LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DAN ANALISIS FLAVONOID

Dosen Pengampu :

apt. Mamik Ponco Rahayu, M.Si

Disusun Oleh :

1. Riska Istikomah (A03227210)

2. Rista Anggara Wati (A03227211)
3. Rosi Nofrianti (A03227212)
4. Ruliana Wati (A03227213)
5. Rully Mukti N (A03227214)

S1 FARMASI ALIH JENJANG

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SETIA BUDI

SURAKARTA

2022
I. Tujuan

Mahasiswa mampu melakukan isolasi dan analisis senyawa flavonoid

II. Landasan Teori

Flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar yang terdapat

dalam semua tumbuhan berpembuluh. Semuanya mengandung atom karbon dalam

inti dasarnya yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik

yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk

cincin ketiga. Flavonoid dalam tumbuhan umumnya terikat sebagai glikosida, baik

O-glikosida maupun C-glikosid dan dapat sebagai aglikonnya. Isolasi flavonoid

tergantung dari polaritasnya dan hal ini menentukan pelarut yang digunakan.

Polaritas dari flavonoid dipengaruhi oleh subsituen yang mengikat misalnya gula,

hidroksida dan alkil (Harborne 1987; Markham 2018).

Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi dan flouresensinya

dibawah sinar ultraviolet. Pereaksi yang digunakan adalah ammonia dan basa yang

lain akan mempengaruhi gugus fenol yang bersifat asam dan memberikan warna

kuning.

Rutin merupakan glikosida flavonoid yang dapat dijumpai dalam daun

singkong. Titik lebur 90oC dan mudah larut dalam air panas dengan hidrolisis asam

dapat memutuskan ikatan aglikon dengan glikonnya. Sebagai glikonnya adalah

ramnosa dan glukosa, aglikonnya adalah kuersetin. Rutin berbentuk serbuk

berwarna merah,jingga atau kuning.

Kuersetin berbentuk serbuk berwana kuning , dengan kelarutan praktis

tidak larut air, dalam etanol (1:250), dalam etanol 70% (1:285), dalam etanol 30%
 (1:3571), titik lebur >300oC (Anonim, 1983). Kuersetin dapat berefek sebagai

antioksidan, antibakteri, antiedema, antifungi, antiinflamasi, antitumor, antiulser,

antiviral dan lain sebagainya, sehingga senyawa bioaktif kuersetin ini memberikan

harapan sebagai bahan baku obat yang sangat potensial untuk dikembangkan.

Glikosida flavonoid didalam bahan yang diisolasi bersifat polar sehingga

dapat disari dengan air panas dan dikristalkan dengan pendingin, sedangkan

pemisahan aglikon dari glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam.

III. Alat dan Bahan

Alat : - Panci infus - Beaker glass
- Erlenmeyer - Corong pisah
- Gelas ukur - Corong gelas
- Vial - Cawan porselin
- Tabung reaksi - Oven
- Seperangkat alat KLT -Waterbath
- Batang pengaduk

Bahan : - Serbuk daun singkong - Air suling

- Amonia - Methanol
- HCl 2N - Asam asetat 15%
- Natrium sulfat anhidrat - n-butanol
- Pereaksi sitoborat - KMNO4
- Lempeng selulosa - Amil Alkohol
IV. Cara Kerja

