida
Zidovudine Glukuronids Serum HPLC
4. Chirality
- Hampir semua obat hasil sintesis yang
memiliki karbon asimetris dipasarkan
sebagai rasemat.
- Semua metodologi analitik pada saat itu
tampaknya bersifat akiral (atau
menggunakan standar yang menutupi
sifat kiral dari respons analitis)
- Propranolol dan Ibuprofen adalah kasus di
mana satu isomer secara farmakologis
tidak aktif pada dosis yang digunakan,
atau enansiomer yang tidak aktif diubah
secara in vivo menjadi isomer aktif.
5. Prodrugs
PREPARASI SAMPEL DALAM BIOANALISIS
PENDAHULUAN
Sampel preparasi untuk analisis obat dalam
cairan biologis terdiri:
1. Pelepasan obat dari konjugat atau matriks
biologis
2. Penghilang komponen endogen yang dapat
mengganggu pengujian.
penambahan pengendapan protein → untuk
menghilnagkan protein
3. Menangani sampel cairan
Typical Preparations
1. ECC
2. SPE
3. Protein Precipitation
LIQUID EXTRACTION
- Pelarut organik yang tidak bercampur
dengan air (Air → komponen serum, plasma,
urin >90%)
- Pelarut organik → sesutau yang digunakan
untuk mengekstraksi atau mengisolasi analit
dari serum, plasma, atau urin.
- Merupakan struktur kimia yang tidak aktif
secara farmakologis, tetapi diubah
menjadi molekul aktif di dalam tubuh.
- Prodrugs memiliki karakteristik kimiawi,
seperti stabilitas, lipofilisitas, keadaan
ionisasi, yang meningkatkan peluang
untuk mencapai tempat aksi, atau yang
melindungi struktur biologis intervensi dari
efek obat aktif (rasa, toksisitas)
- Prodrug harus diubah ke bentuk aktif di
tempat aksi, terutama jika bentuk aktif
akan menjadi racun di tempat lain.
- Ketika menggunakan pelarut organik yang
tidak bercampur dengan air yang terjadi
analit secara partisi berada di antara fase
organik dan fase air
- Pelarut Acid drugs → eter, etil asetat
- Pelarut Basic drugs → CHCl3, CH 2Cl2
Contoh: - Ekstraksi bisa dikontrol dengan pH
- Sebagian obat bersifat asam lemah atau
basa lemah → dikondisi pH tertentu akan
mengalami ionisasi
- Obat yang terionisasi akan sullit terpartisi di
organ
- Contoh:
HA ↔ H+ + A-
Tidak terionisasi terionisasi
Larut di lemak Larut di air
Larut di organik
Cara Liquid Extraction (2) Load → Masukkan sampel (serum atau
plasma atau urin)
(3) Wash → tambahkan pelarut organik untuk
mencuci interference (hilangkan
sebanyak mungkin pengganggu). Analit
yang diharapkan tetap berada didalam
sorbent → harus memilih pelarut yang
tidak membawa analit tapi membawa
1. Darah diambil dari donor interference
2. Dilakukan sentrifugasi → jadi plasma atau (4) Elute → menggunakan pelarut lagi unutk
serum mengelusi analit → ditampung
3. Ditambahkan dengan pelarut organik, ex: 5. Lalu diinjeksi dengan HPLC
kloroform
4. Ketika ditambahkan kloroform terjadi ECC
5. Masukkan lagi ke sentrifugator →
pengendapan
6. Cairan diambil → fase organik → kloroform
7. Lakukan evaporasi
8. Dilarutkan kembali
9. Diukur dengan instrumen
SOLID PHASE EXTRACTION
- Pengekstraksi berupa padatan, sampel Fase Diam
berupa cair - Silika → Na, K
- Proses ekstraksi dimana sampel (liquid) akan - Alumina
difilter melalui suatu partikel sorbent → analit - Karbon
akan mengalami interaksi dengan sorbent tsb - Selulosa
lalu interference akan keluar melalui tahapan- - Polystyrene
tahapan tertentu. - Fluorosil → Mg
- Keuntungan - Agarose
o Lebih cepat (5 kali) - Cyclodextrin
o Kapasitas lebih banyak Types of Sorbent-Analyte Interactions
o Menggunakan solvent lebih sedikit 1. Polar
dibandingkan ECC 2. Non polar
o Selektivitas tinggi, banyak pilihan fase 3. Ion-Exchange
diam 4. Copolymeric
Cara SPE Column Polar Extractions
1. Syringer diisi filter agar adsorben tidak keluar - Hidrofilik/fase normal
2. Masukkan adsorben - Fase diam polar → interaksi polar → ikatan
3. Isi lagi dengan filter hidrogen atau dipol-dipol
4. Kemudian lakukan 4 proses - Sorbents → silika, diol, diethylamino,
(1) Conditioning → mengkondisikan sorbent cyanopropyl
- Aplikasi → untuk sampel lipid, karbohidrat, - Pelaur elusi → pelarut basa → analit yang
fenol, vitamin larut dalam lemak tidak terion akan ternetralisasi → kalo netral
- Analit → punya gugus amin, hidroksil, karbonil, maka akan terlepas ikatannya
heteroataom, (O, S, N, P) Anion Exchange
- Pelarut elusi → polaritas sedang-tinggi - Analit → bermuatan negatif
Non polar Extraction o Fosfat
- Hidrofobik/fase terbalik o Asam karboksil
- Interaksi antara ikatan sorbent C-H dan ikatan o Asam sulfonat
analit C-H, van der waals - Sorbent → bermuatan positif
- Contoh: jika suatu senyawa memiliki gugus o Aminoproyl (weak)
benzene maka interkasinya adalah hidrofobik o Quaternary amine (strong)
atau van der waals sehingga sorbent yang o Diethylamino (weak)
dipilih adalah C8 bukan silika karena silika - Aplikasi:
interaksinya polar. o Obat senyawa asam
- Sorbent → semakin panjang rantai C semakin o Fosfat
non polar o Organic acids
- Analit → punya gugus alkil, aromatik o Fatty acids
- Pelarut elusi → polaritas no polar ke medium o Vitamins
polar - Pelarut elusi → yang sifatnya asam
- Aplikasi → Drug abuse, TDM, pestisida PROTEIN PRECIPITATION
Ion Exchange Mechanism - Menambahkan pelarut organik yang
- Ada 2: bercampur dengan air
o Kation → yang bertukar adalah - Contoh pelarut
kationnya H+ o Metanol
o Anion → Cl-, OH-, Acetate- o Aseton nitril
- pH digunakan untuk memanipulasi gugus
fungsi yang bisa mengalami ionisasi
- Ikatan ionik kuat

