PRAKTIKUM VI

SPEKTROFOTOMETRI CAHAYA
TAMPAK

Penetapan Kadar Sulfametoksazol dalam Tablet

Kotrimoksazol secara Spektrofotometri Cahaya Tampak
dengan Pereaksi Diazotasi Kopling

LABORATORIUM ANALISIS FARMASI I

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA 2020
 PENDAHULUAN
Spektrofotometri
adalah metode analisis instrumental yang didasarkan atas
pengukuran intensitas cahaya pada panjang gelombang yang
hampir monokromatis, setelah berinteraksi dengan zat uji.

Cahaya monokromatis
Cahaya dengan panjang gelombang tunggal.

Cahaya polikromatis
Cahaya dengan panjang gelombang campuran.

Pengukuran serapan larutan zat pada panjang gelombang serapan

maksimum
Daerah UV : panjang gelombang 190 nm – 380 nm
Daerah cahaya tampak (visible) : panjang gelombang 380 nm – 780 nm
 Kromofor, auksokrom dan transisi elektronik
KROMOFOR :
adalah gugus fungsional dari molekul yang mengabsorbsi cahaya dan
mengandung satu atau lebih ikatan rangkap
contoh : benzen atau Gugus kovalen tidak jenuh yang menyebabkan
terjadinya serapan elektronik  -C=C , C = O , N=N , N=O

AUKSOKROM :
adalah gugus fungsional yang tidak mampu menyerap cahaya,tapi dapat
merubah intensitas serapan, menggeser λ maks dari gugus kromofor suatu
molekul
contoh :-OH , -NH2 , –Cl, -OCH3 atau gugus fungsional jnuh yang terikat pada
kromofor dan menyebabkan perubahan intensitas serapan maupun λmaks.

Gugus auksokrom sendiri tidak menyerap cahaya.

 APLIKASI
• Analisis Kualitatif
• Analisis Kuantitatif
 ANALISIS KUALITATIF
Dasar analisis kualitatif:
- Eksitasi elektron dari level energi dasar
ke level energi yang lebih tinggi.
- Energi foton (hv) harus sesuai dengan ∆E

Parameter yang digunakan untuk analisis kualitatif:

1. Spektrum serapan  profil dan λmaks
2. Harga: A(1%,1cm), a, ε
3. Serapan relatif
4. Titik isosbestik
 ANALISIS KUANTITATIF
Dasar Analisis Kuantitatif Hukum Beer

Hukum Beer (Bouguer’s-Beer, Lambert –

Beer )
Besarnya serapan dari larutan suatu zat berbanding
lurus dengan tebal larutan dan konsentrasinya.

A = abc
A = serapan
a = daya serap (absorptivity)
b = tebal larutan, cm (Bouguer 1729, Lambert 1768)
c = konsentrasi, g/L (Beer 1859)
 Hukum Beer dapat ditulis dengan 3 cara:

1. A = abc c = konsentrasi, g/L

a = daya serap

2. A = (A1%,1cm)bc c = konsentrasi, %
A1%,1cm = daya serap jenis

3. A = Єbc c = konsentrasi, molar (M)

Є= daya serap molar

A = serapan
b = tebal larutan, cm
* Analisis kuantitatif.
1. Analisis zat tunggal
- Perbandingan langsung respon uji
dengan respon baku pembanding
- A(1%,1cm), a, ε
- kurva baku

2. Analisis campuran 2 komponen

- Serapan individu
- simultan
- derivatif
- differensial
- pengamatan 3 panjang gelombang
ANALISIS ZAT TUNGGAL DALAM SAMPEL

1. Perbandingan langsung respon uji dengan respon baku pembanding

Cu = Au x Cbp
Abp

Kadar (%) = Cu x v x fp x 100%

Wu

Keterangan:
Cu = Konsentrasi Uji (ug/mL) Cbp = Konsentrasi Baku
Pembanding (ug/mL)
Au = Serapan Uji Abp = Serapan Baku
Pembanding
Wu = Bobot sampel (ug)
v = volume akhir (mL)
fp = faktor pengenceran
Kadar (%) dikalikan BR/ Etiket jika suatu bentuk sediaan
• Jika pengenceran Larutan BP dan Uji
sama maka perhitungan kadar dapat
ditentukan sbb:

• Kadar (%) = Au x Wbp x 100%

Abp Wu
2. Menggunakan serapan jenis
• A (1%, 1 cm) → serapan larutan zat dengan kosentrasi 1%
dan tebal larutan 1 cm

Au= A(1%, 1 cm) x b x Cu  b=1  Cu (%) = Au/A(1%, 1 cm)

c a % =         3   100%

Keterangan:
• Au : serapan uji
• A(1%, 1 cm) : serapan jenis : A (1%,1cm)
• Cu : Konsentrasi Uji (g/100mL)
• v : volume pengenceran akhir (mL)
• fp : faktor pengenceran
• Wu : bobot zat uji (g)
3. Kurva baku
• Dibuat satu seri larutan baku dengan konsentrasi yang
berbeda, kemudian diukur serapannya.
• Secara teoritis, hubungan antara konsentrasi (x) dan
serapan (y) adalah linier → koefisien korelasi (r) mendekati
1.
• Hasil pengukuran serapan sampel (y) dimasukkan ke
persamaan : y= a+bx  Au= a+bCu
 jika serapan uji diketahui maka Cu dapat dihitung
Abp c a % =         3   100%
Keterangan:
Au : serapan uji
a : intersep
b : slope
Cu : Konsentrasi Uji (ug/mL)
a v : volume pengenceran akhir (mL)
fp : faktor pengenceran
Cbp (ug/mL) Wu : bobot zat uji (ug)
• Untuk dapat menentukan konsentrasi sebagai acuan
digunakan serapan jenis untuk menghitung
konsentrasi yang diharapkan
• Misal : A(1%,1cm) = 600
• Konsentrasi larutan 1% → A = +- 600
• Untuk memperoleh serapan A = 0,6 dibuat larutan
0,6
dengan konsentrasi:  1% = 0,001%
600
• Konsentrasi larutan dapat dinyatakan dalam ppm
(part per million) atau bpj (bagian per juta)
• 1 bpj = 1 g / 1000000 mL
= 1000 mg /1000000 mL
= 1000 mg/1000 L
= 1 mg/ 1L
= 1000 ug /1000mL
= 1ug/1mL
• Contoh: konsentrasi larutan X = 0,001%
= 0,001 g / 100 mL
= 1 mg / 100
mL
= 10 bpj
• Cara membuat Larutan:
– Timbang ±10 mg
– Tambahkan pelarut ad 10,0 mL (1000 bpj)
– Pipet 1 mL dan tambahkan pelarut ad 10,0 mL (100
bpj)
– Pipet 1 mL dan tambahkan pelarut ad 10,0 mL (10
bpj)

• Jadi bila diketahui A (1%, 1cm) suatu zat X = 600,

maka serapan zat X tersebut pada konsentrasi 10
bpj adalah 0,600.
 Perhatian!
• Sampel harus dalam bentuk larutan jernih  Saring
• Untuk koreksi serapan dari pelarut atau pereaksi gunakan
blangko sehingga pada panjang gelobang pengukuran
mempunyai serapan 0 (nol)
• Cara memegang kuvet dan cara memasukkan larutan ke dalam
kuvet
• Larutan dalam kuvet harus bebas gelembung udara
• Larutan uji dan larutan baku dibuat konsentrasi tertentu sehingga
memberikan serapan A=0,2-0,8
• Jika menggunakan perbandingan langsung, serapan Uji dan BP
diupayakan memiliki nilai yang tdk jauh berbeda
• Pereaksi Bratton Marshal dan hsl Rx Diazotasi-kopling
--> dihindarkan dr pengaruh cahaya
--> di simpan dlm botol coklat I
I0
1. Jelaskan karakteristik sampel yang dapat dianalisis
secara spektrofotometri UV-Vis?
2. Jelaskan aplikasi metode spektrofotometri dalam
analisis bahan maupun sediaan obat?
3. Jelaskan cara menentukan kadar obat berdasarkan
Hukum Beer!
4. Jika diketahui A(1%,1cm) = 600, berapakah konsentrasi
(bpj) larutan uji yang harus dibuat agar serapan uji 0,3?
Jelaskan pula cara menyiapkan larutan tersebut!
5. Apakah hal-hal yang harus diperhatikan ketika
melakukan preparasi larutan uji, larutan baku, dan
larutan blangko?
 SPEKTROFOTOMETRI CAHAYA TAMPAK
(Kolorimetri)

adalah salah satu teknik analisis spektrofotometri yang

memakai sumber radiasi elektromagnetik cahaya
tampak ( 380 – 780 nm ) dengan memakai instrumen
spektrofotometer