A. Analisis golongan flavonoid

1. Siapkan alat dan bahan

2. Timbang 1 g serbuk daun singkong

3. Masukkan 1 g serbuk singkong ke dalam beaker glass tambahkan 50 ml

aquadest didihkan selama 15 menit

4. Kemudian saring campuran menggunakan corong yang dilapisi kertas saring

5. Ambil filtrat sebanyak 5 ml masukkan kedalam tabung reaksi

6. Tambahkan sedikit serbuk magnesium (Mg), 5 tetes asam hidroklorida pekat

(HCl) dan 2 ml amil alkohol

7. Campuran dikocok kuat

8. Amati lapisan amil alcohol

B. Isolasi rutin dari daun singkong

1. Siapkan alat dan bahan

2. Timbang 50 g serbuk singkong

3. Masukkan serbuk singkong kedalam panci dekokta dan tambahkan 500 ml

aquadest

4. Panasakan dekokta hingga suhu 900 C selama 30 menit

5. Saring campuran mrnggunakan corong yang dilapisi kain flanel

6. Selanjutnya lakukan penyaringan kedua menggunakan corong yang dilapisi

kertas saring

7. Pindahkan hasil filtrat ke dalam Erlenmeyer tutup dengan plastik, beri label

dan simpan dalam kulkas selama 1 minggu

8. Filtrat yang sudah di kulkas selama 1 minggu di buang airnya

 9. Timbang kertas saring yang akan digunakan dan catat

10. Kemudian saring kristal yang ada pada Erlenmeyer menggunakan kertas

saring yang sudah ditimbang. Jika kristal masih tersisah pada Erlenmeyer

bilas menggunakan air dingin kemudian saring menggunakan buchner.

11. Keringkan kristal pada suhu 500C

12. Setelah kering kristal ditimbang

13. Ambil sepucuk batang pengaduk kemudian masukkan kedalam tabung reaksi

14. Tambahkan pelarut metanol dan air sama banyaknya 1: 1 yaitu sebanyak 1ml

metanol dan 1 ml aquadest

15. Kemudian kocok hingga homogen

16. Masukan kedalam vial (Sari I)

C. Hidrolisis rutin menjadi glikon dan aglikon

1. Ambil padatan sebanyak 0,1 g masukkan kedalam beaker glass

2. Tambahkan metanol 5 ml kedalam beaker glass

3. Kemudian tambahkan HCl 2 N 10 ml kedalam beaker glass aduk hingga

homogen

4. Masukkan kedalam tabung reaksi kemudian tutup menggunakan kapas basah

5. Kemudian lakukan reflux sederhana selama 1 jam atau hingga berkurang

setengah dari cairannya

6. Kemudian filtrat dimasukkan kedalam corong pisah lalu tambahkan dengan

20 ml eter kemudian kocok

7. Larutan terbagi menjadi 2. Dimana bagian paling bawah adalah air dan yang

atas eter

8. Kemudian pelarut paling bawah (Air asam) dikeluarkan terlebih dahulu

masukan ke dalam beakers glass

 9. Kemudian etter di keluarkan dengan disaring terlebih dahulu dimana pada

kertas saring ditambahkan Na2SO4 sebanyak 1 gram. Agar Na2SO4 dapat

menyerap air pada eter

10. Kemudian masukkan lagi eter kedalam corong pisah tambahkan 20 ml eter

baru kemudian kocok

11. Kemudian pelarut paling bawah (Air asam) dikeluarkan terlebih dahulu

masukan ke dalam beakers glass

12. Kemudian etter di keluarkan dengan disaring terlebih dahulu dimana pada

kertas saring ditambahkan Na2SO4 sebanyak 1 gram dan dijadikan satu

dengan eter sebelumnya

13. Mendapatkan 2 pelarut yaitu gelas 1 berisi eter dan gelas 2 berisi air

14. Uapkan eter diatas waterbath

15. Setelah itu tambahkan 2 ml metanol (Sari II).

16. Uapkan lapisan air asam hasil hidrolisis pada cawan porselin di atas water

bath sehingga cairan tinggal kira-kira 1 ml (Sari III)

D. Analisis hasil isolasi

Kualitatif 1 Fase gerak berair (Polar)

1. Siapkan alat dan bahan

2. Siapkan elusi fase gerak menggunakan asam asetat 15% sebanyak 8 ml

3. Masukkan asam asetat 15% kedalam chamber dan jenuhkan. Masukkan

kertas saring kedalam chamber sebagai penanda bahwa asam asetat jenuh.

Asam asetat dikatakan jenuh apabila pelarut sudah meresap pada kertas

saring hingga atas.

4. Siapkan plat yang sudah dilapisis selulosa

 5. Beri tanda menggunakan pensil pada plat 1 cm dari bawah dan 0,5 cm dari

atas

6. Totolkan sari I,II,III dan baku glukosa sebanyak 3 totolan beri jarak antara

totolan sari I,II,III dan baku glukosa

7. Masukkan plat yang berisi totolan kedalam chamber yang berisi elusi yang

sudah jenuh kemudian tutup. Tunggu hingga elusi membasahi hingga batas

atas plat.

