PANDUAN PRAKTIKUM

PRAKTIKUM ISOLASI DAN ANALISIS

TUMBUHAN OBAT
(A 5 1 11 12 115)

SEMESTER 5

Nama : ...................................................

NIM : ...................................................

Kelompok : ...................................................

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
2022/2023
i
 TIM PENYUSUN

Ketua : apt. Dr. Titik Sunarni, M.Si.

Sekretaris : apt. Fransiska Leviana, M.Sc.
Anggota : apt. Mamik Ponco Rahayu, M.Si.
apt. Ghani Nurfiana Fadma Sari, M.Farm.
apt. Fitria Kurniasari, M.Pharm.
apt. Taufik Turahman, M.Farm.
apt. Ismi Puspitasari, M.Sc.

ii
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT. Atas berkat dan rahmat-Nya Buku
Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat ini dapat diterbitkan. Praktikum
Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat bertujuan untuk memberikan pemahaman dan
keterampilan kepada mahasiswa tentang beberapa prosedur isolasi dan analisis senyawa-
senyawa dalam tumbuhan obat.
Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat merupakan mata kuliah yang
diberikan kepada mahasiswa S1 Farmasi semester V. Materi praktikum
disusun sedemikian rupa sehingga dapat menunjang serta sekaligus memberikan gambaran
yang lebih jelas mengenai materi yang diberikan pada perkuliahan. Melalui praktikum yang
terarah, diharapkan dapat meningkatkan motivasi dan merangsang inovasi baru
dari mahasiswa dalam teknis praktis.
Semoga buku Petunjuk Praktikum ini dapat dimanfaatkan sebaik-baiknya untuk proses
pembelajaran di Program Studi S1 Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi.
Penyusun menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, untuk itu kritik dan saran dari
pembaca untuk perbaikan buku ini sangat diharapkan. Akhirnya penulis mengucapkan banyak
terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu terwujudnya buku ini.

Surakarta, Agustus 2021

Tim Penyusun

i
 DAFTAR ISI

Isolasi dan Analisis Flavonoid ....................................................................... 1

Isolasi dan Analisis Minyak Atsiri .................................................................. 7
Isolasi dan Analisis Alkaloid I : Piperin ........................................................ 12
Isolasi dan Analisis Alkaloid I : Kofein ........................................................ 17
Isolasi dan Analisis Lemak ............................................................................. 22
Analisis Metabolit Sekunder Lainnya ............................................................. 28

Penetapan Kadar Flavonoid Total

ii
 TATA TERTIB
PRAKTIKUM ISOLASI DAN ANALISIS TUMBUHAN OBAT

A. Ketentuan Umum
1. Praktikan harus mentaati tata tertib kuliah praktek yang tertera pada Kartu
Praktikum Mahasiswa.
2. Praktikan yang terlambat lebih dari 15 menit setelah praktikum dimulai tanpa alasan
yang dapat diterima, tidak diperkenankan mengikuti praktikum.
3. Praktikan wajib membuat lembar kerja di tempat yang disediakan di Buku Panduan
Praktikum ini dan memintakan acc ke dosen pengampu.
4. Praktikan harus menjaga ketertiban, keamanan, dan kebersihan selama menjalankan
praktikum.
5. Praktikan tidak boleh melakukan kegiatan lain yang tidak berkaitan dengan
praktikum, kecuali seijin dosen pengampu.

B. Ketentuan Ijin
1. Mahasiswa wajib mengikuti semua pertemuan praktikum (100% kehadiran).
Apabila kehadiran mahasiswa kurang dari ketentuan tersebut, maka mahasiswa tidak
diperkenankan mengikuti ujian, kecuali :
a. Sakit dan dirawat di Rumah Sakit yang dibuktikan dengan surat rawat inap
dari RS
b. Keluarga inti ada yang meninggal yang dibuktikan dengan surat lelayu
c. Tugas dari Universitas/Fakultas/Program Studi yang dibuktikan dengan surat
tugas.
2. Bagi praktikan yang akan meninggalkan praktikum harus seiijin dosen pengampu.

C. Ketentuan Alat dan Ruang

1. Peralatan yang harus dibawa tiap mahasiswa berupa masker, korok, sabun, spiritus,
lap, 1 buah botol mulut lebar bertutup 100 ml, 2 buah vial 10 ml, 2 buah pipet tetes,
object glass, deck glass, 2 buah, tabung reaksi dan peralatan lain yang diperintahkan
oleh dosen pengampu/petugas laboratorium.
2. Kebersihan dan kelengkapan peralatan menjadi tanggung jawab masing-masing
praktikan dan kelompok.
3. Sebelum meninggalkan laboratorium : alat-alat, meja, wastafel, dan tempat pratikum
harus bersih dan rapi.

Demikian tata tertib ini dibuat untuk diindahkan dan ditaati demi kelancaran
praktikum yang dijalankan dan segala sesuatu yang belum tercantum dalam tata tertib
akan diumumkan pada saat praktikum.

Surakarta, Agustus 2021

Tim Penyusun

iii
 KONTRAK PERKULIAHAN
Nama Mata Kuliah : Praktikum Isolasi dan dan Analisis Tumbuhan Obat
Nomor Kode : A 5 1 11 12 115
SKS : 1
Semester : Ganjil (V)

A. MANFAAT MATA KULIAH

Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa mampu melakukan isolasi dan analisis senyawa
tanaman :
1. melakukan isolasi dan analisis senyawa pada tanaman :
a. Senyawa Glikosida Flavonoid
b. Senyawa Alkaloid
c. Senyawa Lemak
d. Senyawa Minyak Atsiri
2. melakukan analisis golongan metabolit sekunder lainnya : steroid/triterpen, tanin,
saponin, kuinon, fenolik

Berdasarkan KKNI : 1 Jenjang 6:

1. Mampu mengaplikasikan bidang keahliannya dan memanfaatkan ilmu pengetahuan, teknologi, dan/atau
seni pada bidangnya dalam penyelesaian masalah serta mampu beradaptasi terhadap situasi yang
dihadapi.
2. Menguasai konsep teoritis bidang pengetahuan tertentu secara umum dan konsep teoritis bagian
khusus dalam bidang pengetahuan tersebut secara mendalam, serta mampu memformulasikan
penyelesaian masalah prosedural.
3. Mampu mengambil keputusan yang tepat berdasarkan analisis informasi dan data, dan mampu
memberikan petunjuk dalam memilih berbagai alternatif solusi secara mandiri dan kelompok.
4. Bertanggung jawab pada pekerjaan sendiri dan dapat diberi tanggung jawab atas pencapaian hasil kerja
organisasi.

Lulusan Program Sarjana wajib memiliki keterampilan umum sebagai berikut:

1. Mampu menerapkan pemikiran logis, kritis, sistematis, dan inovatif dalam konteks pengembangan atau
implementasi ilmu pengetahuan dan teknologi yang memperhatikan dan menerapkan nilai humaniora yang
sesuai dengan bidang keahliannya;
2. Mampu menunjukkan kinerja mandiri, bermutu, dan terukur;
3. Menyusun deskripsi saintifik hasil kajian tersebut di atas dalam bentuk skripsi atau laporan tugas akhir,
dan mengunggahnya dalam laman perguruan tinggi;
Menyusun deskripsi saintifik hasil kajian tersebut di atas dalam bentuk skripsi atau laporan tugas akhir, dan
mengunggahnya dalam laman perguruan tinggi;
4. Mampu mengambil keputusan secara tepat dalam konteks penyelesaian masalah di bidang keahliannya,
berdasarkan hasil analisis informasi dan data;
5. Mampu memelihara dan mengembangkan jaringan kerja dengan pembimbing, kolega, sejawat baik
di dalam maupun di luar lembaganya;
6. Mampu bertanggungjawab atas pencapaian hasil kerja kelompok dan melakukan supervisi dan
evaluasi terhadap penyelesaian pekerjaan yang ditugaskan kepada pekerja yang berada di bawah
tanggungjawabnya;
7. Mampu melakukan proses evaluasi diri terhadap kelompok kerja yang berada dibawah tanggung
jawabnya, dan mampu mengelola pembelajaran secara mandiri;
8. Mampu mendokumentasikan, menyimpan, mengamankan, dan menemukan kembali data untuk
menjamin kesahihan dan mencegah plagiasi;

