LAPORAN MAKALAH KIMIA INSTRUMEN

Penentuan Kadar Paracetamol Dan Kafein Metode

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kelompok 5
KIMIA INSTRUMEN
Danty, S.Pd

Fadila Dwi. R (101816869)

Irma Ayu. S (101816916)

Maitsa Luthfiyyah (101816954)

Muzhaffar Ghani. T (101817006)

Ravialam Taufik (101817053)

Reva Fatimah. A (101817062)

Zahra Farida R (101817147)

 I. Tujuan Praktikum
 Memahami cara kerja instrument HPLC

 Melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian instrument HPLC

 Menentukan/menghitung kadar Parasetamol dan Kafein dengan menggunakan High

Peformance Liquid Chromatography (HPLC)

II. Dasar Teori

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah metoda kromatografi cair bertekanan
tinggi. HPLC sangat berguna untuk analisis kimia secara kualitatif dan kuantitatif senyawa
organic atau anorganik yang berkadar sangat kecil, dalam skala ng/L. juga metoda ini hanya
memerlukan jumlah cuplikan yang sangat kecil(ml). oleh karena itu HPLC, misalnya dapat
digunakan dalam analisis cuplikan Kimia Lingkungan, Farmasi, atau kedokteran. (Tim Dosen
Kimia Instrumen.2001:1)

Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/ area standar. Pada prakteknya teknik
perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu konsentrasi
standar. Oleh karena itu, lebih akurat dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.

Prinsip kerja HPLC adalah berdasarkan distribusi differensial komponen di antara dua fasa yang
disebabkan oleh perbedaan kepolaran.

Prinsip kerja alat instrument HPLC adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa, fasa gerak
cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen komponen campuran. Karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solute terhadap fasa diam. Solute solute yang kurang
kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-salute
yang kuat interaksinya dengan fasa diam maka solute-solute tersebut akan keluar dari kolom
lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram GC,
jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC.
Gambar skema instrument HPLC:

Terdapat dua perbedaan dalam HPLC berdasarkan polaritas dari pelarut dan interaksi terhadap
fasa diamnya.

1) Fasa normal HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat lebih polar daripada pelarutnya.

2) Fasa balik HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat non-polar dibandingkan dengan
pelarutnya.

Jenis retensi solute merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahan senyawa bergantung pada
jenis dan kekuatan interaksi solute dengan fasa diam. Mekanisme retensi dapat dikelompokan
menjadi 5 kategori :

1) Kromatografi Adsorbsi

2) Kromatografi Partisi

3) Kromatografi Fasa terikat

4) Kromatografi Penukar Ion

5) Kromatografi eksklusi ukuran

Adapun Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC:

1. Fasa gerak

Dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju
detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute - solute. Oleh karena itu, fasa gerak dalam
HPLC merupakan salah satu factor penentu keberhasilan proses pemisahan.

a. Persyaratan fasa gerak HPLC

1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang dianalisis.

2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram.

3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan dalam kolom

4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun

5) Zat cair tidak kental

6) Fasa gerak harus sesuai dengan detector

2. Pompa

Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi
serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan:

1) Menghasilkan tekanan sampai 600 psi

2) Kecepatan alir berkisar 0,1-10 mL/menit

3) Bahan tahan korosi

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa
yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan
pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran
yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
 Gambar : Pompa HPLC

3. Injektor

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum
dari material kolom.

4. Kolom

Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas
berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi
komponen-komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk
analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom
ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector.
Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan
yang sesuai.

5. Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel didalam kolom (amalisis
kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan
memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan
fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT yang
umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan
untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga
digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika
dibandingkan dengan detektor UV.
6. Rekorder

Berfungsi menampilkan hasil dari pemisahan kromatografi. Kromatogram berupa waktu retensi
(sumbu x) dan intensitas penyerapan (sumbu y). Hal ini dapat digunakan untuk analisis kualitatif
suatu komponen. Area puncak setara dengan konsentrasi sehingga dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif.