8. Kemudian amati menggunakan sinar UV 366

9. Lalu plat di uapkan dengan uap ammonia, amati dibawah sinar UV 366

10. Semprot menggunakan pereaksi sitoborat lalu panaskan 1000 C selama 5

menit lalu amati dibawah sinar UV 366

11. Kemudian catat harga Rf dan warna yang terbentuk

E. Analisis hasil isolasi

Kualitatif 2 fase gerak alkoholik /BAW (Non Polar)

1. Siapkan alat dan bahan

2. Siapkan elusi fase gerak BAW menggunakan n-butanol 8 ml, asam asetat 2

ml, air 10 ml

3. Masukkan elusi BAW kedalam corong pisah kocok hingga terjadi 2 lapisan.

Ambil lapisan atas sebanyak 8 ml.

4. Masukkan BAW lapisan atas kedalam chamber dan jenuhkan. Masukkan

kertas saring kedalam chamber sebagai penanda bahwa asam asetat jenuh.

Asam asetat dikatakan jenuh apabila pelarut sudah meresap pada kertas saring

hingga atas.

5. Siapkan plat yang sudah dilapisis selulosa

 6. Beri tanda menggunakan pensil pada plat 1 cm dari bawah dan 0,5 cm dari

atas

7. Totolkan sari I,II,III dan baku rutin sebanyak 3 totolan beri jarak antara

totolan sari I,II,III dan baku rutin

8. Masukkan plat yang berisi totolan kedalam chamber yang berisi elusi yang

sudah jenuh kemudian tutup. Tunggu hingga elusi membasahi hingga batas

atas plat.

9. Kemudian amati menggunakan sinar UV 366

10. Lalu plat di uapkan dengan uap ammonia, amati dibawah sinar UV 366

11. Semprot menggunakan pereaksi sitoborat lalu panaskan 1000 C selama 5

menit lalu amati dibawah sinar UV 366

12. Kemudian catat harga Rf dan warna yang terbentuk

V. Hasil Pengamatan
a. Analisi golongan flavonoid

Sampel Uji shinoda +/-

Sebuk daun singkong Warna jingga +

b. Hasil isolasi glikosida flavonoid

1. Organoleptic

Organoleptik Hasil isolasi Teoritis pustaka

Bentuk Kristal Amorf

Warna Hijau kekuningan Hijau

Rasa Pahit Sepat

Bau Khas Khas

2. Rendemen

Bobot serbuk si mplisia : 50 gram

Bobot kristal : 0,24 gram

Rendemen :

: x100%

: 0,48 %

3. Hasil identifikasi KLT

Fase diam : selulosa
Fase gerak : asam asetat 15% sebanyak 8ml
Pereaksi pendeteksi : pereaksi sitoborat
Pereaksi
Kode bercak Rf Visual UV 366 nm
Sitoborat
1 0,58 Kuning Kuning Kuning
2 0,58 Kuning Kuning Kuning
3 0,08 Kuning Kuning Kuning
4 - - - -

Fase diam : selulosa

Fase gerak : butanol : asam asetat 15% : air (4:1:5)
Pereaksi pendektsi : pereaksi sitoborat

Pereaksi
Kode bercak Rf Visual UV 366 nm
Sitoborat
1 0,75 Kuning Kuning Kuning
2 0,83 Kuning Kuning Kuning
3 0,80 Kuning Kuning Kuning
4 0,75 Kuning Kuning Kuning
VI. Pembahasan
A. Analisis Golongan Flavonoid

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk mengetahui isolasi dan analisis

senyawa flavonoid. Haasil positif flavonoid ditujukan dengan terbentuknya

warna merah, kuning, atau jingga, pada lapisan amil alcohol. Warna jingga

sampai merah untuk flavon, merah sampai merah tua untuk flavanol, dan merah

tua sampai magenta (merah keunguan) untuk flavanon(Farnsworth, 1966).

Analisa flavonoid ekstrak serbuk daun singkong dilakukan dengan

menggunakan metode sianidin/shianoda/shibatta atau sering juga disebut dengan

uji Willstatter. Pada pengujian ini dilakukan penambahan HCL pada uji

flavonoid dimaksudkan untuk menghidrolisis flavonoid menjadi aglikonnya.