iv
B. MATERI
Materi Kemampuan akhir yang
diharapkan
1 Mahasiswa mampu melakukan
isolasi dan analisis senyawa
flavonoid
2 Mahasiswa mampu melakukan isolasi 
dan analisis senyawa minyak atsiri 
3 Mahasiswa mampu melakukan
isolasi dan analisis senyawa
alkaloid
4 Mahasiswa mampu melakukan
isolasi dan analisis senyawa lemak
5 Mahasiswa melakukan analisis
senyawa golongan metabolit
sekunder lainnya
Materi/Pokok Bahasan
 Isolasi glikosida flavonoid rutin
 Hidrolisis glikosida flavonoid rutin
 Analisis flavonoid
Isolasi minyak cengkeh
Analisis minyak atsiri
 Isolasi piperin
 Isolasi kofein
 Analisis alkaloid
 Isolasi trimiristin
 Penyabunan trimiristin
 Analisis lemak dan minyak lemak
Analisis golongan metabolit sekunder
lainnya

C. TUGAS-TUGAS
1. Tes
2. Portofolio
3. Review artikel ilmiah
4. Laporan Praktikum

D. KRITERIA PENILAIAN
METODE PAP :
A : >=85
B : 84-70
C : 69-55
D : 54-20
E : 19-0

E. JADWAL PERKULIAHAN
Minggu Ke Rencana Program

1-3  Isolasi dan analisis glikosida flavonoid : rutin

4-5  Isolasi dan analisis minyak atsiri : minyak cengkeh

6 UTS
7-8  Isolasi dan analisis alkaloid I: piperin
9-10  Isolasi dan analisis alkaloid II : kofein
11-12  Isolasi dan analisis lemak : trimiristin
13-14  Analisis golongan metabolit sekunder lainnya

15-16 UAS

v
 ISOLASI DAN ANALISIS FLAVONOID

I. TUJUAN
Setelah menyelesaikan praktikum ini diharapkan mahasiswa mampu melakukan
isolasi dan analisis senyawa flavonoid.

II. PENDAHULUAN
Flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar yang terdapat dalam
semua tumbuhan berpembuluh. Semuanya mengandung atom karbon dalam inti dasarnya
yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan
oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Flavonoid
dalam tumbuhan umumnya terikat sebagai glikosida, baik O-glikosida maupun C-glikosid
dan dapat sebagai aglikonnya. Isolasi flavonoid tergantung dari polaritasnya dan hal ini
menentukan pelarut yang digunakan. Polaritas dari flavonoid dipengaruhi oleh substituen
yang mengikat misalnya gula, hidroksida dan alkil (Harborne 1987; Markham 1988).
Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi dan fluoresensinya di bawah
sinar ultraviolet. Pereaksi yang digunakan adalah amonia dan basa yang lain yang akan
mempengaruhi gugus fenol yang bersifat asam dan memberikan warna kuning. Selain itu
pereaksi pembentuk kompleks seperti AlCl3 dan pereaksi sitroborat yang juga memberikan
warna kuning. Analisis umum flavonoid dengan uji Shinoda/Shibata/Sianidin atau sering
juga disebut uji Willstatter. Uji ini berfungsi untuk mendeteksi acanya inti γ-benzopiron.
Rutin (quercetin-3-O-rutinoside) merupakan glikosida flavonoid yang dapat dijumpai
dalam daun ketela pohon. Titik lebur 1950C. Sifat kelarutannya adalah mudah larut dalam
air panas dan dingin (1:8), dengan hidrolisis asam dapat memutuskan ikatan aglikon
dengan glikonnya. Sebagai glikonnya adalah disakarida ramnosa dan glukosa yang sering
disebut rutinosa, aglikonnya adalah kuersetin. Rutin berbentuk serbuk berwarna kuning.
Rutin merupakan suplemen sebagai vitamin P dan diklaim berefek dalam terapi perdarahan
kapiler, dan berguna sebagai antiinflamasi.
Kuersetin (3,3',4',5-7-pentahydroxyflavone) berbentuk serbuk berwarna kuning,
dengan kelarutan praktis tidak larut air, dalam etanol (1:250), dalam etanol 70% (1:285);
dalam etanol 30% (1:3571), titik lebur > 3000C (Anonim 1983). Kuersetin dapat berefek
sebagai antioksidan, antibakteri, antiedema, antifungal, antiinflamasi, antitumor, antiulser,
antiviral dan lain sebagainya, sehingga senyawa bioaktif kuersetin ini memberikan harapan
sebagai bahan baku obat yang sangat potensial untuk dikembangkan.
Glikosida flavonoid di dalam bahan yang diisolasi bersifat polar sehingga dapat disari
dengan air panas dan dikristalkan dengan pendinginan, sedangkan pemisahan aglikon dari
glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam.
OH OH

O O Rutinosa
HO
OH
HCl HO
OH (rhamnosa
+ H2O +
dan
O ramnoglukosil OH glukosa)
OH O OH O

Rutin Kuersetin
Gambar 1. Reaksi hidrolisis senyawa rutin.

III. BAHAN DAN ALAT

A. BAHAN :
Serbuk daun singkong/daun singkong segar, air suling, amonia, metanol, HCl 2N,
natrium sulfat anhidrat, asam asetat 15 %, n-butanol, pereaksi sitroborat, KMNO4,
lempeng selulosa.
B. ALAT
Seperangkat alat infus (panci infus), Erlenmeyer 250 , gelas ukur, beaker glass,
corong gelas, corong pisah, erlenmeyer, cawan porselin, tabung reaksi, vial, seperangkat
KLT.

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 1

V. CARA KERJA
A. Analisis Golongan Flavonoid
Bahan yang dianalisis serbuk daun singkong dengan pembanding kuersetin dan
atau rutin. Metode yang digunakan adalah uji Sianidin/Shinoda/Shibata atau sering juga
disebut uji Willstatter. Sebanyak 1 g serbuk dipanaskan dalam 100 mL air suling dan
dididihkan selama 15 menit, kemudian disaring, dan diperoleh filtrat A. Sebanyak 5 mL
filtrat A dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan serbuk magnesium, asam
hidroklorida pekat, dan amil alkohol. Campuran dikocok kuat dan dibiarkan memisah.
Hasil positif flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga
pada lapisan amil alkohol. Jingga sampai merah untuk flavon, merah sampai merah tua
flavanol, merah tua sampai magenta (merah keunguan) untuk flavanon (Farnsworth 1966).

B. Isolasi rutin dari daun ketela pohon

Timbang 50 gram serbuk kasar daun singkong, masukkan dalam panci infus dan
tambahkan 500 mL air. Didihkan selama 30 menit. Saring campuran melalui corong
Buchner sehingga diperoleh filtrat yang jernih dan pindahkan ke dalam erlenmeyer 250
mL yang bersih. Simpan dalam almari es selama 1 minggu sehingga terbentuk kristal
amorf putih kekuningan. Tuangkan sebagian besar larutan jernih dengan hati-hati agar
kristal tidak ikut tertuang, kemudian saring kristal yang ada pada dasar erlenmeyer melalui
kertas saring yang telah ditara. Jika masih ada kristal yang menempel pada dasar
erlenmeyer bilas dengan air suling dingin dan tuangkan bilasan ke kertas saring, cuci kistal
dengan 10 mL air es. Keringkan kertas saring bersama endapan pada suhu 50o C sampai
kering kemudian timbang. Ambil sedikit padatan dengan ujung spatel kecil, larutkan dalam
2 campuran metanol-air sama banyak (Sari 1).