Cation Exchange
- Sorbent → bermuatan negatif
- Analit yang digunakan basa sehingga akan
punya muatan positif → gugus amin dan
pirimidin
- Jenis sorbent:
CURRENT SAMPLE PREPARATION OF BLOOD
o Benzenesulfonic acid (storng)
1) Dried Blood Spotting (DBS)
o Propylsulfonic acid (storng)
- Bentuknya kertas
o Carboxylic acid (weak)
- Keunggulan:
- Aplikasi → untuk senyawa basa → Ketika
o Tidak membutuhkan tempat
terionisasi menjadi positif. Untuk basic drugs,
penyimpanan dengan suhu khusus
catecholamine, pharmaceuticals, herbicides
 o Volume sampel yang dibutuhkan
sedikit
o Harga lebih murah
2) Volumetric Absorptive Microsampling
TISSUE ANALYSIS
- Untuk melihat uptake dari aksi suatu obat
- Mengkorelasikan antara konsentrasi obat
untuk respon farmakokinetik dan
farmakodinamik
- Untuk prediksi toksisitas dan dosis
- TIpe Teknis preparasi
(1) Mechanical → bisa dengan sonikasi,
homogenesis
(2) Digestion → dengan enzim atau asam
(3) Ekstraksi → dengan PCT, ekstraksi dengan
pelarut dan tekanan, enzim
PRETREATMENT SOLID SAMPLES
- Ultrasound
- Microwave assisted Extraction
- Solid Phase Micro Extraction
- Matrix Solid Phase Dispersion

GEL ELECTROPHORESIS

Th. 1987 → analisis DNA forensic dibuat pertama

kali di Amerika → DNA Finger Printing

Setiap manusia memiliki kesamaan hampir 99% →

sulit untuk dibedakan (0,1% dari 3 juta jumlah DNA
yang unik)

Prinsip Pengambilan Sampel

Sampel → darah, bekas tidur, saliva, urin

Alat → cotton bud, perekat

Jika sudah tidak ada dalam bukti dg bentuk

seperti, dapat diambil selnya → amplifikasi hingga
ribuan kali

Isolasi sampel → poton DNA menjadi fragmen

menggunakan enzim restriksi → pisahkan
menggunakan elektrophrosesi gel → diberikan 2
kutub listrik yang berbeda → karena DNA
bermuatan negative** jadi bergerak kea rah
kutub positif → transfer dari 1 fragmen gel ke
sheet membrane yang lain → buktikan dengan
menambahkan komponen DNA → compare
fragmen antara profile DNA suspek dan yang
ada pada TKP → buktikan secara berkali-kali