Reduksi dengan Mg dan HCL pekat menghasilkan senyawa kompleks yang

berwarna merah atau jingga pada flavon, flavonol, dan flavanon (Marliana,

2005). Hasil identifikasi senyawa flavonoid dari ekstrak serbuk simplisia daun

singkong yang diuji menunjukkan warna lapis amil alkohol yang didapat

berwarna jingga, hal ini menunjukkan bahwa jenis flavonoid yang terkandung

pada ekstrak serbuk daun singkong merupakan jenis flavonoid dari golongan

flavon.

B. Isolasi Rutin dari Daun Ketela Pohon

Pada isolasi rutin dari serbuk daun singkong dilakukan penarikan senyawa

dengan metode ekstraksi panas yaitu dekokta. Dimana dekoktan merupakan refluk

sederhana dengan menggunakan suhu 90°C selama 30 menit dihitung saat air

mendidih. Metode ini dilakukan karena senyawa rutin memiliki titik lebur 195°C
 dan memiliki sifat kelarutan mudah larut dalam air panas dan dingin (1:8).

Selanjutnya dilakukan penyaringan untuk memisahkan filtrat dengan pengotor,

kemudian filtrat disimpan ke dalam lemari es selama 1 minggu bertujuan untuk

mempercepat proses kristalisasi pembentuka kristal rutin. Setelah didapatkan

endapan kristal kemudian dilakukan penyaringan untuk memsisahkan pelarut

dengan kristalnya. Kristal yang tertampung pada penyaring lalu dikeringkan dengan

menggunakan oven suhu 50°C untuk menghilangkan sisa-sisa pelarut yang terbawa

pada kristal. Selanjutnya lakukan penimbangan selisih rendemen dimana pada hasil

praktikum yang didapatkan 0,24 gram dengan persentase hasil rendemen yang

didapat dari 50 g serbuk simplisia daun singkong sebesar 0,48%. Setelah itu ambil

sedikit padatan dengan ujung spatel kecil, larutkan dalam 2 campuran methanol-air

sama banyak yang akan menghasilkan sari I.

C. Hidrolisis rutin menjadi glikon dan aglikon

          Untuk mendapatkan sari 2 dan 3 maka dilakukan hidrolisis menjadi glikon

dan aglikon. Ambil 0,1 gram padatan kristal rutin kemudian ditambahkan 5ml

methanol dan 10ml HCL 2N masukkan ke dalam tabung reaksi yang ujungnya

ditutup kapas untuk mengurangi penguapan, kemudian dilakukan refluk selama

kurang lebih 1 jam atau sampai larutan menyusut menjadi setengahnya. Tuangkan

cairan hidrolisis yang telah dingin ke dalam corong pisah dan ditambahkan 20ml

eter, kocok 2-3 kali lalu diamkan hingga memisah. Pisahkan larutan eter dan air

pada beaker glass. Lakukan sebanyak 2 kali pada fase air. Pada fase larutan eter

disaring melalui kertas saring yang ditambahkan 1gram natrium sulfat anhidrat yang

berfungsi untuk mengikat sisa air yang ikut terbawa saat dilakukan pemisahan fase

larutan sehingga didapatkan sari larutan eter yang murni, kemudain fase larutan eter

diuapkan pada waterbath hingga kering selanjutnya ditambahkan 2ml methanol dan
 masukkan pada vial (sari 2). Pada larutan air penguapan diatas waterbath hingga

didapatkan fase larutan air sebanyak 1ml dan masukkan pada vial (sari 3).

D. Analisis hasil isolasi

Pada praktikum kali ini didapatkan rendemen kristal sebanyak 0,48%.

Rendemen dikatakan baik jika nilainya lebih dari 10% (Molyneux, 2004). Maka

rendemen yang didapatkan dinyatakan rendah karena salah satu faktor yang

menyebabkan adalah metode ekstraksi. Uji organoleptis kristal rutin dimaksudkan

untuk melihat tampilan fisik suatu sediaan yang meliputi bentuk, warna, rasa, dan

bau. Berdasarkan hasil yang didapat berbentuk kristal, berwarna hijau kekuningan,

berasa pahit, dan berbau khas hal ini sesuai dengan literatur (Sari, Meitisa., 2017).