Sampel:
1. Senyawa berwarna
2. Senyawa tidak berwarna diderivatisasi menjadi
senyawa berwarna
 Panjang Gelombang Visibel & Warna Komplementer

Warna
Warna
λ nm Komplementer
(yang diserap)
(yang diobservasi)

400-435 Violet Hijau kekuningan

435-480 Biru Kuning
480-490 Biru kehijauan Jingga
490-500 Hijau kebiruan Red
500-560 Hijau Ungu
560-580 Hijau kekuningan Violet
580-595 Kuning Biru
595-610 Jingga Biru kehijauan
610-750 Merah Hijau kebiruan
1. Apakah Kolorimetri hanya dapat diaplikasikan
untuk senyawa berwarna? Jelaskan!
2. Jika larutan uji berwarna pink ungu jelaskan
panjang gelombang berapa kira-kira yang harus
anda gunakan pada spektrofotometer Vis?

I
I0
 Penetapan Kadar Sulfametoksazol dalam Tablet
Kotrimoksazol
PRODUK TABLET:

• Tablet kotrimoksazol
Tiap tablet mengandung 400 mg sulfametoksazol dan 80 mg trimethoprim
Bobot rata-rata tablet : 600 mg
 
• Tablet kotrimoksazol forte
Tiap tablet mengandung 800 mg sulfametoksazol dan 160 mg trimethoprim
Bobot rata-rata tablet : 1200 mg
 
• Tablet kotrimoksazol pediatrick
Tiap tablet mengandung 100 mg sulfametoksazol dan 20 mg trimethoprim
Bobot rata-rata tablet : 150 mg
Penetapan Kadar Sulfametoksazol dalam Tablet
Kotrimoksazol secara Spektrofotometri Cahaya
Tampak
dengan Pereaksi Diazotasi Kopling
• PRINSIP PK
Sulfametoksazol bereaksi dengan asam nitrit dalam suasana asam
membentuk garam diazonium. Kelebihan asam nitrit dihilangkan
dengan asam sulfamat. Garam diazonium bereaksi kopling dengan
Bratton Marshall Reagent membentuk warna merah muda yang
diukur pada panjang gelombang 536nm
• REAKSI

+ 
 Method A
• Pustaka:
Sharma et al. , Development and Validation of Spectrophotometric Methods for Estimating
Sulfamethoxazole in Pharmaceutical Preparations , International Journal of Pharmaceutical
Sciences and Drug Research 2010; 2(3): 204-209
• Standard Stock Solution:
About 100 mg of Sulfamethoxazole weighed accurately and dissolved in 30 ml of 2 mol L -1
hydrochloric acid in a 100 ml volumetric flask and diluted up to the mark with water (1000
μg ml-1). The final concentration of Sulfamethoxazole was brought to 100 μg ml-1 with water.
• Sample Stock Solution:
20 tablets each containing 800 mg and 400 mg Sulfamethoxazole are taken and average
weight was calculated, tablets were cursed thoroughly in a mortar. Tablets powder
equivalent to 100 mg of the drug weighed accurately and dissolved in 30 ml of 2 mol L-1
hydrochloric acid in a 100 ml volumetric flask and allowed to sonicate with intermittent
shaking for 10 min, cooled and diluted up to the mark with water (1000 μg ml-1 ). The
solutions were filtered through Whatman filter paper No. 41 and the final concentration of
Sulfamethoxazole was brought to 100 μg ml-1 with water.
• For Method A aliquots of Sulfamethoxazole ranging from 0.4-1.2 ml (100 μg ml-1) were
transferred into a series of 10 ml volumetric flasks. To each flask 1 ml of ice cold sodium
nitrite (0.1% w/v) and 1 ml of 2 mol L-1 hydrochloric acid were added at room temperature.
After 5 min, 1 ml of sulphamic acid (0.2% w/v) and 1 ml of Bratton Marshall Reagent were
added. The volumes were made up to the mark with distilled water. The absorbance of a
pink-coloured chromogen was measured at 536 nm against a reagent blank. The amount
of Sulfamethoxazole present in the sample was computed from calibration curve.
• Bratton Marshall Reagent  N-1-Naphthyl ethylene diamine dihydrochloride 0.2% w/v
 1. Jelaskan prinsip PK Sulfametoksazol dalam
Tablet Kotrimoksazol secara Spektrofotometri
Cahaya Tampak dengan Pereaksi Diazotasi
Kopling! Tuliskan Reaksi yang terjadi!
2. Mengapa sulfametoksazol dapat membentuk
garam diazonium dengan asam nitrit?
3. Bagaimana cara menghilangkan kelebihan asam
nitrit pada reaksi diazotasi-kopling?
4. Apa yang dimaksud dengan Bratton Marshall
Reagent ? Bagaimana cara membuatnya*?