**DNA mengandung basa purin → basa

mengandung gugus nitrogen yang memiliki
eletron bebas → electron bersifat negative → Yang dibutuhkan:
DNA secara keseluruhan mengandung fragmen
▪ Bubuk agarosa
yang bermuatan negative
▪ Buffer
Untuk menghilangkan human error → dilakukan ▪ Erlenmeyer
pengecekkan thd orang sekita (laboran , polisi, ▪ Microwave
dan eksklud lainnya) ▪ Cetakan gel
Apakah DNA cukup untuk memperoleh ▪ Sisir gel
pengakuan atau menuduh seseorang? 1) Masukkan sedikit agarosa ke dalam
Erlenmeyer. Agarosa mirip kayak gelatin tapi
DNA forensic hanya satu dari banyak jenis bukti. terbuat dari rumput laut
Masih banyak clue lain.
2) Tambahkan sedikit buffer cair ke dalam
Dapatkah bukti DNA membebaskan narapidana Erlenmeyer. Buffer → larutan air garam yg
yang dihukum karena kesalahan hukum? akan mengalirkan muatan listrik melalui gel
3) Tutup Erlenmeyer dg plastic wrap agar
Ya bisa aja say kalo udah terbukti. Di Amerika
cairannya tidak mendidih, masukkan ke
sudah 300 orang yang lepas (18 orang dg
dalam microwave, panaskan hingga agarosa
hukuman eksekusi mati, 1 diantaranya 5 hari lagi
meleleh ke dalam buffer
mau eksekusi) → jadi sangat powerful
4) Tuangkan agarosa ke dalam cetakan yang
▪ Penangan bukti yang tepat telah disolatip pada bagian ujungnya untuk
▪ Analisis yang cermat oleh lab forensic menahan agar agarosa tidak meleleh
yang tidak bias 5) Tempatkan sisir ke dalam gel di salah satu
▪ Interpretasi hasil yang adil dan tepat ujungnya. Takik di dalam gel akan menahan
▪ Pelaporan hasil yang akurat dan efektif di tempatnya
kepada hakim 6) Biarkan gel dingin dan mengeras
7) Lepaskan sisir dengan hati-hati, akan tersisa
DNA strands adalah molekul yang sangat kecil
lubang kosong untuk sampel DNA
yang bahkan tdk bisa dilihat dibawah mikroskop
Step 2 → atur alat gel
Gel electrophoresis → digunakan untuk
mengurutkan DNA berdasarkan panjangnya, bisa Yang dibutuhkan
juga untuk memisahkan jenis molekul lain, seperti
protein. ▪ Gel yang telah dibuat
▪ Electrophoresis box
Gel adalah filter yang menyortir untaian DNA, ▪ Buffer lainnya
seperti spons yang terbuat dari jelly dengan
1) Tuang buffer ke box eletroforesis
banyak lubang kecil
2) Tempatkan gel yang masih dalam cetakan ke
Sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang di dalam box elektroforesis setelah dilepaskan
salah satu ujung gel ujungnya. Gel harus hampir terendam di
buffer. Buffer mengalirkan arus listrik dari satu
Eketroforesis → cara mendorong untaian DNA
ujung gel ke ujung lainnya.
melalui filter gel. Tambahkan alus listrik, DNA
bergerak Step 3 → masukkan sampel DNA ke dalam gel
Untaian pendek akan bergerak lebih cepat Yang dibutuhkan:
dibandingkan dg untaian panjang. Seiring waktu,
untaian yang lebih pendek dalam sampel akan ▪ Loading buffer
menjauh dari titik awal daripada untai yang lebih ▪ Tube DNA
panjang. Untai DNA dg panjang yang sama akan ▪ Standar size DNA
bergerak dg kecepatan yg sama dan berakhir ▪ Micropipette
diikat bersama → DNA dalam sampel menyortir ▪ Box elektroforesis berisi gel
sendiri ▪ Pipet tips
Pewarnaan kelompok DNA yang diurutkan jadi 1) Dengan ujung pipet yang bersih, gunakan
bikin keliatan dg mata walaupun kita tidak dapat mikropipettor untuk menyedot beberapa
melihat untai DNA tunggal, kelompok tsb muncul buffer pemuatan, lalu tambahkan ke sampel
sbg pita pada gel DNA. Sampel DNA disiapkan dalam larutan
cairan bening yang akan sulit dilihat jika
Step 1 → buat gel
 mencoba memasukkannya langsung ke
dalam lubang. Buffer pemuatan berisi
pewarna yang membuat sampel mudah
dilihat. Ini membuat sampel DNA lebih tebal,
sehingga akan jatuh ke dalam lubang, tidak
melayang. Standar ukuran DNA sudah berisi
buffer pemuatan.
2) Gunakan mikropippettor untuk mentransfer
sampel DNA dari tabung ke dalam sumur gel.
Sedot sebagian sampel DNA ke ujung pipet
3) Keluarkan sampel DNA dari pipet ke dalam
lubang pertama
4) Ambil tip bersih, gunakan mikropipettor untuk
menyedot beberapa standar ukuran DNA
5) Transfer standar ukuran DNA ke lubang
kosong berikutnya. Standar ukuran DNA
mengandung untaian DNA dengan panjang
yang diketahui → memperkirakan panjang
untai DNA yg di uji
Step 4 → sambungkan alus listrik dan nyalakan gel
1) Ketika mematikan daya, ujung hitam akan
menghasilkan muatan negative, ujung merah
akan menghasilkan muatan positif. Mereka
akan melewatkan arus melalui gel secara
bersamaan. DNA memiliki muatan negatif.
untuk memindahkan DNA melalui gel, Anda
harus meletakkan kabel hitam - muatan
negatif - paling dekat dengan sumur
2) Periksa gelembung udara kecil yang keluar
dari elektroda di kedua ujung kotak
elektroforesis. Gelembung-gelembung ini
adalah bukti bahwa arus sedang berjalan
SDS PAGE
• SDS-PAGE → sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis →
terdiri dari 20 rantai karbon yang
ujungnya terikat di sulfat sehingga
memiliki gugus nonpolar panjang
• Merupakan deterjen (sabun) yang
dapat melarutkan molekul hidrofobik
tetapi juga memiliki muatan negatif
(sulfat) yang melekat padanya.
• Teknik yang banyak digunakan dalam
biokimia, forensik, genetika, dan
biologi molekuler:
• Untuk memisahkan protein sesuai
dengan mobilitas elektroforetiknya
3) Ditolak oleh muatan negatif, DNA bergerak
melalui gel menuju muatan positif di ujung
lainnya. Untaian DNA pendek bergerak
melalui lubang di gel lebih cepat daripada
untaian panjang. Seiring waktu, untaian DNA
yang lebih pendek akan bermigrasi lebih jauh
dari titik awal daripada untai yang lebih
panjang. Kita tidak dapat benar-benar
melihat pita DNA yang bermigrasi (abu-abu),
tetapi kita dapat melihat pewarna biru dari
buffer pemuatan saat ia bermigrasi.
Step 5 → warnai gel dan analisa
1) Pertama Anda perlu menodai DNA di gel
Anda menggunakan larutan pewarnaan
DNA. Noda adalah bahan kimia yang
disebut etidium bromida, yang mengikat
DNA dan terlihat di bawah cahaya
fluoresen. Meskipun kita tidak dapat
melihat untaian DNA tunggal, kita dapat
melihat kelompok besar untai DNA yang
ternoda. kelompok-kelompok ini akan
muncul sebagai pita dalam gel
2) Etidium bromida berikatan dengan DNA,
dapat merusak DNA di sel Anda. jika Anda
menodai gel di kehidupan nyata,
kenakan sarung tangan dan hindari
kontak langsung dengan larutan pewarna
3) Keluarkan gel dari larutan pewarnaan,
masukkan ke dalam sinar UV, analisis
Ini kalo mau liat animasinya
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
(fungsi dari panjang rantai polipeptida
atau berat molekul).
• Untuk memisahkan protein menurut
ukurannya, dan tidak ada ciri fisik
lainnya
 • Bedanya dengan agarose, SDS
dilakukan secara vertikal →
western blot
• H besar menunjukkan daerah
hidrofobik di mana gugus-R nonpolar
terkumpul untuk menjauh dari air polar
yang mengelilingi protein.
• Setelah SDS: SDS mengganggu area
hidrofobik (H) dan melapisi protein
dengan banyak muatan negatif yang
melebihi muatan positif yang dimiliki
protein karena gugus-R yang
bermuatan positif. Protein yang
dihasilkan telah didenaturasi oleh SDS
(direduksi menjadi struktur primer-
urutan asam amino) dan sebagai
hasilnya telah dilinierisasi.
• SDS (sabun deterjen) memecah area
hidrofobik dan melapisi protein
dengan muatan negatif sehingga
kelebihan muatan positif pada protein
• Deterjen mengikat daerah hidrofobik
dengan rasio konstan sekitar 1,4 g SDS
per gram protein.
• Oleh karena itu, jika sel diinkubasi
dengan SDS, membran akan terlarut,
semua protein akan dilarutkan oleh
deterjen dan semua protein akan
tertutup oleh banyak muatan negatif.
• Protein didenaturasi dan dimasukkan
ke dalam medan listrik, mereka semua
akan bergerak menuju kutub positif
dengan kecepatan yang sama, tanpa
pemisahan berdasarkan ukuran.
• Namun, jika protein dimasukkan ke
dalam lingkungan yang
memungkinkan protein dengan
ukuran berbeda bergerak dengan
kecepatan yang berbeda.
Lingkungannya adalah poliakrilamida.
seluruh proses ini disebut
polyacrylamide gel electrophoresis
(PAGE).
• Molekul kecil bergerak ke are
polyacrylamide lebih cepat
dibandingkan molekul besar
• Molekul besar tetap berada di dekat
well.
HASIL SDS PAGE
Hasil akhir dari SDS- PAGE memiliki dua ciri
penting:
1) Semua protein hanya mengandung
struktur primer
2) Semua protein memiliki muatan
negatif yang besar yang artinya
semua akan bermigrasi menuju kutub
positif ketika ditempatkan di medan
listrik.
Apa yang terjadi setelah elektroforesis?
1) Perbaiki protein dalam gel dan warnai.
2) Transfer elektroforesis ke membran lalu
periksa dengan antibodi- (Western
blotting → analisis dengana antibodi)