C. Hidrolisis rutin menjadi glikon dan aglikonnya

Ambil ± 0,1 g padatan dan masukkan ke dalam beker glass, lalu tambahkan
metanol maksimal 5 mL, masukkan secara enap tuang filtrat dalam tabung reaksi, lalu
tambahkan 15-20 mL HCl 2 N dalam beker glass, enap tuang masukkan filtrat ke tabung
reaksi. Taruh corong kecil berisi kapas di atas tabung untuk mengurangi penguapan.
Lakukan refluks pada penangas air mendidih selama 1 jam. Jika cairan dalam tabung
banyak yang menguap tambahkan 5 mL air suling yang panas ke dalamnya. Tuangkan
cairan hasil hidrolisis yang telah dingin dari tabung ke dalam corong pisah. Tambahkan 20
mL dietil eter, kocok kembali lapisan air asamnya dengan 20 mL dietil eternya dengan
yang pertama. Saring sari eter melalui kertas saring yang berisi 1 gram natrium sulfat
anhidrat ke dalam cawan porselin, uapkan eternya tanpa pemanasan dan larutkan residu
yang diperoleh dalam 2 mL metanol (Sari II). Uapkan lapisan air asam hasil hidrolisis pada
cawan porselin di atas penangas air sehingga cairan tinggal kira-kira 1 mL (Sari III).

D. Analisis Hasil Isolasi

1. Hitung rendemen kristal yang diperoleh!
2. Amati organoleptis kristal yang didapat!
3. Lakukan analisis umum flavonoid pada krital dan hasil hidrolisis
4. Lakukan identifikasi dengan cara KLT dengan 2 kondisi, lalu bandingkan harga Rf dan
warna yang terbentuk :
Analisis kualitatif I
a. Fase diam : selulosa
b. Fase gerak : asam asetat 15 %
c. Cuplikan : sari I, II, III dan pembanding larutan rutin dalam metanol 50 %
masing-masing sebanyak 3 totolan, kecuali sari III 10 totolan.
d. Deteksi : 1. sinar UV 366
2. Uap amonia, di bawah sinar tampak dan UV 366
3. Pereaksi sitroborat, panaskan 100o C selama 5 menit.

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 2

 Analisis kuantitatif II
a. Fase diam : selulosa
b. Fase gerak : n-butanol : asam asetat 15 % : air (4 : 1 : 5)
c. Cuplikan : sari I, II, III dan pembanding larutan glukosa dan ramnosa 1 %
masing-masing sebanyak 3 totolan, kecuali sari III dan pembanding
10 totolan.
d. Deteksi : sinar UV 366, uap amonia (untuk flavonoid) dan larutan
penyemprot kalium permanganat basa untuk gula, catat harga Rf
dan warna yang terbentuk

VI. PUSTAKA
Anonim. 1983. The Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals and Drug. Ninth Edition.
New Jersey: Merck and Co., Inc. p: 7936.
Dewick PM. 2009. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. 3rd Edition.
West Sussex: John Wiley & Sons Ltd.
Farnsworth NR. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of
Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-277.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.
Kosasih dan Iwang S., penerjemah. Bandung: Penerbit ITB-Bandung.
Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Kosasih dan Sofia N, penerjemah.
Bandung: Penerbit ITB.
Merck E, Darmstadt. 1978. Dyeing Reagents for The Layer & Paper Chromatography.
Federal Republic of Germany.

LEMBAR KERJA

Materi : Isolasi dan Analisis Flavonoid

Ringkasan Uraian Kegiatan
Hari/Tanggal Kegiatan

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 3

 Hari/Tanggal Kegiatan

A. ANALISIS GOLONGAN FLAVONOID

Sampel Uji shinoda +/-

B. HASIL ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID

Hasil Isolasi Glikosida Flavonoid
1. Organoleptik
Organoleptik Hasil isolasi Teoritis dan Pustaka

Bentuk

Warna

Rasa

Bau

2. Rendemen

Bobot serbuk simplisia =

Bobot kristal =

Rendemen = Bobot kristal . X 100%

Bobot serbuk simplisia

Hasil Hidrolisis Glikosida Flavonoid

1. Identifikasi KLT
Fase diam :
Fase gerak :

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 4

 Pereaksi pendeteksi :

Warna noda
Kode
Rf Pereaksi
bercak Visual UV 254 nm UV 366 nm
...........................

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 5

 Fase diam :
Fase gerak :
Pereaksi pendeteksi :

Warna noda
Kode
Rf Pereaksi
bercak Visual UV 254 nm UV 366 nm
...........................

ACC Surakarta,
Surakarta, Praktikan,

.................................................... ………………………….......

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 6

 ISOLASI DAN ANALISIS MINYAK ATSIRI

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu melakukan isolasi
dan analisis minyak atsiri.

II. PENDAHULUAN
Istilah minyak atsiri atau ‘minyak eteris/minyak esensial” adalah istilah untuk
minyak mudah menguap yang terkandung dalam tanaman. Minyak ini disebut juga minyak
menguap, minyak eteris, minyak esensial karena pada suhu kamar mudah menguap di
udara terbuka. Istilah esensial dipakai karena minyak atsiri mewakili bau dari tanaman
asalnya.
Sifat-sifat minyak atsiri yaitu :
 Bukan merupakan senyawa tunggal, tapi tersusun oleh bermacam-macam
komponen senyawa yang secara garis besar terdiri dari kelompok terpenoid dan
fenilpropana
 Memiliki bau khas. Bau minyak atsiri satu dengan yang lain berbeda-beda, sangat
tergantung dari macam dan intensitas bau dari masing-masing komponen penyusun
 Mempunyai rasa getir, kadang berasa tajam, menggigit, memberi kesan hangat
sampai panas, atau justru dingin ketika terasa di kulit, tergantung jenis komponen
 Dalam keadaan belum tercemar mudah menguap pada suhu kamar
 Bersifat tidak bisa disabunkan dengan alkali dan tidak bisa berubah menjadi tengik.
Ini berbeda dengan minyak lemak yang tersusun dari asam lemak
 Bersifat tidak stabil terhadap pengaruh lingkungan, oksigen di udara, sinar matahari
(terutama UV), dan panas. Umumnya minyak yang segar tidak berwarna, namun
pada penyimpanan lama dapat teroksidasi dan membentuk resin serta warnanya
berubah menjadi lebih gelap
 Indeks bias umumya tinggi
 Pada umumnya bersifat optis aktif dan memutar bidang polarisasi dengan rotasi
spesifik
 Pada umumnya tidak bercampur dengan air, tetapi cukup dapat larut hingga dapat
memberikan baunya pada air
 Sangat mudah larut pelarut organik

Golongan minyak atsiri berdasarkan komponen penyusunnya yaitu :

1. hidrokarbon
Monoterpen (C10H10) terdapt dalam hampir semua minyak atsiri, seskuiterpen
(C15H24) terdapat dalam banyak minyak atsiri, diterpen (C20H32) terdapat dalam
beberapa minyak atsiri. Contohnya : minyak terpentin
2. Alkohol
Terdapat dalam minyak atsiri dalam berbagai bentuk, misal alkohol alifatik, alkohol
alisiklik, dan alkohol aromatik, dapat juga sebagai esternya, misalnya mentol
(Oleum Mentha piperita) dan borneol (Oleum Cardamomi)
3. Aldehid
Terdapat dalam bentuk alifatik, alisiklik, heterosiklik, dan aromatik. Contoh :
sinamilaldehid (Oleum Cinnamomi)
4. keton
terdapat dalam bentuk alifatik, alisiklik, heterosiklik, dan aromatik. Contoh :
karvon (Oleum Sinapsis dan Oleum Mentha piperita )
5. fenol
Bersifat antiseptik, misalnya eugenol (Oleum Caryophylli) dan timol (Oleum
Thymi)
6. eter fenolat
Contohnya : Anetol (Oleum Anisi) dan safrol (Oleum Sassafras), metoksi safrol
atau miristisin (Oleum Myristicae)
7. oksida sineol atau eukaliptol
Contoh : Oleum Eucalypti dan Oleum Cajuputi

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 7

 8. lain-lain
Asam, ester, turunan furan, dan lain-lain.