*Bratton AC and Marshall EK Jr: A new coupling component for

sulfanilamide determination. J. Biol. Chem. 128 (2), 1939, p544
 Prosedur Pustaka
• Penentuan dengan Kurva Baku
• Larutan Baku Pembanding
Timbang saksama lebih kurang 100mg sulfametoksazol masukan ke dalam labu
tentukur 100mL dan larutkan dalam 30mL HCl 2M, kemudian ditambah air hingga
tanda. Kemudian larutan diencerkan hingga diperoleh konsentrasi 100bpj.
• Larutan Sampel
Tentukan bobot rata2 dari 20 tablet yang mengandung 800 atau 400mg
sulfametoksazol tiap tablet. Serbukkan 20 tablet tersebut. Timbang saksama serbuk
tablet yang setara dengan 100mg sulfametoksazol dan larutkan dalam 30 mL asam
klorida 2M di dalam labu tentukur 100mL. Sonikasi selama 10 menit dengan kekuatan
sedang, dinginkan dan encerkan dengan air hingga tanda. Saring larutan dengan
kertas saring Whatman No. 41. Encerkan larutan hingga diperoleh konsentrasi 100bpj.
• Pipet larutan 0,4-1,2mL, masing-masing masukan ke dalam labu tentukur 10mL.
Tambah masing-masing 1mL natrium nitrit 1% dingin dan 1 mL HCl 2M pada suhu
kamar. Diamkan 5 menit, lalu tambah 1 mL asam sulfamat 0,2% dan 1 mL Pereaksi
Bratton Marshall 0,2 % . Encerkan dengan air hingga tanda. Ukur serapan larutan
merah muda yang terbentuk pada panjang gelombang 536nm.
• Buat larutan blangko.
 Prosedur Laboratorium  Etiket Sulfametoksazol 400mg, BR 600mg