Hasil kromatogram akan kurang baik dikarenakan adanya pelebaran puncak Pelebaran yang
terjadi dapat disebabkan oleh tiga faktor yaitu:

a. Difusi Eddy

Difusi Eddy terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke detektor yang
menyebabkan puncak kromatogram melebar. Hal ini disebabkan karena terdapat
perbedaan ukuran partikel penyusun kolom yang tidak merata

b. Transfer massa

Transfer massa terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke detektor yang
menyebabkan puncak kromatogram melebar.

c. Difusilongitudinal

Difusi longitudinal terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke detektor

yang menyebabkan puncak kromatogram melebar

Pelarut dalam HPLC diantaranya n-heksana, sikloheksana, tetraklorometana, metilbenzena,

isopropanol, etanol, methanol, asam etanoat, dan air. Sementara fasa diam dalam HPLC
diantaranya oktilsilika, propilsilika, aminopropil, asam sulfonat, dan amina kuartener. (al-
anshory 2007:2-6)

Parasetamol dan kafein umumnya terdapat bersama-sama dalam satu tablet obat yang memiliki
sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan dapat menyerap sinar
UV. (Tim Dosen Kimia Instrumen 2011:17) Parasetamol berwujud serbuk hablur berwarna putih
tidak berbau dan sedikit pahit. Mengenai kelarutannya parasetamol larut dalam air mendidih dan
dalam NaOH IN, mudah larut dalam etanol, memiliki rumus empiris C.H.NO
III. Alat Dan Bahan
 Alat :  Bahan

1) Perangkat HPLC 1) Paracetamol p.a

2) Labu ukur 10mL, dan 50mL 2) Kafein

3) Corong pendek 3) Asetonitril,

KH2PO4, Isopropil
4) Penyangga corong Alkohol
5) Botol vial 4) Sampel Obat
6) Pipet Volume 5) Aqua bidest
7) Pipet Volume 6) Methanol
8) Pipet Volume

9) Pipet Volume

10) Pipet Volume

11) Pipet Volume

12) Syringe Membrane Selulosa Nitrate

13) Ultrasonic Vibrator

14) Gelas Kimia

15) Kertas Saring

IV. Langkah Kerja

 Pembuatan fasa gerak

1) KH2PO4 0,1M diambil sebanyak 420 ml

2) Ditambahkan 20 ml methanol

3) Ditambahkan 30 ml asetonitril

4) Ditambahkan 30 ml isopropil alcohol

5) Disaring menggunakan membrane whatman filter PTFE 0,2 μm

 6) Disonikasi selama 30 menit

 Pembuatan larutan induk parasetamol

1) Paracetamol p.a ditimbang sebanyak 25 mg

2) Dimasukan ke dalam labu 50 ml

3) Ditambahkan pelarut sebanyak 20 ml

4) Disonikasi selama 15 menit

5) Diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas

6) Disaring dengan membran lalu disonikasi

7) Dihitung konsentrasi larutan induk

 Pembuatan larutan induk kafein

1) Kafein p.a ditimbang sebanyak 12.5 mg

2) Dimasukan ke dalam labu 50 ml

3) Ditambahkan pelarut sebanyak 20 ml

4) Disonikasi selama 15 menit

5) Diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas

6) Disaring dengan membran lalu disonikasi

7) Dihitung konsentrasi larutan induk

 Pembuatan deret larutan standar

1) Larutan induk Paracetamol dan kafein dipipet masing masing sebanyak 1,2,3,4,5
dan 6 ml kedalam labu ukur 10 ml

2) Ditambahkan pelarut hingga tanda batas

3) Disaring masing masing dengan membrane whatman PTFE 0,2 μm

4) Dipindahkan ke botol vial lalu disonikasi selama 5 menit

5) Diinjeksikan ke sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 μL

6) Dibuat kurva kalibrasi

 Pembuatan larutan sampel paracetamol

1) Tablet obat ditimbang 20 tablet dan Tentukan berat rata-rata tablet

2) Digerus tablet dengan lumping dan Alu

3) Serbuk obat diambil 25 mg

4) Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml

5) Ditambahkan 1 ml pelarut

6) Disonikasi selama 10 menit

7) Diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas

8) Dikocok dan disaring melalui penyaringan kering

9) Setelah disaring dipipet 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml

10) Ditambahkan pelarut hingga tanda batas

11) Disaring dengan membran whatman PTFE 0,2 μm

12) Disonikasi selama 5 menit lalu diinjeksikan ke dalam sistem HPLC

V. Data Pengamatan

Langkah Kerja Pengamatan

1) Pembuatan fasa gerak → Fasa gerak telah tersedia di
KH2PO4 0,1 M laboratorium, zat cair tidak

 Diambil sebanyak 420 mL berwarna

 Ditambahkan 20,00 mL methanol → Volume fasa gerak yang

 Ditambahkan 30,00 mL asetonitril digunakan 110 mL

 Ditambahakan 30,00 mL isopropil
alcohol
 Disaring menggunakan membrane
whatman filter PTFE 0,2 µm
 Disonikasi selama 30 menit
Hasil
2) Pembuatan larutan Induk parasetamol
Parasetamol p.a
 Ditimbang 25 mg
Kafein p.a
 Ditimbang 12,5 mg
Parasetamol 25 mg dan kafein 12,5 mg
 Dimasukkan ke dalam labu 50 mL
 Ditambahkan pelarut sebanyak 20 mL
 Disonikasi selama 15 menit
 Diencerkan dengan pelarut hingga
tanda batas
 Disaring dengan membran
 Disonikasi
→ Parasetamol yang
ditimbang 25 mg
→ Parasetamol berupa serbuk
putih
→ Kafein yang ditimbang
12,7 mg
→ Kafein berupa serbuk putih
→ pelarut yang digunakan
sebanyak 50 mL dan
disonikasi selama 1 menit
sebelum tanda batas.
→ setelah tanda batas
disonikasi kembali selama 5
menit
→ Didapatkan Konsentrasi
larutan induk
Parasetamol : 500 ppm
Kafein : 254 ppm
→ Larutan Induk : tidak
berwarna
  Dihitung konsentrasi larutan induk
untuk parasetamol dan kafein
Hasil

3) Pembuatan deret larutan standar parasetamol

Larutan induk parasetamol dan kafein
 Dipipet masing-masing sebanyak
1,2,3,4,5 dan 6 mL ke dalam labu
ukur 10 mL
 Ditambahkan pelarut hingga tanda
batas
 Disaring masing-masing dengan
membrane whatman PTFE 0,2 µm → Larutan tidak dipindahkan
ke botol vial
 Dipindahlan ke botol vial
Larutan dalam botol vial
 Disonikasi selama 5 menit
→ Kurva kalibrasi ada dalam
 Diinjeksikan ke system HPLC dengan
data pengamatan
volume penyuntikan 20 µL
 Dibuat kurva kalibrasi
Hasil

4)Pembuatan larutan sampel parasetamol

Tablet obat
→ Sampel yang digunakan :
 Ditimbang 20 tablet dan ditentukan
Panadol Extra ( Serbuk putih )
berat rata-rata tablet
6,00 mg
 Digerus tablet dengan lumping dan
→ Berat rerata sampel
alu
Panadol : 0,69652 mg
Serbuk obat
→ Berat rerata sampel
 Diambil sejumlah 25 mg Bodrex: 0,84019 mg
 Dimasukkan ke dalam labu ukur25mL
  Ditambahakn 1 mL pelarut → Kandungan Sampel
 Disonikasi selama 10 menit Panadol Extra dalam
Serbuk obat yang telah disonikasi kemasan:

 Diencerkan dengan pelarut hingga Parasetamol : 500 mg

garis tanda Kafein : 65 mg

 Dikocok dan disaring melalui → Kandungan Sampel

penyaringan kering ( 1 mL filtrat Bodrex dalam kemasan :