PENDAHULUAN DNA FORENSIK

1823→ John Evangelist Purkinje: thesis berjudul 9
pola fingerprint
1892→ Juan Vucetich: identifikasi criminal
menggunakan fingerprint pertama
Limit dari pengujian forensic: fingerprint dapat
terhapus dan dalam identifikasinya harus pakai
sarung tangan

Alphonse Bertillon: menggunakan foto untuk Intergenic DNA dan intron merupakan DNA
mendokumentasikan tkp fingerprint dari manusia
Limit dari foto: pelaku menutupi identitasnya
NON CODING SEQUENCES
1985→ Alec Jeffrey: menemukan metode DNA Genom dari eukariot memiliki banyak
fingerprinting. Bentuk sel tubuh di setiap bagian pengulangan DNA
berbeda tetapi DNAnya sama Daerah intron dan intergenic: berisi pasang basa
yang berulang
PRINSIP Repeats Repeats1
Susunan kimia dari DNA dari satu individu selalu unit
sama Satellite DNA 100-1000 Tak hingga
Variasi DNA dari setiap individu berbeda pada pb
susunan pasang basanya→ DNA fingerprint Minisatelite 7-99 pb 7-80 pb
DNA/
DNA MANUSIA Variable
DNA manusia ada di dalam nucleus dan number of
mitokondria sitoplasma tandem
Mitokondria haploid dan hanya gen dari ibu repeats
Nukleus berdifat diploid dari ayah dan ibu (VNTR)re
Microsatellite 2-6 pb 5-40 pb
NUCLEAR CHROMOSOMES DNA (short
Kromosom manusia linier dan berpasangan tandem
Saling berpasangan: homologous pairs repeats)
Manusia: somatic (diploid) dan gamet (haploid)

SEL SOMANTIC VNTR

Kromosom 1-22: autosom (sel tubuh), Susunan blok yang menunjukan pengulangan
menentukan bentuk fisik tubuh kecuali sel kelamin urutan DNA pada bagian tertentu
Kromosom 23: sel seks mengandung x dan y Yang membedakan dari setiap individu: Pola
ulangan sama tetapi jumlah pengulangannya
LOKUS DAN ALEL berbeda
Satu kromosom ada dua alel (kanan dan kiri)
Letak gen didalam alel: locus

TIPE STRs
Dapat berupa dinukleotida, trinukleotida,
tetranukleotida,pentanukleotida,hexanukleotida
Pola pengulangannya:
AUTOSOME: CODING DAN NON CODING 1. Simple repeats: identic panjang dan
Kromosom nucleus dan mitokondria urutannya (ATATATAT)
emngandung dua tipe nukleotida yaitu 2. Compound repeats: terdiri dari dua pola
1. Coding sequences: Menyusun gen (hanya simple repeats (ATATGCGCATGC)
1%) 3. Complex repeats: dua atau lebih dan
2. Non coding sequences: fungsinya belum panjangnya tidak sama
diketahui (ATATATGATATATG)
Short tandem repeats
Ada 2 karena berasal dari ayah dan ibu
Homozigot: kedua alel memiliki panjang yang
sama
Heterozigot: kedua alel memiliki Panjang yang
berbeda
DNA MITOKONDRIAL
Memiliki 2 membran
Mitokondria adalah sel penghasil sumber energi
Didalam mitokondria ada DNA yang haploid
yang berbentuk sirkuler
Teori: pada zaman dahulu mitokondria menelan
banyak bakteri untuk sumber energi
DNA yang ada di mitokondria: berasal dari ibu
Setiap mitokondria mengandung 2-3 DNA sirkuler
dengan panjang 16.569 (lebih pendek dari DNA
nucleus 3 juta)

LOCI NOMENCLATURE (penamaan lokus)

Introns: STR nya berdasarkan gen nya
TH01: terletak di intron no 1 dari gen tyrosine
hydroxylase
Intergenik DNA: nama berdasarkan
kromosomnya
URUTAN CODING DAN NON CODING
D5S818:
MITOKONDRIA
D: DNA
dalam DNA mitokondria: DNA coding dan non
5: kromosom no 5
coding terpisah sempurna
S: single copy di gemom
Digunakan untuk identifikasi korban wanita
818: lokus no 818
karena DNA mitokondria diturunkan oleh ibu ke
seluruh anaknya baik pria maupun wanita
SOMANTIC
DNA mitokondria dibagi 2: hypervariable 1 (HV1)
Kromosom 23 menentukan jenis kelamin manusia
dan HV2 sepanjang 1100 pasang basa
Kelainan jenis kelamin ganda triploid (XXY)
Kalo X doang itu gaada jenis kelaminnya
Kromosom Y: penanda laki laki dan hanya
diturunkan dari ayah dan kakek