• Penentuan kadar dengan A(1%,1cm) ( diketahui Є 5, 06182.104) dan dengan

perbandingan langsung
• Larutan Baku Pembanding
Timbang saksama lebih kurang 10mg sulfametoksazol masukan ke dalam labu
tentukur 100mL dan larutkan dalam 3mL HCl 2M, kemudian ditambah air hingga tanda.
Kemudian larutan dipipet 1 mL dan encerkan dengan air hingga 25,0 mL (konsentrasi
40bpj)
• Larutan Sampel
Tentukan bobot rata2 dari 20 tablet yang mengandung 400mg sulfametoksazol tiap
tablet. Serbukkan 20 tablet tersebut. Timbang saksama serbuk tablet yang setara
dengan 10mg sulfametoksazol dan larutkan dalam 3 mL asam klorida 2M di dalam
labu tentukur 10mL. Sonikasi selama 10 menit dengan kekuatan sedang, dinginkan
dan encerkan dengan air hingga tanda. Saring larutan dengan kertas saring Whatman
No. 41. Kemudian larutan dipipet 1 mL dan encerkan dengan air hingga 25,0 mL
(konsentrasi 40bpj)
• Pipet larutan BP dan sampel 1mL, masing-masing masukan ke dalam labu tentukur
10mL. Tambah masing-masing 1mL natrium nitrit 1% dingin dan 1 mL HCl 2M pada
suhu kamar. Diamkan 5 menit, lalu tambah 1 mL asam sulfamat 0,2% dan 1 mL
Pereaksi Bratton Marshall 0,2 % . Encerkan dengan air hingga tanda. Ukur serapan
larutan merah muda yang terbentuk pada panjang gelombang 536nm setelah
didiamkan 10 menit
• Buat larutan blangko
 Sulfametoksaz
ol 400mg
Wu??? BR 600mg
±10,0mg Serbuk Tablet ~
Sulfametoksaz ±10,0mg AIR
ol BP sulfametoksazol
Larutkan 3mL HCl 2M Larutkan 3mL HCl 2M
Encerkan dengan air Sonikasi kekuatan sedang 10
hingga 10,0mL men
Dinginkan, Encerkan dengan air
Larutan
hingga 10,0mL
Sulfametoksazol Saring dengan kertas saring
BP Larutan Whatman No. 41
Sampel
1000bpj Sulfametoksazol
Encerkan 25 kali
dengan air 1000bpj
Larutan Encerkan 25 kali dengan air
Sulfametoksazol BP Larutan Sampel
40bpj Sulfametoksazol 40bpj
Pipet 1mL Larutan BP, Uji dan Blangko,
Tambah 1mL natrium nitrit 1% dingin
Tambah 1 mL HCl 2M pada suhu kamar,
Diamkan 5 menit,
Tambah 1 mL asam sulfamat 0,2%
1 mL Pereaksi Bratton Marshall 0,2 %
Encerkan dengan air hingga 10,0 mL, Diamkan 10
menit dihindarkan dari cahaya
Ukur serapan larutan pada panjang gelombang
Serapan 536nm.
1. Apakah larutan Blangko harus selalu ada dalam analisis
dengan spektrofotometri UV-Vis? Jelaskan!
2. Hitung bobot sampel yang harus ditimbang jika Etiket
tiap tablet (BR 600mg) mengandung 400mg
sulfametoksazol dan Tuliskan prosedur PK
sulfametoksazol dalam tablet yang Anda dapat lakukan
di Lab Anfar FFUP dengan mengacu prosedur dari
Sharma et al. (2010) ! Perhatikan konsep efektif dan
efisien!
3. Jelaskan cara menghitung kadarnya dengan
perbandingan langsung!
4. Berdasarkan Sharma et al. (2010) diketahui bahwa Є 5,
06182.104 , Tentukan berapakah daya serap jenisnya!
Diketahui BM sulfametoksazol=253,3 g/mol, BM
pereaksi Bratton Marshall = 259.17 g/mol.  BM
senyawa Azo??
 Perhitungan Kadar dengan
Daya Serap Jenis
• Daya serap Jenis  A(1%,1cm) =A/bc (%)
• Daya serap Serap Molar  Є 5, 06182.104  BM = 451,47 g/mol
Є= A/bc (M)
• Maka: A(1%,1cm) =A/bc (%)
Є A/bc (M)
A(1%,1cm) =c (M) xЄ
c (%)
• C=1%  1g/100mL = 1g/451,47 g/mol dalam 100mL =
0,002215mol/100mL
= 0,02215M
• Maka A(1%,1cm) =0,02215 x5,06182.104 = 1121,2
1
• Au = (A1%,1cm)bCu  Cu = Au/1121,2
c a % =         3   100%

= Au/1121,2 g/100mL x 10 mLx 25/1 x 10/1 x BR mg x 100%

Wu g E mg
 Perhitungan kadar dengan Perbandingan
Langsung

Cu = Au x Cbp
Abp

Kadar (%) = Cu x v x fp x 100%

Wu

= Cu ug/mL x 10 mLx 25/1 x 10/1 x BR mg x 100%

Wu ug E mg