Kemudian dilakukan identifikasi KLT dengan dua kondisi yaitu pada fase gerak

asam asetat 15% (KLT 1) dan fase gerak BAW dengan perbandingan 4:1:5 (KLT 2).

Pada analisis KLT 1 fase diam menggunakan selulosa, fase gerak asam asetat

15% sebanyak 8ml, cuplikannya adalah sari 1, 2, 3 dan larutan baku (glukosa), dan

deteteksi oleh sinar UV 366, uap ammonia, pereaksi sitoborat kemudian dipanaskan

100°C selama 5 menit. Kemudian didapatkan nilai Rf 1= 0.58, Rf 2= 0.58, Rf 3=

0.08, Rf 4 tidak terlihat dikarenakan kesalahan dalam penggunaan pereaksi. Karena

larutan baku yang digunakan glukosa seharusnya menggunakan pereaksi KMNO 4.

Glukosa sebagai reduktor dan KMNO4 sebagai oksidator sehingga akan terjadi

reaksi redoks.
 Pada analisis KLT 2 fase diam menggunakan selulosa, fase gerak BAW

sebanyak 8ml, cuplikannya adalah sari 1, 2, 3 dan larutan baku (rutin), dan deteteksi

oleh sinar UV 366, uap ammonia, pereaksi sitoborat kemudian dipanaskan 100°C

selama 5 menit. Kemudian didapatkan nilai Rf 1= 0.75, Rf 2= 0.83, Rf 3= 0.80, Rf

4= 0.75. Menurut (Rohman, 2009) nilai Rf yang baik adalah 0.2-0.8 maka nilai Rf

yang didapatkan dinyatakan baik.

VII. Kesimpulan

Hasil uji serbuk simplisia daun singkong positif mengandung senyawa

flavonoid, dengan menunjukkan terbentuknya warna jingga pada uji Willstatte,

warna tersebut menunjukkan jenis flavonoid yang terkandung yaitu golongan

flavon. Hasil kadar rendemen kristal rutin yang terkandung dalam 50g serbuk

simplisia daun singkong yaitu sebesar 0,48%. Hasil uji organoleptik rutin yang

didapat berbentuk kristal, berwarna hijau kekuningan, berasa pahit, dan berbau

khas, kemudian pada analisis KLT 1 karena adanya kesalahannya penggunaan

pereaksi sehingga tidak terlihal noda bercak. Hasil uji KLT pada uji gerak

menggunakan BAW dengan baku rutin didapat nilai rf setara dengan rf baku sari I

yang berarti dapat disimpulkan bahwa didalam daun singkong positif mengandung

rutin.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1983. The Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals and Drug. Ninth
Edition. New Jersey: Merck and Co., Inc. p: 7936.
Farnsworth NR. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of
Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-277.
Harbone JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganilisis Tumbuhan.
Kosasih dan Iwang S., penerjemah. Bandung: Penerbit ITB-Bandung.
Marliana, E., 2005. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Andong (Cordyline
fruticosa (L) A. Cheval). Jurnal Mulawarman Scientifie. 11(1), 71-82.
Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical DPPH for Estimating
Antioxidant. Activity. Journal of Science Technology. 26, 211-219.
Rohman A. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat.Yogyakarta: Graha Ilmu.
Sari, E. R., & Meitisa, M. (2017). Standarisasi mutu ekstrak daun singkong (Manihot
esculenta Crantz ). Jurnal Ilmiah Bakti Farmasi, 2(1), 13–20.
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan elusi fase gerak BAW 4:1:5

Membuat larutan sebanyak 20 ml

n-butanol :4

asam asetat :1

air :5
Total : 10

n- butanol : 4 X 20 = 8 ml
10

1
Asam asetat : X 20 = 2 ml
10

Air : 5
X 20 = 10
10
Lampiran 2.

Infusa sushu 90°C 15menit + MG+HCL+Amil Alkohol Hasil

Dekokta 90°C 30 menit Penyaringan kain flanel Penyaringan kertas saring

Filtrat simpan dalam lemari es Saring kristal Dikeringkan

Hidrolisis rutin
Refluks sederhana 1 jam Penambahan eter
 Penggojokan Pemisahan Saring sari eter

Penguapan sari eter Penguapan sari air +methanol (sari 1, 2, 3)

Hasil KLT 1 Hasil KLT 2