pertama dibuang dan filtrate Parasetamol : 600 mg

selanjutnya ditampung) Kafein : 50 mg

Sampel obat yang telah disaring

→ Labu ukur yang digunakan
 Dipipet 1 mL dan dimasukkan ke
10 mL
dalam labu ukur 10 mL
→ Sonikasi dilakukan 5 menit
 Ditambahakn pelarut hingga garis
sebelum
tanda
→ Pelarut yang digunakan
 Disaring dengan membrane whatman
Aqua bides
PTFE 0,2 µm
→ Penyaringan menggunakan
 Disonikasi selama 5 menit
selulosa nitrat 0,45 μm
 Diinjeksikan ke dalam sistem HPLC
→ Injeksi yang digunakan
Hasil
berukuran 25 µL
→ Larutan sampel tak
5)Penyiapan instrument HPLC
berwarna
Instrumen HPLC
 Dipastikan kabel penghubung listrik
tersambung dengan benar
 Ditekan tombol ON pada sakelar
listrik
 Botol fasa gerak diisi dengan volume
yang memadai, dan botol penampung
dikosongkan
 Tombol ON pada alat ditekan
 berturut-turut untuk power, detector
dan pompa
 Dilakukan pemprograman oleh alat
computer, diikuti langkahnya sesuai
intruksi
 Dipilih mode yang sesuai dengan
parameter kondisi instrument
 Dialirkan fasa gerak
(instrument siap digunakan bila respon kromatogram
tidak muncul lagi (baseline mendatar)
 Larutan standar diinjeksikan berturut-
turut (mulai dari konsentrasi terendah)
kemudian larutan sampel)
 Dicetak hasil pengukuran, kondisi
percobaan dicatat
 Pompa dimatikan dengan menyoroti
tanda pompa dalam computer setelah
selesai
 File ditutup sesuai petunjuk, computer
dimatikan
 Tekan tombol off pada
pompa,detector dan power secara
berurutan
 Sambungan listrik diputuskan
 Hasil
Keterangan :
Fasa Gerak : KH2PO4 0,01 M, 20 mL
methanol, 30 mL asetonitril dan 30 mL
isopropil alcohol
Kolom (fasa diam) : C-18 (15 cm)
Panjang gelombang : 215 nm
Laju alir : 1 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL

PERHITUNGAN DATA

1) Menetukan Kosentrasi Larutan Induk

a. Parasetamol
Masa Parasetamol Standar = 25 mg

Volume larutan = 50 ml = 0,05 l

ppm = = = 500 ppm

b. Kafein
Massa Kafein Standar = 12,5 mg

Volume Larutan = 50 mL = 0,05 L

ppm = = = 250 ppm

2) Pembuatan Deret Larutan Standar Parasetamol

 100 ppm
C1 x V1 = C2 x V2
500 ppm x V1 = 100 ppm x 10 ml
V1 = 2 ml

 150 ppm
C1 x V1 = C2 x V2
500 ppm x V1 = 150 ppm x 10 ml
V1 = 3 ml
  200 ppm
C1 x V1 = C2 x V2
500 ppm x V1 = 200 ppm x 10 ml
V1 = 4 ml

 250 ppm
C1 x V1 = C2 x V2
500 ppm x V1 = 250 ppm x 10 ml
V1 = 5 ml

 300 ppm
C1 x V1 = C2 x V2
500 ppm x V1 = 300 ppm x 10 ml
V1 = 6 ml

 350 ppm
C1 x V1 = C2 x V2
500 ppm x V1 = 350 ppm x 10 ml
V1 = 7 ml

3) Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein

 50.8 ppm
C1 . V1 = C2 . V2
254ppm . V1 = 50.8 ppm . 10 mL
V1 = 2 mL

 76.2 ppm
C1 . V1 = C2 . V2
254ppm . V1 = 76.2 ppm . 10 mL
V1 = 3 mL

 101,6 ppm
C1 . V1 = C2 . V2
254ppm . V1 = 101.6 ppm . 10 mL
V1 = 4 mL
  127 ppm
C1 . V1 = C2 . V2
254ppm . V1 = 127 ppm . 10 mL
V1 = 5 mL
 152,4 ppm
C1 . V1 = C2 . V2
254ppm . V1 = 152.4 ppm . 10 mL
V1 = 6 mL

 177,8 ppm
C1 . V1 = C2 . V2
254ppm . V1 = 177.8 ppm . 10 mL
V1 = 7 mL

ANALISIS DATA
1) Data Penimbangan Sampel Obat ( Panadol Extra )
m1 = 0,6899 mg m6 = 0,6918 mg
m2 = 0,6989 mg m7 = 0,6985 mg
m3 = 0,7041 mg m8 = 0,7006 mg
m4 = 0,6935 mg m9 = 0,6947 mg
m5 = 0,6948 mg m10 = 0,6984 mg
Massa rerata sampel obat ( panadol extra ) = 0,6952 mg