Metode yang dapat digunakan untuk mendapatkan minyak atsiri yaitu destilasi,
penyarian dengan pelarut penyari yang cocok, pemerasan, ekstraksi dengan lemak dingin
(enfleurage), atau maserasi dengan lemak panas (Depkes RI 1985).
Prinsip kerja alat destilasi ini adalah bila uap air dan minyak terkondensasi maka
minyak akan tertampung dalam pipa penampung. Semakin lama minyak dan air yang
tertampung akan semakin banyak sehingga jika air melebihi batas tabung dan air akan
masuk kembali ke dalam tabung dan terbawa uap.
Bunga cengkeh (Syzygium aromaticum (L.) Merrill et L.M. Perry (Myrtaceae))
dapat menghasilkan minyak atsiri yang disebut minyak cengkeh. Kandungan utama bunga
cengkeh (hingga 20%) adalah minyak atsiri, yang mengandung eugenol (60–95%),
eugenol asetat (2–27%), dan α- dan β-caryophyllene (5–10%) (WHO 2004). Kualitas
minyak cengkeh berdasarkan SNI 06-4267-1996 adalah tidak berwarna-kuning muda berat
jenis (25oC) 1,030-1,060; dan indeks bias (25oC) 1,527-1,535; putaran optik 0o-1o35’,
kelarutan dalam etanol 70% 1:2 jernih, seterusnya jernih; ugenol total (v/v): 80-95% ;
minyak pelikan: negatif; lemak: negatif (Yuliani & Satuhu 2012). Minyak cengkeh telah
banyak dimanfaatkan sebagai agen perasa dan pemberi aroma pada berbagai makanan
karena aroma dan rasanya yang kuat dan pedas, selain itu minyak cengkeh memiliki
aktivitas biologis sebagai antiseptik dan analgesik pada pengobatan gigi dan mulut.

Gambar 6. Struktur komponen senyawa dalam minyak atsiri cengkeh.

III. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan
Cengkeh, aquades, alkohol, benzena.
2. Alat
Labu destilasi, kondensor, pipa Clavenger, perangkat KLT, refraktometer,
timbangan, alat-alat gelas.

IV. PROSEDUR
A. Isolasi minyak atsiri
Siapkan peralatan destilasi dengan pipa clavenger. Timbang 100 gram serbuk,
masukkan dalam labu destilasi dan tambahkan air kira-kira 5 kali berat dari bahan yang
dianalisa (3/4 volume labu destilasi). Lakukan destilasi dengan kondisi suhu pada labu
destilasi 1300C dan atur laju alir kecepatan penyulingan hingga 1 tetes per detik. Lanjutkan
penyulingan sampai tidak terdapat tetesan minyak lagi. Setelah selesai penyulingan,
pisahkan minyak cengkeh, lalu tambahkan natrium sulfat anhidrat.

B. Analisis Hasil Isolasi

1. Hitung rendemen minyak atsiri hasil percobaan!
2. Lakukan pengamatan organoleptis minyak atsiri!
3. Tentukan berat jenis dan indeks bias !
4. Tentukan kemurnian minyak atsiri berdasarkan indeks bias !
5. Lakukan uji adanya eugenol pada minyak cengkeh
Satu tetes minyak atsiri diteteskan pada dua buah gelas obyek. Tambahkan setetes
larutan NaOH 3% dijenuhi kalium bromida. Amati kristal natrium eugenolat yang terjadi
di bawah mikroskop. Pada gelas obyek yang lain ditambah dua tetes larutan besi (III)
klorida. Amati warna yang terjadi.

8
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
6. Lakukan identifikasi dengan cara KLT dari minyak cengkeh dengan kondisi :
a. Fase diam : Silika gel GF 254
b. Fase gerak : benzena (dua kali) dengan pengeringan antara dua
pengembangan 10 menit pada 20 0C atau heksana-etil asetat
(96:4) (dua kali) dengan pengeringan antara dua pengembangan
5 menit pada suhu kamar
c. Cuplikan : minyak diencerkan dengan toluen dengan perbandingan 1:10
d. Deteksi : - UV 254 nm (perhatikan peredaman fluoresensi),
- UV 366 nm (perhatikan fluoresensi jika ada),
- anisaldehida-asam sulfat (dipanaskan 10 menit pada suhu
1050C)
C. Analisis Minyak Atsiri
1. Analisis pada Serbuk Simplisia
Serbuk simplisia ditambah pereaksi Sudan III, amati di mikroskop.
2. Analisis Minyak Atsiri
a. Teteskan 1 tetes minyak atsiri pada permukaan air. Minyak atsiri akan menyebar
dan permukaan tidak keruh.
b. Teteskan 1 tetes minyak atsiri pada kertas saring. Bila dibiarkan minyak akan
menguap sempurna tanpa meninggalkan noda lemak (transparan)
c. Kocoklah 1 ml minyak atsiri dengan 1 ml larutan natrium klorida jenuh dalam gelas
ukur 5 ml. Biarkan memisah kembali, volume lapisan air tidak boleh bertambah.
d. Ukurlah daya larut minyak atsiri dalam etanol, eter, kloroform, petroleum eter. 1
tetes minyak atsiri larut jernih dalam berapa tetes pelarut.
e. Ukur indeks bias masing masing minyak atsiri dengan alat refraktometer.
f. Deteksi adanya senyawa fenol dalam minyak atsiri
Tambahkan setetes larutan besi (III) klorida ke dalam 2 ml larutan minyak atsiri 25
% dalam etanol yang netral terhadap lakmus. Amati warna yang terjadi.
g. Reduksi minyak atsiri yang mengandung fenol dan turunannya.
Tambahkan larutan NaOH ke dalam 2 ml minyak atsiri, kocok pelan-pelan. Amati
apakah terjadi reduksi volume.

V. PUSTAKA
Depkes RI [Departemen Kesehatan Republik Indonesia]. 1985. Cara Pembuatan Simplisia.
Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Farnsworth NR. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of
Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-277.
Stahl E. 1985. Drug Analysis by Chromatography and Microscopy. Kosasih Padmawinata
dan Iwang Sudiro, penerjemah; Bandung: Penerbit ITB.
WHO [World Health Organization]. 2004. WHO Monographs on Selected Medicinal
Plants. Vol 2. Geneva: World Health Organization.
Yuliani S, Satuhu S. 2012. Panduan Lengkap Minyak Atsiri. Jakarta: Penebar Swadaya.

LEMBAR KERJA

Materi : Isolasi dan Analisis Minyak Atsiri

Ringkasan Uraian Kegiatan
Hari/Tanggal Kegiatan

9
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
A. HASIL ISOLASI MINYAK ATSIRI
1. Organoleptik
Pustaka yang
Organoleptik Hasil isolasi Teoritis
digunakan
Bentuk
Warna
Rasa
Bau
2. Rendemen
Kandungan teoritis minyak atsiri dalam simplisia =
(......................., ......................)
Bobot serbuk simplisia =

Volume minyak atsiri =

Rendemen = Volume minyak . X 100%

Bobot serbuk simplisia
3. Indeks bias
Bobot air = Volume =

Bobot minyak atsiri = Volume =

Kemurnian = ( 1 -│Indeks bias teoritis – Indeks bias praktek│ )X100%

│ Indeks bias teoritis │
4. Identifikasi KLT
Fase diam :
Fase gerak :
Pereaksi pendeteksi :
Warna noda
Gambar Kode
Rf Pereaksi
Kromatogram bercak Visual UV 254 nm UV 366 nm
...........................

B. HASIL ANALISIS MINYAK ATSIRI

1. Analisis kandungan minyak atsiri pada serbuk simplisia

10
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
2. Hasil Analisis Minyak Atsiri
a. Sifat di air

b. Noda lemak

c. + NaCl jenuh

d. Uji Kelarutan
PE Eter kloroform Etanol

e. Deteksi adanya senyawa fenol dalam minyak atsiri dengan FeCl3

g. Reduksi minyak atsiri yang mengandung fenol dan turunannya dengan NaOH.