Struktur kromosom Y

PREPARASI DARI DNA FINGERPRINT

1. Pengumpulan sampel specimen
2. Ekstraksi DNA
3. Uji DNA
PENGUMPULAN SPESIMEN
Tujuan: mencari penyebab kematian dari
seseorang
DNA dapat dikumpulkan dari
1. Saliva, darah, rambut, kulit, kuku, gigi
2. Pakaian kotor, rokok, gelas, darah, sperma
DNA yang dikumpulkan dari TKP menggunakan
Heterocromatin (warna abu abu): tidak scapels, pinset, gunting, kain steril
menentukan jenis kelamin Alat yang digunakan untuk mengumpulkan
Euchromatin (warna hitam dan putih): sampel umumnya sekali pakai
menentukan jenis kelamin Sampel yang ideal: 1 ml darah segar, darah
Bagian dari lekukan ke atas: amel ditambahkan dengan EDTA sebagai
Identifikasi laki laki menggunakan kromosom Y antikoagulan
Identifikasi wanita pake sel tubuh Cara mengumpulkan darah
 1. Darah pada pakaian: investigator
mengambil langsung pakaian yang
terkena darah atau menggunakan kain
steril untuk di basahi dan ditempelkan
pada pakaian yang bernoda darah
2. Darah mengering pada furniture: mengirim
objek yang terkena darah ke lab
3. Darah kering pada dinding, atau objek
besar: mencungkil sampel darah dan
diletakan di wadah steril
Barang bukti tidak boleh diletakan di plastic →
lembab→ seharusnya di evidence bag
Untuk mencegah kontaminasi maka investigator
wajib:
- Menggunakan sarung tangan disposable
- Menggunakan peralatan disposable atau
alat yang sudah steril
- Tidak boleh ngobrol, bersin, batuk
- Tidak boleh menyentuh barang yang
mengandung DNA
- Keringkan barang bukti dengan angin
sebelum dikemas
- JANGAN PERNAH MENCAMPUR SAMPEL YANG
DITEMUKAN (dikhawatirkan berasal dari
korban dan pelaku)
Jauhkan barang bukti dari: cahaya matahari,
suhu tinggi, bakteri
PENGUJIAN DNA
Sampel harus ada pembanding apabila tidak
ada pembanding maka tidak dapat digunakan
Pembanding dapat dikumpulkan dari ibu, anak,
ayah
Pembanding diambil dari dinding pipi (buccal
cell)
ANALISIS DNA
Analisis DNA bisa dilakukan pada sampel yang
belum lahir
Metode yang dapat digunakan:
1. Amniocentensis
2. Chrionic villus sampling
AMNIOCENTENSIS
Dapat dilakukan ketika kandungan berusia 16
minggu. Karena cairan ketuban sudah banyak
CHORIONIC VILLUS SAMPLING
Alat: suction tube untuk menghilangkan chirionic
vili
Kelebihan: jumlah sel yang digunakan cukup dan
dapat digunakan saat kandungan berumur 8-10
minggu
Kelemahan: resiko tinggi menyebabkan
keguguran
EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN DNA
Reaksi dilakukan di tabung eppendrof
Untuk kasus pemerkosaan: sperma pelaku juga
diuji
Metode ekstraksi:
1. Physical: sel dipecahkan menggunakan
cara mekanik. Contoh: menggerus
2. Chemical: sel dipecahkan menggunakan
kimia. Contoh: agent yang merusak
dinding sel dan agen yang merusak
membrane sel (extraction buffer)
3. Kombinasi
PEMISAHAKAN ASAM NUKLEAT
Metode:
- Ekstrasi/ precipitasi
- Kromatografi adsorption
EKSTRAKSI
Metode ini ditemukan oleh: alex jefferies
Prosedur
Mencolek bagian vagina untuk mengambil sel →
tambahkan buffer lisis yang tidak mengandung
DTT → didapatkan sel sperma (Sel vagina akan
mati)→ inkubasi 2 jam 37C→ sentrifugasi
Sampel berbeda→ menambahkan buffer
mengandung DTT → didapatkan sel vagina (sel
sperma hancur)
DNA TESTING
1. DNA fingerprint/VNTR :
- RFLP multilocus
- RFLP single locus
- PCR VNTR
2. DNA profiling/STR :
- PCR STR
3. Y chromosome testing
4. SNP testing
5. Mitochondrial DNA testing
DNA fingerprinting digunakan untuk:
- Forensic
- Tes untuk mengetahui hubungan keluarga
- Identifikasi korban bencana
- DNA analisis untuk hewan atau tumbuhan
FORENSIC WORK
The Narborough Village Murder
Pembubuhan berantai di asrama putri→
identifikasi pelaku dengan RFLP multilocus
dengan jumlah yang dicurigai sampai 5500
orang→ dari 5500 orang tidak ada pelakunya→
pelaku ditemukan saat seseorang lapor ada baju
berdarah di kamarnya→ pelaku tertangkap
Limit pengujian: kalo gaada sampel pembanding
maka identifikasi tidak bisa dilanjutkan
The Forest Hill Rapist
Terjadi pada tahun 1988
Victor lopez melakukan penyerangan seksual→ 3
korban bilang pelakunya laki laki berkulit hitam
(lopez berkulit putih)→ hasil uji darah dan
sperma→ DNA cocok→ lopez bersalah
Point: DNA berguna apabila korban salah
mengingat pelaku
Simpson/Goldman Murders
Terjadi tahun 1994
Nicole brown simpson dan Ronald goldman→
dibunuh oleh mantan suami Nicole (O.J Simpson)
→ DNA dikumpulkan dan cocok dengan O.J
Simpson→ pengacara menentang prosedur
pengumpulan barang bukti (tidak sesuai SOP) →
hasil akhir pembuktian DNA tidak terbukti dan O.J
Simpson tidak bersalah
Alasan ga valid: karena mobil yang digunakan
adalah mobil O.J Simpson, barang bukti
terkontaminasi (banyak yang akses)
HUMAN ERROR DAN KONTAMINASI
Ancaman yang menggangu DNA evidence:
1. Human error→ pengumpulan DNA harus
ter record secara sistematik agar sampel
yang dihasilkan berkualitas tinggi
2. Kerusakan saat analisis→ kondisi dan SOP
lab harus sesuai untuk mencegah sampel
rusak
3. Band shifting→ terjadi saat elektroforesis
ketiika fragmen DNA dari satu jalur
bermigrasi lebih cepat dibandingkan
dengan fragmen di jalur lainnya (gel yang
tidak konsisten a tau surplus DNA di salah
satu jalur)
PARENNITY TESTING
VICTIM IDENTIFICATION
September 11
3000 orang meninggal karena serangan teroris
pada 11 sept 2001
Karena keadaan yang sulit, ilmuwan forensic
melakukan identifikasi korban dari sisa sisa tubuh
yang ada (tulang dan gigi)
M-FISys
Mass Fatality Identification System
Metode baru yang merupakan gabungan dari
semua metode yang sudah ada
Menggabungkan STR, mtDNA, dan SNP
Digunakan untuk identifikasi korban 11 september
(dari 3000 hanya terdeteksi 1700), identifikasi
korban tsunami asia tenggara
NON HUMAN DNA ANALYSIS
Dilakukan untuk hewan dan tumbuhan
Contoh: untuk deteksi tipe ginseng amerika dan
asia menggunakan DNA sequencing
Ginseng amerika: untuk menenangkan syaraf
Ginseng asia: untuk menambah energi
Contoh lain:
- Membedakan varietas crossbreeding dari
wine. Digunakan untuk mengetahui
kemurnian dari suatu anggur.
 Anggur mahal dan bagus (yang dibuat sudah diburu itu masuk ke kategori hewan
dengan cabinet sauvignon, merk dagang yang dilindungi (tidak boleh diburu) atau
Cabernet Franc) sering dipalsukan dengan hewan yang boleh di buru
anggur Sauvignon Blanc
- DNA profiling digunakan untuk mengontrol
populasi di alam bebas. Apabila populasi
sudah berlebih maka boleh diburu. Pihak
berwajib mengumpulkan sampel darah dari
hewan yang ditangkap dengan database
untuk mengetahui apakah hewan yang
 DNA Fingerprint / Analisis DNA Forensik
1823, John Evangelist Purkinje – pola 9 sidik jari
1892, Juan Vucetich – identifikasi kriminal pertama Variable Number of Tandem Repeats (VNTR)
Batasan: sidik jari mudah terhapus dan dapat Urutan DNAnya sama, jumlah pengulangannya
memakai sarung tangan yg berbeda tiap individu
1800, Alphonse Bertillon – fotografi bukti-bukti TKP
untuk rekonstruksi TKP
1985, Alec Jeffrey – mengembangkan metode
DNA fingerprinting
Prinsip DNA Fingerprinting
2 aspek DNA:
Short Tandem Repeats (STR)
- Struktur kimia dari DNA sama. Semua sel di
2-6 urutan pasang basa
dalam tubuh memiliki bahan DNA yg sama.
• Simple repeats: Panjang urutannya sama,
- Urutan pasangan basa DNA berbeda pada
sekuensnya sama (co: AT-AT-AT)
gen di setiap individu
• Compound repeats: panjang urutan sama,
polanya berbeda (co: AT-AT-GC-GC-AT)
DNA manusia terdapat dalam inti sel dan
• Complex repeats: panjang urutan berbeda,
terlindung dalam membrane (bakteri tidak
sekuensnya berbeda (co: AT-GC-ATG)
memiliki membrane). DNA manusia juga terdapat
dalam mitokondria.
DNA inti: diploid (dari ayah dan ibu)
DNA mitokondria: haploid (dari ibu)