2) Data Penimbangan Sampel Obat ( Bodrex )

m1 = 0,8331 mg m6 = 0,8315 mg
m2 = 0,8530 mg m7 = 0,8418 mg
m3 = 0,8497 mg m8 = 0,8568 mg
m4 = 0,8326 mg m9 = 0,8312 mg
m5 = 0,8350 mg m10 = 0,8472 mg
Massa rerata sampel obat ( Bodrex ) = 0,8402 mg
3) Tabel Deret Larutan Standar Parasetamol

No Konsentrasi (ppm) Luas Area

1 100 4250914
2 150 6308666
3 200 8440476
4 250 10128325
5 300 12296071
6 350 14466379

Kurva Kalibrasi Parasetamol

16000000
14000000
12000000
10000000
Luas Area

8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 100 200 300 400
Konsentrasi (ppm) y = 40416x + 221617
R² = 0.999

4) Kadar Parasetamol dalam sampel :

Massa Sampel Panadol = 6,00 mg
Luas Area Parasetamol = 12755224

=
 Massa parasetamol dalam 6,00 mg panadol ( 10 mL )
Luas Area Parasetamol = 3948526

*x : Parasetamol
Kadar Parasetamol dalam 6,00 mg sampel obat Panadol Extra ( 10 mL )

Dalam 10 mL :

Dalam sampel panadol 6,00 mg terdapat Parasetamol sebesar 3,101150 mg

Dalam 1 tablet Parasetamol :

5) Tabel deret Larutan Standar Kafein

No Konsentrasi ( ppm ) Luas Area
1 50,8 4635278
2 76,2 6938088
3 101,6 9285885
4 127 11087295
5 152,4 13272908
6 177,8 15430555
6) Kadar Kafein dalam Sampel
Luas Area Kafein = 3948526
( ) ( )

*ket: x = kafein
Kadar Kafein dalam 6,00 mg sampel obat Panadol Extra ( 10 mL )

Dalam 10 mL :

Dalam sampel obat panadol 6,00 mg terdapat kafein sebesar 0,432736 mg

Dalam 1 tablet kadar kafein :
VI. Pembahasan
1) Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan kadar parasetamol dan kafein dalam
sampel obat dengan instrumen HPLC. Sampel obat yang digunakan adalah jenis obat
sakit kepala yaitu panadol.

2) Adapun prinsip dasar dari HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada
praktikum kali ini adalah adanya perbedaan koefisien distribusi antara komponen fasa
gerak dan fasa diam. Praktikum ini menggunakan HPLC fasa terbalik, karena fasa diam
yang digunakan bersifat nonpolar yaitu C-18 dan fasa gerak gerak yang digunakan
( campuran dari KH2PO4 0,01 M, methanol, asetonitril dan isopropil alkohol) bersifat
polar.

3) Untuk melarutkan parasetamol dan kafein digunakan pelarut, Pelarut yang digunakan
adalah campuran dari KH2PO4 0,01 M, methanol, asetonitril dan isopropil alkohol yang
tidak berwarna. Pelarut yang digunakan dikombinasikan komposisinya bertujuan untuk
memberikan faktor kapasitas yang cocok sehingga faktor human error dapat dihindarkan.

4) Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi persyaratan fasa gerak HPLC yaitu: jernih,
murah, mudah diperoleh, dan tidak kental.

5) Proses degassing dilakukan untuk menghomogenkan dan menghilangkan gelembung-

gelembung gas pada larutan induk. Karena dengan adanya gas dalam larutan sampel
dapat menghambat pergerakan eluen sehingga terganggunya pemisahan pada kolom
karena larutan sampel tidak merata dan akan menyebabkan terjadinya pelebaran puncak
kromatogram. Selain itu, penghilangan gas ini juga diperlukan untuk menghindari noise
pada detektor terutama fase organik berair.

6) Pembuatan larutan standar dilakukan untuk menentukan kurva kalibrasi parasetamol.