ACC Surakarta,
Surakarta, Praktikan,

.................................................... ………………………….....

11
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
 ISOLASI DAN ANALISIS ALKALOID I
PIPERIN

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu melakukan isolasi
dan analisis alkaloid.

II. PENDAHULUAN
Alkaloid adalah senyawa nitrogen biasanya terdapat dalam tumbuh-tumbuhan
kebanyakan bersifat basis dan sering mempunyai aksi farmakologi tertentu. Alkaloid
terdapat pada tumbuhan familia tertentu, misalnya Leguminosae, Papaveraceae,
ranunculaceae, Rubiaceae, Solanaceae dan Berberidaceae.
Berdasarkan struktur kimianya, alkaloid dapat digolongkan menjadi :
1. golongan piridina, misal arekolina (Areca catechu), nikotina (Nicotiana tabacum)
2. golongan tropan, misalnya hiosiamina, skopolamina (Atropa belladona,
Hyoscyamus niger, Datura stramonium)
3. Golongan kinolin, misalnya kinina dan kinidina (Chincona succirubra)
4. Golongan iso-kinolin, misalnya hidrastin (Hydrastis canadensis), emetin
(Cephaelis ipecachuanhae), morfin dan kodein (Papaver somniferum)
5. Golongan indol, misalnya ergotamina (secale cornutum), strihnina dan brusina
(Strychnos nux vomica), reserpin (Rouwolfia serpentina)
6. Golongan amina, misalnya efedrina (Ephedra sinica), kolkisina (Colchicum
autumnale)
7. Golongan steroid, misalnya akonitin (Aconitum napellus)
8. Golongan purina, misalnya kofeina (Cola nitida, Coffea arabica, Carnellia
sinensis), tofilina (Camellia sinensis), teobromina (Teobroma cacao)
Untuk identifikasi alkaloid dapat dilakukan dengan cara reaksi pengendapan dan
reaksi warna. Sebelum dilakukan reaksi tersebut, diadakan pemisahan (isolasi) antara lain
dengan jalan :
1. penyekatan dengan pelarut organik (kloroform, eter)
2. penyekatan air-asam
3. mikrosublimasi
4. mikrodestilasi dengan alat tanur TAS, dilanjutkan dengan kromatografi
Analisis umum alkaloid menggunakan uji pengendapan. Reaksi positif yang
membentuk endapan sekurang-kurangnya 2 reaksi dari golongan reaksi pengendapan yang
dilakukan. Larutan untuk pengendapan dibagi menjadi 4 golongan yaitu :
1. Golongan I : larutan percobaan yang dengan alkaloid tertentu membentuk
garam yang tidak larut : asam siliko wolframat LP, asam fosfo
molibdat LP, dan asam fosfo wolframat LP.
2. Golongan II : larutan percobaan yang dengan alkaloid tertentu membentuk
senyawa kompleks bebas, kemudian membentuk endapan:
Bouchardat LP (iodine-potassium iodide), Wagner LP (iodine-
potassium iodide).
3. Golongan III : larutan percobaan yang dengan alkaloid tertentu membentuk
senyawa adisi yang tidak larut : Mayer LP (potassium mercuric
iodide), Dragendorf LP (bismuth potassium iodide), Marme LP
cadmium potassium iodide).
4. Golongan IV : larutan percobaan yang dengan alkaloid tertentu membentuk
ikatan asam organik : Hager LP (picric acid).
Piperin banyak ditemukan pada simplisia yang termasuk dalam keluarga Piperaceae
yaitu buah lada dari Piper nigrum L. (Piperaceae), buah aschanti (Piper clusii (Miq)
C.DC.), buah cabe jawa (Piper retrofractum Valh.), dan dalam biji dari Piper sp.
Tumbuhan yang termasuk jenis Piper sp mengandung 5-9% piperin; minyak atsiri
berwarna kuning berbau aromatis dengan kadar 1-2,5% yang mengandung piperonal,
eugenol, safrol, metil eugenol, dan miristisin; kavisin, senyawa isomer basa piperin, yang

12
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
berasa pedas; amilum; resin; berbagai senyawa monoterpena dan seskuiterpena; piperitin,
piperanin, dan piperilin yang berbeda dengan piperidin dalam hal panjang rantai samping
dan derajat kejenuhannya, misalnya kejenuhan cincin pirolidinnya. Piper nigrum
menghasilkan lada hitam dan lada putih. Lada hitam berasal dari buah lada yang belum
masak dikeringkan bersama kulitnya hingga kulit keriput dan berwarna hitam. Lada putih
berasal dari buah lada yang masak yang setelah dibersihkan dari kulitnya lalu dikeringkan,
hingga berwarna putih. Lada digunakan sebagai stomakik, karminatif, dan bumbu masak.
Piperin (rumus molekul C₇H₁₉NO₃) berupa kristal berbentuk jarum, berwarna
kuning, tidak berbau, tidak berasa, lama-kelamaan pedas, larut dalam etanol, benzena, dan
kloroform, titik lebur 125-1260C. Piperin memiliki banyak efek farmakologi yaitu sebagai
antiinflamasi, antimikroba, hepatoprotektor, antikanker dan meningkatkan efek antioksidan
sel (Singh & Duggal 2009). Piperin termasuk senyawa alkaloid golongan piperidin. Piperin
merupakan senyawa amida basa lemah yang dapat membentuk garam dengan asam
mineral kuat. Piperin bila dihidrolisis dengan KOH-metanolik akan menghasilkan kalium
piperinat dan piperidin. Piperin disari dari buah lada hitam atau lada putih dengan etanol,
dipisahkan dari seyawa resin dengan penambahan KOH-etanolik. Kristalisasi dilakukan
dengan etanol.

Gambar 2. Struktur piperin.

III. BAHAN DAN ALAT

A. BAHAN
Lada hitam atau lada putih, etanol 95%, KOH, anisaldehid-asam sulfat, aquades,
kertas saring, lempeng silika gel GF254, toluen, etil asetat.

B. ALAT
Seperangkat alat Sokhlet, timbangan, batang pengaduk, lampu spiritus, Beaker
glass, seperangkat KLT, glasswool.

IV. CARA KERJA

A. Analisis Golongan Alkaloid
Sampel yang diuji adalah serbuk buah lada, daun tembakau, daun teh. Sebanyak 2 g
sampel ditambahkan 5 mL amonia 25%, kemudian digerus di dalam mortar. Sebanyak
20 mL kloroform ditambahkan dalam mortar dan digerus kuat-kuat. Campuran disaring
dan filtrat yang diperoleh diteteskan pada kertas saring dan diberi beberapa tetes pereaksi
Dragendorff. Hasil positif alkaloid ditunjukkan dengan pembentukan warna merah atau
jingga pada kertas saring. Sisa filtrat diekstraksi dua kali dengan 10 mL asam hidroklorida
10%. Pada saat diekstraksi akan terbentuk dua lapisan, lapisan air-asam dan lapisan
organik. Kedua lapisan tersebut dipisahkan dan sebanyak 5 mL lapisan air dimasukkan
dalam tabung reaksi dan diuji menggunakan pereaksi Mayer. Hasil positif alkaloid
ditunjukkan apabila terbentuk endapan berwarna putih. Sebanyak 5 lapisan air tersebut
dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuji menggunakan pereaksi Dragendorff, hasil
positif alkaloid ditunjukkan apabila terbentuk endapan berwarna merah. Sebanyak 5 mL
lapisan air diuji dengan Bouchardat LP dan positif jika terjadi endapan coklat sampai hitam
(Farnsworth 1966).