Kromosom Inti (Nukleus)

Sel manusia: sel somatik (diploid) dan sel
kelamin/gamet (Haploid)
Setiap sel somatik memiliki 23 pasang kromosom
(diploid); 23 sel maternal dan 23 sel paternal
(pasangan homolog) Jika alel ayah dan alel ibu panjangnya sama:
Kromosom 1-22: autosom, berisi gen yang homozigot
menentukan bentuk/ciri tubuh kec. jenis kelamin Jika alel ayah dan alel ibu panjangnya berbeda:
Kromosom 23: penentu jenis kelamin (kromosom heterozigot
seks) Penamaan Daerah Intergenik
Kromatid: kromosom yang siap membelah D5S818
menjadi 2 D: DNA
Alel: tipe DNA 5: kromosom 5
Lokus: lokasi atau tempat suatu DNA S: single copy genom (urutan itu 1 kali terjadi di
Sekuens Coding dan Non Coding satu genom)
Gen hanya memiliki 1% komposisi dr suatu Inti 818: lokus ke 818
Gen: terdiri dari ekson dan intron Penamaan Daerah Intron
Jika DNA akan diterjemahkan menjadi protein, TH01
bagian intron dan intergenik perlu dibuang TH: nama gen (contoh Tyrosine Hydroxylase)
Jika DNA akan dianalisis forensiknya, DNA yg perlu 01: nomor intron (contoh intron ke 1)
dibuang, bagian intron & intergenik yg dianalisis Sel Kelamin (Gamet)
Intron tidak akan sama di tiap individu - letak sidik SRY (Sex-determining Region Y)
jari DNA Kromosom Y hanya akan diturunkan pada garis
Sekuens non coding: berisi repeated DNA (urutan keturunan laki2: kromosom Y pada kakek, ayah,
DNA yg berulang) anak laki-laki pasti sama
Satellite DNA: 100-1000bp Dapat digunakan utk penanda forensik kalau
Minisatellite DNA (VNTR): 7-99 bp (berulang 7-80x) korbannya laki2 dan sampel pembandingnya
Microsatellite DNA (STR): 2-6 bp (5-40x) anggota keluarga laki2
Heterochromatin: bagian yg tdk menentukan
sifat kelakian
Euchromatin: bagian yg menentukan sifat
kelakian (35-36 Mb)
Kromosom Mitokondria
Teori Endosimbiosis: dimana bakteri dan sel
eukariot saling menguntungkan dan menjadi
satu kesatuan membentuk sel eukariot
Sel telur ibu: sel yg sempurna memiliki inti sel,
sitoplasma, dkk oleh karena itu semua organel yg
kita miliki adalah turunan dr ibu
DNA mitokondria membentuk lingkaran
• Panjangnya 16,569 basa dibandingkan dgn
DNA inti yg 3 juta basa
• Daerah coding dan non coding terpisah
• Daerah non coding: Hypervariable I (HV I)
dan HV II
Saudara seibu semua DNA mitokondria nya
sama
Preparasi DNA Fingerprint
• Koleksi Spesimen
Sampel DNA didapat dari:
- Saliva, darah, helai rambut, kulit, kuku
tangan atau kaki dan/atau gigi
- cucian kotor, Puntung rokok, gelas, noda
darah kecil, noda semen kering, etc
Alat untuk mendapatkan sampel: smear
slides, scalpels, tweezers, object glass, scissors,
sterile cloth squares, blood collection kids
Spesimen ideal: darah blm menggumpal 1 ml
Bagaimana Darah dikumpulkan?
- Darah pada kain: diambil kainnya;
gunting daerah yg terkena darah;
diusapkan cotton bud steril yg dibasahi
air. Syarat: setiap sampel darah tidak
boleh disatukan
- Darah pada furniture atau dinding:
bagian furniture dikikis dgn pisau
Musuh dari bukti: cahaya matahari, suhu
tinggi, bakteri. Namun utk DNA mitokondria
berumur 100 tahun pun masih bagus
Bukti yang dikumpulkan dari TKP akan
dibandingkan dengan DNA dari sumber lain
(dari barang pribadi korban atau DNA
keluarga)
• Ekstraksi DNA untuk analisis
Metode mengekstraksi DNA dari bayi yang
belum lahir
• Amniocentesis: dapat dilakukan jika umur
janin sekitar 16 minggu. Diambil cairan
ketuban karena mengandung sel bayi.
• Chorionic villus sampling: dapat dilakukan
saat umur janin sekitar 8 - 10 minggu.
Diambil sel plasenta atau chorionic villi.
Namun resikonya lebih tinggi krn
mengganggu janin/memicu keguguran
Ekstraksi dan Pemurnian DNA
Reaksi dilakukan dalam tabung Eppendorf
Teknik Ekstraksi:
• Metode fisik: menggunakan kekuatan
mekanik, contoh grinding
• Metode kimia: menggunakan senyawa
kimia, contoh buffer ekstraksi
• Kombinasi metode fisik dan kimia
Pemisahan asam nukleat:
• metode ekstraksi/presipitasi
• metode kromatografi adsorpsi
Ekstraksi sampel DNA pada kasus pemerkosaan
• Penambahan buffer tanpa DTT: merusak
sel dr wanita
• Penambahan buffer dengan DTT:
merusak sel sperma
Testing DNA
1) DNA Fingerprint/VNTR
- RFLP Multilocus
- RFLP Single Locus
- PCR VNTR
2) DNA Profiling/STR
- PCR STR
3) Y Chromosome Testing
4) SNP Testing (SNP: suatu basa yg bermutasi)
5) Mitochondrial DNA Testing
Penggunaan DNA Fingerprint atau Profiling
• Pekerjaan forensik pada TKP
• Uji untuk mengetahui keturunan
• Identifikasi korban dalam kasus bencana
alam atau kecelakaan
• Analisis DNA non manusia
Titik kelemahan DNA forensik
• Human Error: pengambilan barang bukti
tidak dilakukan secara terekam atau
sistematis. Terlalu banyak orang yang
mengakses barang bukti dan tidak terkontrol
• Kerusakan pada saat analisis: perlakuan thd
barang bukti tanpa standar (SOP) shg rusak
• Band shifting: inkonsistensi gel pada saat
elektroforesis DNA
M-FISys (Mass Fatality Identification System)
Sistem software yg menggabungkan STR, DNA
mitokondria, SNP utk identifikasi DNA korban 9-11
Analisis DNA non manusia
membedakan varietas tanaman dan hewan
co: ginseng asia vs amerika; anggur (wine) yg
hasil kawin silang
Forensic DNA Analysis: Y-STR
Y CHROMOSOME STRUCTURE
Hanya diturunkan oleh laki laki. Kromosom kedua
terkecil
Pseudoautosomal region: Ujung ujung nya akan
menempel pada kromosom X. 2,5 Mb