Kurva kalibrasi dibuat sebagai pembanding. Variasi konsentrasi yang digunakan untuk
parasetamol secara berturut-turut adalah 100 : 150 : 200 : 250 : 300 dan 350 ppm.
Sementara untuk standar kafein berturut turut adalah 50,8 : 76,2 : 101,6 : 127 : 152,4 dan
177,8 ppm. Pembuatan larutan standar tersebut dilakukan secara kuantitatif. Oleh karena
itu, penimbangan larutan baku parasetamol harus tepat, pemipetan larutan induk harus
tepat, pengenceran larutan baku menjadi larutan standar harus pas sampai tanda batas.

7) Pembuatan masing masing konsentrasi dan pelabelan harus dilakukan secara teliti untuk
mencegah terjadinya kekeliruan. Larutan standar diinjeksikan secara berurutan dari
konsentrasi terendah sampai konsentrasi tertinggi. Dalam membuat larutan sampel
sampel obat ditimbang dalam 10 kali penimbangan per tablet dan dihasilkan rata rata
penimbangan untuk panadol 695,2 mg dan untuk bodrex adalah 840,19 mg. Sampel yang
dianalisis beratnya 6 mg. Pada pembuatan lautan sampel parasetamol, sampel obat yang
 berupa tablet ditimbang satu per satu. Hal ini dilakukan karena massa masing-masing
tablet tidak sama, sehingga digunakan massa rata-rata dari kesepuluh tablet.

8) Pengenceran filtrat dengan aquabides dimaksudkan untuk membuat konsentrasi lebih

kecil lagi dan mudah di analisis karena masih berada di dalam range kurva kalibrasi
larutan standar. untuk membebaskan larutan sampel dari kotoran partikulat maka larutan
standar tersebut disaring dengan selulosa nitrat dan dihomogenkan dengan ultrasonik
vibrator. Digunakan membran selulosa nitrat untuk menyaring karena komponen yang
akan dipisahkan (parasetamol dan kafein) bersifat polar.

9) Alat HPLC diset sesuai dengan kebutuhan pengukuran yaitu dengan panjang gelombang
215 nm, laju alir lmL/menit.Pada saat memasukan larutan standar maupun larutan sampel
tidak terlalu banyak cukup dengan 20 mikoliter, karena jika terlalu banyak dapat
menyebabkan band broadening (pelebaran peak) dan pada saat memasukan cuplikan pada
syringe tidak ada gelembung udara agar menghasilkan pemisahan yang baik.

10) Sebelum digunakan, syringe harus dibilas dengan mengunakan metanol agar terbebas
dari kotoran. Pada proses pemasukan cuplikan kedalam alat HPLC dilakukan dengan
menggunakan alat injeksi syiringe. Syringe disuntikan melaui septum (seal karet),
cuplikan yang masuk kemudian dialirkan oleh fasa gerak dengan bantuan pompa. Dalam
kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solute yang kuat interaksinya dengan
dengan fasa diam akan tertahan. Dalam hal ini parasetamol yang lebih polar
dibandingkan kafein tertahan lebih lama pada fasa diam dalam kolom. Sehingga setelah
keluar kolom akan dideteksi oleh detector yang kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram yang menghasilkan puncak.

11) Kolom yang digunakan dalam percobaan ini adalah kolom yang berisi fasa diam C-18
denagna panjang 15 cm yang bersifat nonpolar dan merupakan hasil reaksi antara silika
dengan alkilklorosilana dimana gugus alkilnya (R) adalah n- oktadesil. Fasa diam
tersebut terikat pada fasa pendukung yaitu silika. Dalam hal ini, fasa diam lebih nonpolar
dari fasa geraknya sehingga mode yang digunakan adalah mode fasa terbalik. HPLC fasa
terbalik ini baik untuk memisahkan campuran komponen-komponen yang bersifat polar
seperti parasetamol dan kafein.