B. Isolasi Piperin
Bungkus 30,0 g serbuk lada dengan kertas saring dan masukkan dalam alat sokhlet,
lalu tambahkan etanol 95% paling sedikit sebanyak satu setengah kali sirkulasi dengan
kecepatan 4-5 sirkulasi per jam. Penyarian dilakukan hingga filtrat tidak berwarna.
Sisihkan 3 mL dalam vial dan tutup. Uapkan sari hingga konsistensi kental. Lalu
tambahkan 10 mL KOH etanolik 10% sambil diaduk-aduk hingga timbul endapan. Setelah
mengendap, pisahkan sari dari bagian yang tak larut melalui glass wool. Filtrat didinginkan
di lemari es sampai pembentukan kristal optimal. Setelah terbentuk kristal, timbang kertas
saring, lalu gunakan untuk menyaring larutan. Cuci kristal dengan etanol dngin dan

13
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
keringkan dalam oven suhu 400C hingga kering, dan timbang kertas saring yang berisi
kristal piperin.

C. Analisis Hasil Isolasi Piperin

1. Hitung rendemen kristal hasil percobaan!
2. Lakukan pengamatan organoleptis kristal hasil percobaan!
3. Lakukan analisis umum alkaloid dan identifikasi terhadap ekstrak etanol hasil penyarian
sokhlet dan kristal hasil percobaan yang dilarutkan dalam etanol dengan kondisi :
i. Fase diam : Silika gel GF 254
ii. Fase gerak : toluen-etil asetat (70:30)
iii. Pembanding : piperin standar dalam etanol
iv. Deteksi : sinar tampak, UV 254 nm, UV 366 nm, anisaldehid-asam sulfat
(dipanaskan 1000C selama 10 menit)
4. Tentukan titik lebur dan jarak lebur kristal dan hitung kemurniannya!

V. PUSTAKA
Clarke EGC. 1969. Isolation and Identification of Drugs. Vol I. London: The
Parmaceutical Press. 27, 234,
Depkes RI [Departemen Kesehatan Republik Indonesia]. 1977. Materia Medika Indonesia.
Jilid 1. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia .
Farnsworth NR. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of
Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-277.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.
Kosasih dan Iwang S., penerjemah. Bandung: Penerbit ITB-Bandung.
Singh A and Duggal S. 2009. Piperine- Review of advances in pharmacology.
International Journal of Pharmaceutical Sciences and Nanotechnology 2(3):615-
620.
Stahl JB. 1969. Thin Layer Chromatography. New York: Spinger Verlag.Singh A, Duggal
S. 2009. Piperine-Review of Advances in Pharmacology International Journal of
Pharmaceutical Sciences and Nanotechnology 2(3):615-620.
Stahl E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi. Kosasih Padmawinata
dan Iwang Sudiro, penerjemah; Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Drug
Analysis by Chromatography and Microscopy.
WHO [World Health Organization]. 2004. WHO Monographs on Selected Medicinal
Plants. Vol 2. Geneva: World Health Organization.
Wiryowidagdo S. 2007. Kimia dan Farmakologi Bahan Alam. Jakarta: Buku Kedokteran
EGC.
LEMBAR KERJA

Materi : Isolasi dan Analisis Alkaloid I : Piperin

Ringkasan Uraian Kegiatan
Hari/Tanggal Kegiatan

14
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
A. ANALISIS GOLONGAN ALKALOID
Sampel Uji Dragendorf Uji Mayer Uji Bauchardat +/-

B. HASIL ISOLASI PIPERIN

1. Organoleptik

Organoleptik Hasil isolasi Teoritis dan Pustaka

Bentuk

Warna

Rasa

Bau
2. Rendemen
Kandungan teoritis piperin dalam simplisia = (......................, .......)

Bobot serbuk simplisia =

Bobot kristal =

Rendemen = Bobot kristal . X 100%

Bobot serbuk simplisia

3. Jarak Lebur
Jarak lebur teoritis piperin = (..............., ................)

Suhu mulai melebur =

Suhu akhir melebur =

Jarak lebur =

Kemurnian = ( 1 -│Titik lebur teoritis – Titik lebur praktek│) X 100%

│ Titik lebur teoritis │

15
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
 4. Identifikasi KLT
Fase diam :
Fase gerak :
Pereaksi pendeteksi :

Warna noda
Kode
Rf Pereaksi
bercak Visual UV 254 nm UV 366 nm
...........................

ACC Surakarta,
Surakarta, Praktikan,

.................................................... ………………………….....

16
-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat -
 ISOLASI DAN ANALISIS ALKALOID II
KOFEIN

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu melakukan isolasi
dan analisis alkaloid.

II. PENDAHULUAN
Theae Folium (daun teh) mengandung alkaloid golongan purin, antara lain kofein,
teofilin, dan teobromin. Dalam daun teh, kofein berada dalam prosentase hingga 5 %.
Kofein (1,3,7 trimetil xantin) berupa kristal jarum mengkilat warna putih, tidak
berbau dan berasa pahit. Kelarutan kofein dalam air (1 : 60 air, 1 : 5,5 air suhu 80 0C,
1 : 2 air mendidih), etanol (1 : 130) dan kloroform (1 : 7). Berat molekul : 194,2 dan titik
lebur : 2350C. Kofein pada manusia mempunyai efek stimulasi susunan saraf pusat,
relaksasi otot bronkus dan diuretik.
Berbeda dari alkaloid umumnya, kofein basa dapat dilarutkan dalam air. Oleh sebab
itu, ditambahkan basa agar kofein dalam bentuk basa bebasnya. Jika konsentrasi basa
terlalu tinggi dapat merusak kofein menjadi kofeidina. Ekstraksi dengan cara refluk atau
digesti dapat dilakukan untuk kofein, karena kofein bersifat termostabil. Penambahan asam
sulfat untuk mengendapkan MgO yang tidak tersaring dengan membentuk garam. Kofein
dalam fasa cair diekstraksi dengan klorofrom karena dalam suasana asam kelarutan kofein
dalam kloroform lebih besar dari kelarutan dalam air. Kofein yang terekstraksi dalam
klorofrom dicuci dengan NaOH untuk menghilangkan warna alaminya dan untuk
menetralkan kelebihan asam sulfat
O CH3
H3C N
N

N
O
N
CH3
Gambar 3. Struktur kofein.

III. BAHAN DAN ALAT

A. BAHAN
Theae Folium, MgO/CaO, NaOH, aquades, CHCl3, metanol, kapas, lempeng silika
gel GF254.

B. ALAT
Erlenmeyer 250 mL, gelas ukur, beaker glass, batang pengaduk, corong gelas,
corong pisah, erlenmeyer, cawan porselin, vial, seperangkat KLT.

IV. CARA KERJA

A. Analisis Golongan Alkaloid
Sampel yang diuji adalah serbuk daun teh. Sebanyak 2 g sampel ditambahkan 5 mL
amonia 25%, kemudian digerus di dalam mortar. Sebanyak 20 mL kloroform ditambahkan
dalam mortar dan digerus kuat-kuat. Campuran disaring dan filtrat yang diperoleh
diteteskan pada kertas saring dan diberi beberapa tetes pereaksi Dragendorff. Hasil positif
alkaloid ditunjukkan dengan pembentukan warna merah atau jingga pada kertas saring.
Sisa filtrat diekstraksi dua kali dengan 10 mL asam hidroklorida 10%. Pada saat diekstraksi
akan terbentuk dua lapisan, lapisan air-asam dan lapisan organik. Kedua lapisan tersebut
dipisahkan dan sebanyak 5 mL lapisan air dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuji
menggunakan pereaksi Mayer. Hasil positif alkaloid ditunjukkan apabila terbentuk
endapan berwarna putih. Sebanyak 5 lapisan air tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi
dan diuji menggunakan pereaksi Dragendorff, hasil positif alkaloid ditunjukkan apabila
terbentuk endapan berwarna merah. Sebanyak 5 mL lapisan air diuji dengan Bouchardat
LP dan positif jika terjadi endapan coklat sampai hitam (Farnsworth 1966).

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 17

 Uji khas golongan purin adalah uji Murexide. Caranya bahan uji diteteskan pada
drupple plate ditambah 1,5 ml H2O2 dan 5 tetes H2SO4 pekat, panaskan di waterbath
hingga kering, sisanya ditambah beberapa tetes amonia menghasilkan warna merah ungu.