STR yang paling sering digunakan:

Heterokromatin: tidak menentukan sifat

PROSES
• Ekstraksi
• Amplifikasi menggunakan PCR
• Analisis menggunakan STR

Eukromatin: 35-36 Mb, 9.5 Mb sequenced (27%).

Daerah yang dianalisis

WHY Y CHROMOSOME
• 98% kejahatan dilakukan lakilaki
• Studi evolusi
• Male component bisa diisolasi
menggunakan ekstraksi tambahan
• Paternal lineages
SEX IDENTIFICATION
Y chromososme specific loci
QUALITY CONTROL
Kesamaan kromosom anak Y anak laki laki dan
ayah nya 100%
• Running sampel referensi
• Analisis bloodstains yang tidak diketahui
• Peternity testing workshop oleh genetic
tanpa society

Forensic DNA Analysis: Mitochondrial DNAs

MITOKONDRIA
Sebgai tempat respirasi sel (produksi ATP)
Mempunyai dua membrane, cristae, matriks, dan
DNA sendiri (mtDNA) yang mengnkode protein dan
enzim yang digunakan mitokondria
DNA MITOKONDRIA
• Berasal dari mitokondria ibu
• Ditemukan di mitokondria
• Double helix, circular
• Free nuclear envelope
• Tidak di pack sebagai kromatin
• Nuclear DNA digunakan untuk
membedakan induvidu yang berasal dari
satu keturunan (sampel: saliva, semen,
darah). Kalau mtDNA tidak bisa digunakan
untuk identifikasi individu dari keturunan
yang sama (sampel: rambut, tulang, gig)
 • Kelebihan: bisa identifikasi untuk sampel PREPARASI SAMPEL
yang sangat tua • Rambut: dipotong kecil kecil → dikasih
penghancur (detergent dalam ultrasonic
waterbath) → larutan ekstraksi → gerus
dengan mortar dan pestle → homogenate
material
• Tulang dan gigi: dibersihkan dari semua
pengotor → di kerok/dikasi bahan
pelembut → ekstraksi
PCR STRs

MITOCHONDRIAL GENOME

Yang dibaca adalah urutan (sequencing) bukan

pengulangan
ANALISIS DATA
610bp mtDNA (HV1 dan HV2) dibaca lalu
dibanding kan dengan ibu/neneknya. Satu saja
perbedaan mka bukan keturunannya/ bukan
orang yang sama
Daerah yang diterjemahkan (coding region) dan
daerah non-coding (control region/hypervariable
region) terpisah total, dibagi menjadi dua:
• Hypervariable Region 1 (HV1): 342bp
• Hypervariable Region II (HV2: 268bp
ANALISIS mtDNA
• Analisis visual primer
• Preparasi sampel Hasil: suspect 2 dan 4 kemungkinan sodara se ibu
• Ekstraksi SEJARAH
• Amplifikasi PCR • Akhir 1980 – pertama kali di analisis oleh
• DNA sequencing laboratorium FBI
• Analisis data • 1992 – mulai digunakan pada kasus criminal
PRIMARY VISUAL ANALYSIS • Juni 1996 – sebagai bukti pada kasus state
Karena biasanya sampel sudah tua maka harus of Tennessee vs paul ware
dipastikan bahwa yg di analisis adalah sampek • Dilakukan untuk mengidentifikasi anak yang
manusia dijual setelah pemerintahan militer
• Rambut: dilihat struktur rambut dengan Argentina
mikroskop • Dilakukan untuk menemukan makam Jesse
• Gigi dan tulang: diskusi dengan James
anthropologis dan odontologis apakah itu
tulang manusia/bukan. Apabila sudah
dipastikan baru lakukan DNA analysis
•