12) Fasa diam yang digunakan dalam HPLC harus tahan terhadap tekanan tinggi, karena
apabila digunakan struktur dengan pori yang besar akan mudah rusak. Hal ini disebabkan
menurunnya permeabilitas akibat tekanan tinggi. Sementara proses elusi yang digunakan
adalah isocratie. Mode isokratik dilakukan pada temperature tetap dan komposisi fasa
geraknya sama selama pengukuran berlangsung yaitu pada suhu 27 C dan laju alir nya 1
mL/menit. Dalam pengelusian, parasetamol terelusi lebih awal dengan waktu retensi
lebih pendek yaitu 2,26 menit dibbandingkan kafein yaitu 2,89 menit.
13) Kepolaran dapat dilihat dari struktur senyawanya dimana parasetamol hanya memilki
satu ikatan CH3 sementara kafein 3 ikatan CH3. Oleh karenanya, senyawa-senyawa
kafein akan menghabiskan dalam kolom lebih lama dan mempunyai waktu retensi yang
besar. Sementara, molekul parasetamol dalam campuran akan menghabiskan waktunya
untuk bergerak bersama dengan pelarut sehingga akan keluar terlebih dahulu dan
mempunyai waktu retensi yang kecil.

14) Detektor yang digunakan pada peralatan HPLC ini adalah spektrofotometer UV, yaitu
karena ada gugus kromofor pada sampel. Analisis; kualitatif dilakukan dengan
membandingkan waktu retensi sampel parasetamol dan kafeinn dengan larutan standar.
Waktu retensi larutan standar untuk parasetamol adalah 2,24 menit sedangkan waktu
retensi sampel adalah 2,26 menit. Sementara waktu retensi larutan standar untuk kafein
adalah 2,86 dan 2,86 menit. Sedangkan waktu retensi pada sampel adalah 2,89 menit.
Analisis kuantitatif dari pengukuran diperoleh dari luas area peak dalam kromatogram
yang memiliki waktu retensi sama.

15) Pengukuran larutan standar dengan meningkatnya konsentrasi diperoleh luas area yang
meningkat pula. Pelebaran puncak kromatogram dapat terjadi karena Adanya difusi Eddy
zat padat di dalam kolom tidak seragam dan kepadatannya tidak merata sehingga
komponen sampel berjalan tidak mulus, panjang jalan yag dilalui sampel tidak merata.
Selain itu, juga bias terjadi transfer massa karena pengaturan laju alir yang tidak tepat
sehingga ada komponen yang tertinggal didalam kolom.

16) Pada percobaan ini, untuk menentukan kadar parsetamol dan kafein dalam sampel obat
diperlukan deret larutan standar parasetamol dan kafein dengan berbagai konsentrasi
untuk membuat kurva kalibrasi. Setelah didapat luas area untuk masing- masing
konsentrasi, dibuat kuva kalibrasi dengan memplotkan konsentrasi terhadap luas area dan
didapat garis lurus. Dari pengolahan data percobaan, diperoleh kadar parasetamol yaitu
sebesar 364,98 mg per tablet panadol dan kadar kafein 50,1355 mg per tablet panadol.
Analis Kesalahan dalam praktikum kali ini adalah.

17) Adanya perubahan tekanan dan suhu saat proses pemisahan HPLC. Adanya perubahan
tekanan dan suhu akan menyebabkan pemisahan tidak berjalan sempurna. Kekurang
telitian yang dilakukan saat pembuatan deret larutan standar. Selain itu, saat
penginjeksian sampel dilakukan secara perlahan. Hal ini tidak boleh dilakukan karena
akan ada tekanan balik dari injektor dan juga saat menginjeksikan harus benar benar
dipastikan tidak ada gelembung yang diakibatkan dari mobilitas partikel yang
menyebabkan pemisahan yang kurang baik.
VII. Kesimpulan
Dari praktikum kali ini untuk menganalisis kadar parasetamol dan kafein dalam sampel
obat sakit kepala (panadol) menggunakan instrumen HPLC didapat kadar parasetamol
dalam sampel obat sebesar 360.0021 mg/tablet sementara kadar kafein sebesar 50.2349
mg/tablet.
 Daftar Pustaka
Al-Anshory, Jamaludin. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung : Universitas Padjadjaran

Budiasih, Endang, dkk. 1999. Analisis Instrumentasi. Malang: Universitas Negeri Malang

Sudjadi dan Rahman, A. 1994. Analisis Obat dan Makanan. Yogyakarta: Pustaka Pelajar

Tim Dosen Kimia Analitik. 2013. Petunjuk Praktikum Kimia Instrumen. Bandung: LKI
Universitas Pendidikan Indonesia