B. Isolasi Kofein
Masukkan 50 g serbuk teh kering dalam Beaker glass 500 mL, tambahkan 25 gram
MgO dan 250 mL air. Panaskan dengan lampu spiritus selama 30 menit. Saring panas-
panas dengan kain saring. Ulangi dengan cara yang sama pada ampas. Tampung filtrat dan
tambahkan 25 mL H2SO4 10%, uapkan sampai 100 mL. Bila terjadi larutan koloidal,
saring. Masukkan larutan dalam corong pisah. Ekstraksi dengan 3 X 25 mL CHCl 3,
kumpulkan fase CHCl3, cuci dengan NaOH 10% dan pisahkan dengan corong pisah. Ambil
fase CHCl3 di bagian bawah, tampung dalam cawan petri. Cuci residu dengan 15 mL
CHCl3. Campur hasil cucian dengan ekstrak bersih. Uapkan ekstrak yang didapat sampai
kering.
Masukkan kristal kofein kasar dalam cawan porselin. Tutup cawan porselin dengan
corong yang di dalamnya telah diberi kertas saring berlubang-lubang. Tutup ujung corong
dan tempatkan kapas basah di sekeliling corong. Jaga agar air pada kapas basah tidak
menetesi kertas saring. Panaskan cawan porselin dengan lampu spiritus selama kurang
lebih lima belas menit. Cawan porselin didinginkan selama lima belas menit, kemudian
buka corong perlahan-lahan. Kumpulkan kristal kofein murni pada kertas timbang yang
telah ditara.

C. Analisis Hasil Isolasi Kofein

a. Hitung rendemen kristal yang diperoleh!
b. Amati organoleptis kristal yang diperoleh!
c. Tentukan titik lebur kristal yang diperoleh!
d. Lakukan analisis umum alkaloid pada kristal yang diperoleh!
e. Lakukan identifikasi dengan cara KLT dengan kondisi :
a. Fase diam : silika gel GF254
b. Fase gerak : kloroform: metanol (1:1)
c. Deteksi : UV 254 nm, semprot dengan larutan iodin alkohol, diikuti HCl-
alkohol setelah 1-2 menit, akan timbul bercak berwarna coklat
gelap
V. PUSTAKA
Clarke EGC. 1969. Isolation and Identification of Drugs. Vol I. London: The
Parmaceutical Press. 27, 234,
Depkes RI [Departemen Kesehatan Republik Indonesia]. 1977. Materia Medika Indonesia.
Jilid 1. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia .
Farnsworth NR. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of
Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-277.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.
Kosasih dan Iwang S., penerjemah. Bandung: Penerbit ITB-Bandung.
Stahl JB. 1969. Thin Layer Chromatography. New York: Spinger Verlag.Singh A, Duggal
S. 2009. Piperine-Review of Advances in PharmacologyInternational Journal of
Pharmaceutical Sciences and Nanotechnology 2(3):615-620.
Stahl E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi. Kosasih Padmawinata dan
Iwang Sudiro, penerjemah; Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Drug Analysis by
Chromatography and Microscopy.
WHO [World Health Organization]. 2004. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants.
Vol 2. Geneva: World Health Organization.
Wiryowidagdo S. 2007. Kimia dan Farmakologi Bahan Alam. Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 18

 LEMBAR KERJA

Materi : Isolasi dan Analisis Alkaloid II Kofein

Ringkasan Uraian Kegiatan
Hari/Tanggal Kegiatan

A. ANALISIS GOLONGAN ALKALOID

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 19

 Sampel Uji Dragendorf Uji Mayer Uji Bauchardat +/-

B. HASIL ISOLASI KOFEIN

1. Organoleptik

Organoleptik Hasil isolasi Teoritis dan Pustaka

Bentuk

Warna

Rasa

Bau

2. Rendemen
Kandungan teoritis kofein dalam simplisia = (......................,

.......)

Bobot serbuk simplisia =

Bobot ekstrak kasar =

Rendemen ekstrak kasar = Bobot kristal . X 100%

Bobot serbuk simplisia

Bobot kristal =

Rendemen = Bobot kristal . X 100%

Bobot serbuk simplisia

3. Jarak Lebur
Jarak lebur teoritis kofein = (..............., ................)

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 20

 Suhu mulai melebur =

Suhu akhir melebur =

Jarak lebur =

Kemurnian = ( 1 -│Titik lebur teoritis – Titik lebur praktek│ )X

100% │ Titik lebur teoritis │

4. Identifikasi KLT
Fase diam :
Fase gerak :
Pereaksi pendeteksi :
Warna noda
Gambar Kode
Rf Pereaksi
Kromatogram bercak Visual UV 254 nm UV 366 nm
...........................

ACC Surakarta,
Surakarta, Praktikan,

.................................................... ………………………….....

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 21

 ISOLASI DAN ANALISIS LEMAK DAN ASAM LEMAK

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu melakukan
isolasi dan analisis lemak dan asam lemak.

II. PENDAHULUAN
Lipid adalah ester dari asam lemak panjang dan alkohol. Lipid digolongkan
menjadi lemak, minyak lemak dan lilin. Perbedaannya adalah pada tipe alkohol, pada
lemak dan minyak lemak alkoholnya adalah gliserol, sedangkan lilin adalah alkohol
yang memiliki bobot molekul tinggi, misalnya setilalkolohol.
Lipid dapat diperoleh dari tanaman atau hewan. Fungsi utama lipid adalah
sebagai simpanan makanan (energi). Pemisahan lemak dan minyak lemak dapat
dilakukan dengan pemerasan secara dingin atau panas. Lemak dan minyak lemak
sering digunakan dalam kefarmasian, industri dan sebagai makanan. Banyak obat
yang mengandung lemak atau minyak lemak sebagai bahan dasar.
Lemak dan minyak lemak merupakan gliserida dari asam lemak. Perbedaan
lemak dan minyak lemak adalah konsistensi dan titik leburnya. Minyak lemak
berkonsistensi cair pada suhu kamar, sedangkan lemak berkonsistensi semipadat atau
padat pada suhu kamar. Konsistensi ini dipengaruhi oleh asam lemak yang dominan
terdapat pada lemak atau minyak lemak. Gliserida dari asam lemak tak jenuh
berbentuk cair, sedangkan gliserida dari asam lemak jenuh rantai panjang berbentuk
padat.
Minyak lemak dibedakan menjadi drying oil, semi drying oil, dan non-drying
oil. Klasifikasi ini berdasarkan kemampuan untuk mengabsorbsi oksigen dari udara.
Oksigen menjenuhkan ikatan rangkap untuk membentuk oksida sehingga terjadi
polimerisasi membentuk film/lapisan keras.
Contoh lipid yang digunakan dalam bidang kefarmasian yaitu :
 Minyak lemak : Oleum Sesami, Oleum Lini, Oleum Iecoris Aselli, Oleum
Cocos
 Lemak : Oleum Cacao, Adeps Lanae
 Lilin : Cera alba, Cetaceum
Trimiristin atau gliseril trimiristat merupakan lipida golongan lemak dan
banyak dijumpai pada minyak dan lemak nabati, antara lain dalam minyak kelapa
(Cocos nucifera L – Palmae) dan mentega pala/lemak pala (Myristica fragrans –
Myristiceceae). Trimiristin digunakan untuk memproduksi asam miristat dan miristisil
alkohol. Asam miristat adalah asam lemak mengandung C14 yang dihasilkan dari
penyabunan trimiristin dengan membebaskan gliserol. Trimiristin digunakan sebagai
bahan baku kosmetik antiperspirant, pemutih, pewarna lipstik, emolien.
Dalam biji pala selain mengandung trimiristin juga mengandung miristisin
(turunan fenilpropena) yang bersifat racun dan mempunyai aktivitas narkotik karena
strukturnya mirip amfetamin. Biji pala mengandung 5-15% minyak atsiri. Minyak
pala digunakan sebagai obat-obatan, diantaranya untuk stimulus sistem jantung, diare,
rematik, nyeri otot, sakit gigi.
Trimiristin berupa zat padat putih sampai kuning abu-abu, titik lebur 56-57ºC.
Tidak larut dalam air, larut dalam alkohol, benzen, kloroform, dan eter. Asam miristat
membentuk kristal dalam etanol dengan titik lebur 58,5ºC larut dalam alkohol absolut,
etanol, eter, benzen, dan kloroform.
Serbuk biji pala direfluk dengan kloroform. Padatan trimiristin dilakukan
penyabunan/saponifikasi yaitu direaksikan dengan basa dihasilkan asam miristat.