Immunoassays
ANALISIS BIOMEDIK • Apus kulit
Sampel: • Sum sum tulang
• Saliva • Feses
• Sputum • Lubang vagina
• Urin • Kulit mati
• Nasofaring Direct Testing:
• Apus tenggorokan • Microscopic: pewarnaan gram, acid-fast
• Darah stain, fluorescent Ab stain, gene probes
 • Makroskopik: direct antigen, gene probes • Precipitation Assays
Culture: • Complement fixation
• Uji Biokimia Modern:
• Uji serotype • EIA (IHC/ELISA/ELISPOT)
• Sensitifitas antimikroba • Immunofluorence (IFA FACS)
• Gene probes • CLIA (cheliuminescence immunoassay)
• Phage typing AGLUTINASI
• Animal inoculation Ketika Ag berikatan dengan Ab yang sesuai maka
IMMUNOASSAYS akan terbentuk gumpalan. Dibagi menjadi 2 tipe
Digunakan karena menggunakan protein (Ab) yaitu direct agglutination dan indirect
yang bisa fleksibel menyesuaikan dengan analit agglutination (dibantu protein lain)
yang ingin di test, sehingga tidak usah dilakukan
pemisahan dari campuran analit yang kompleks
Definisi: teknik analisis yang menggunakan Ab
sebagai pengikat selektif suatu komponen dalam
sampel (Ab-Ag binding)
APLIKASI
• Drug testing
• Hormone testing (kadar insulin)
• Bacterial/viral testing (AIDS, hepatitis, covid)
• Environmental testing (herbisida, pestisida)
KELEBIHAN
• Relative murah
• Sensitif Serologi kualitatif: dibagi menjadi dua: serological
• Bisa untuk sampel yang sedikit (diambil serum darah lalu dideteksi da Ab
• Bisa dilakukan massal nya/tidak, deteksi menggunakan Ag) dan
• Bisa untuk deteksi wide-range compounds serotyping (diambil virus/bakterinya yang
STRUKTUR Ab kemudian di test menggunakan reagen Ab)
Serologi kuantitatif: diukur jumlah gumpalan (misal
menggunakan spektro dengan melihat cahaya
yang diteruskan)
Aplikasi: tes golongan darah AB0 dan Rh, widal test
(diagnosis salmonella), rapid plasma regain (sifilis),
weil-felix reaction (ricketsial), latex agglutination
test (ab ditempelkan di latex)
PRECIPITATION ASSAYS
Suatu Ab bertemu analit/Ag

PENGGUNAAN ANTIBODI

Biru: Ab lebih banyak, ungu: Ab-Ag sama, pink: Ag

lebih banyak
• Apabila analit yang digunakan untuk
deteksi >5000 MW, Ab bisa langsung bisa
berikatan dengan Ag
• Apabila <5000 MW, analit harus diikat dulu
dengan senyawa lain sehingga ukurannya
lebih besar.
Ab-Ag INTERACTION

Ka: 106 sampai 1010 M-1 sudah bisa di deteksi

Tradisional:
• Aglutinasi
 LABELED IMMUNOASSAYS
• Competitive binding
Tambahkan reagen yang diketahui (komplemen
dengan Ab, sudah ditandai), kemudian Ag pasien
yang tidak dikatahui dan Ab yang diketahui. Ag
pasien dan reagen akan berkompetisi menempati
Ab (tapi Ag pasien akan nempel duluan). Maka
semakin banyak pendaran (dari reagen yang
sudah ditandai) semakin kecil nilai Ag pasien
(perku dicuci).

Double Immunoduffusion

• Non competitive binding

Hanya Ag pasien dan Ab

Radial Immunodiffusion
Dalam capet ditambah antibody kemudian
dulubangi, didalam lubang di tambah Ag akan
berdifusi keluar dan membentuk zona

COMPLEMENT FIXATION
Serum darah pasien ditambah Aq, apabila sudah • Heterogeneous dan homogeneous
dihasilkan Ab maka akan membentu Ab-Ag immunoassays
complex, kemudian ditambah komplemen + RBC Hetero: perlu pemisahan ikatan Ab-Ag (pencucian)
kambing → positif: cairan warna merah, negative: Homogen: tidak perlu pencucian, dilakukan untuk
cairan bening analisis analit kecil seperti abused dan terapi obat
 Kekurangan:
• Bahaya bagi kesehatan
• Disposal problems
• Waktu paruh sebentar
• Peralatan mahal
ENZYME IMMUNOASSAY
Kelebihan:
• Murah
• Readily available
• Waktu paruh panjang
LABELS • Adaptable
• Radioaktif • Relative murah
• Anzim • No health hazard
• Fluorescent • Hanya perlu sedikit enzim
• Chemiluminiscent • Bisa kualitatif dan kuantitatif
RADIOIMMUNASSAY (RIA) Enzim dipilih berdasarkan: substrat, kecepatan
• Ikatan kompetitif deteksi, stabilitas, availibilitas, dan harga, biasanya:
• Biasanya menggunakan I125 • Horseradish peroksidase (banyak digunakan,
• Radioaktivitas besar → substansi pasien kecil highest turnover, sangat sensitive, gampang
dideteksi)
• Glucose-6-phosphate dehydrogenase
• Alkaline phosphate (banyak digunakan,
highest turnover, sangat sensitive, gampang
dideteksi)
• B-D-galactosidase
Heterogeneous EIA
• Kompetitif: sama metodenya kaya yg udah
dijelasin di atas, label nya pake enzim, ch:
mengukur insulin dan estrogen
• Nonkompetitif: ELISA, reagen yang sudah di
label enzim tidak langsung berpartisipasi
pada saat reaksi awaol Ab-Ag. Keuntungan:
IMMUNORADIOMETRIC ASSAY (IRMA) sensitive dan spesifik, simple, murah. Contoh
• Berisi Ab yang dilabel dan Ag pasien solid phase: microtiter plates, nitrocellulose
• Teknik pencuciannya tidak dipisahkan membrane, megnatic beads. Prosedur: Ag
tetapi Ab yang berlebih akan menempel di terikat di solid phase → tambahkan sampel
solid phase pasien, Ab akan terikat jika ada → cuci →
Kelebihan: tambahkan Ab yang di label enzim → cuci
• Senstiif dan presisi → tambahkan subsstrat → ukur enzim label
• Deteksi dalam jumlah sampel kecil
•