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 22

 Trimiristin Miristisin
Gambar 4. Struktur trimiristin dan miristisin
CH2OCOC13H27 CH2OH
│ │
CHOCOC13H27 + 3 KOH CHOH + 3 C13H27COOK
│ │
CH2OCOC13H27 CH2OH
Trimiristin Gliserol sabun (Kalium miristat)

C13H27COOK + HCl C13H27COOH +KOH

sabun (Kalium miristat) asam miristat

Gambar 5. Reaksi penyabunan trimiristin dan reaksi menjadi asam miristat

III. BAHAN DAN ALAT

A. BAHAN
Biji pala, kloroform, etanol 95%, kalsium klorida anhidrous, aseton, KOH
3,5% dalam etanol, HCl, es.
B. ALAT
Labu alas bulat, pendingin, seperangkat destilasi sederhana.

IV. CARA KERJA

A. Analisis golongan lemak pada simplisia
Sari biji pala kering dengan eter, lalu teteskan sari eter pada kertas saring.
Amati noda lemak yang jernih atau transparan.

B. Isolasi trimiristin
Serbuk biji pala (20 g) dan 100 mL kloroform direfluks selama 90 menit di
tangas air. Hasil refluks disaring dan filtrat dikeringkan dengan kalsium klorida dan
didiamkan beberapa saat dan disaring. Destilasikan filtrat yang didapat hingga
meninggalkan residu setengah padat. Residu dilarutkan dalam aseton 50 mL. Pada
pendinginan kristal, trimiristisin akan mengendap, saring, cuci dengan aseton dingin.
Kristal dikeringkan dan ditimbang.

C. Penyabunan trimiristin menjadi asam miristat

Trimiristin (5 g) dan 75 mL larutan 3,5% KOH dalam etanol, direfluks selama
1 jam. Hasil refluks ditambah 150 mL air dan etanol dihilangkan dengan didestilasi.
Sisa penguapan disaring, filtrat diasamkan dengan HCl dan didiamkan pada suhu
kamar sampai terjadi padatan asam miristat. Padatan disaring, dicuci dengan air,
dikeringkan dan ditimbang.

D. Analisis Hasil Isolasi

1. Hitung rendemen kristal trimiristin dan asam miristat yang diperoleh!
2. Amati organoleptis kristal yang diperoleh!
3. Tentukan titik lebur kristal yang diperoleh!

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 23

4. Lakukan identifikasi dengan cara KLT dengan kondisi :
a. Fase diam : silika gel
b. Fase gerak : petroleum eter- eter-asam asetat (90: 10: 1)
c. Deteksi : 0,5% rhodamin B etanolik menghasilkan bercak kuning atau
biru violet pada latar belakang merah jambu
25% asam sulfat, dipanaskan 230ºC, lipid berwarna coklat
muda
5. Lakukan analisis golongan lemak pada hasil isolasi
a. Uji noda lemak
Teteskan minyak lemak pada kertas saring, biarkan mengering. Amati noda
lemak yang jernih atau transparan.
b. Uji kelarutan
Masukkan sejumlah lemak dengan bobot tertentu pada tabung reaksi.
Tambahkan pelarut (petroleum eter, eter, kloroform, etanol 96%) tetes demi tetes
sampai lemak tepat larut.
c. Pembentukan sabun (saponifikasi)
Didihkan 1 g lemak dalam 2 mL larutan NaOH 2 N, tambahkan 3 mL air.
Amati yang terjadi.
Bagi larutan menjadi 3 bagian sama banyak. Tambahkan tabung I dengan
larutan HCl 2N, tabung II dengan kalsium klorida 2%, tabung III dengan
magnesium sulfat 2%. Amati yang terjadi.
d. Uji ketidakjenuhan
Masukkan 0,1 mL minyak lemak / 0,1 g lemak ke dalam tabung reaksi,
tambahkan kloroform 5 ml, lalu teteskan pereaksi Hubl sampai warna iodium
dalam kloroform tetap, yaitu ungu. Catat volume pereaksi Hubl yang digunakan.
Percobaan juga dilakukan terhadap minyak lemak (minyak jagung, minyak
kelapa, dan campurannya) serta asam lemak asam stearat dan asam oleat.

V. PUSTAKA
Alegantina S, Mutiatikum D. Pengembangan dan Potensi Pala (Myristica
fragrans).Jur. Kefarmasian Indo. 1 (2):64-70.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Kosasih dan Iwang S., penerjemah. Bandung: Penerbit ITB-
Bandung.
Sastrohamidjojo H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Yogyakarta: Universitas Gadjah
Mada.

LEMBAR KERJA

Materi : Isolasi dan Analisis Lemak dan Asam Lemak

Ringkasan Uraian Kegiatan
Hari/Tanggal Kegiatan

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 24

 Hari/Tanggal Kegiatan

A. ANALISIS GOLONGAN LEMAK PADA SIMPLISIA

Hasil uji noda lemak :

B. HASIL ISOLASI TRIMIRISTIN

1. Organoleptik

Organoleptik Hasil isolasi Teoritis dan Pustaka

Bentuk

Warna

Rasa

Bau

2. Rendemen
Kandungan teoritis trimiristin dalam simplisia = (......................, .......)

Bobot serbuk simplisia =

Bobot trimiristin =

Rendemen = Bobot kristal . X 100%

Bobot serbuk simplisia

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 25

 3. Jarak Lebur
Jarak lebur teoritis trimiristin = (..............., ................)

Suhu mulai melebur =

Suhu akhir melebur =

Jarak lebur =

Kemurnian = ( 1 -│Titik lebur teoritis – Titik lebur praktek│ ) X 100%

│ Titik lebur teoritis │

C. HASIL PENYABUNAN TRIMIRISTIN

1. Organoleptik

Organoleptik Hasil isolasi Teoritis dan Pustaka

Bentuk

Warna

Rasa

Bau

2. Rendemen
Bobot trimiristin =

Bobot asam miristat =

Rendemen = Bobot asam miristat . X 100%

Bobot trimiristin

3. Jarak Lebur
Jarak lebur teoritis trimiristin = (..............., ................)

Suhu mulai melebur =

Suhu akhir melebur =

Jarak lebur =

Kemurnian = ( 1 -│Titik lebur teoritis – Titik lebur praktek│ ) X 100%

│ Titik lebur teoritis │

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 26

 4. Identifikasi KLT
Fase diam :
Fase gerak :
Pereaksi pendeteksi :
Warna noda
Gambar Kode
Rf Pereaksi
Kromatogram bercak Visual UV 254 nm UV 366 nm
...........................

C. ANALISIS GOLONGAN LEMAK/MINYAK LEMAK

Uji
Sampel Uji kelarutan
Noda lemak
PE Eter kloroform Etanol

Hasil uji pembentukan sabun

Hasil uji ketidakjenuhan

ACC Surakarta,
Surakarta, Praktikan,

.................................................... ………………………….....

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 27

 ANALISIS METABOLIT SEKUNDER LAIN

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat memahami dan melakukan
analisis metabolit sekunder lain.

II. PENDAHULUAN
Kandungan kimia tanaman pada umumnya dapat dikelompokkan menjadi :
minyak atsiri, karotenoid, steroid, triterpenoid, alkaloid, asam lemak, senyawa fenolik
yang meliputi fenol-fenol, asam fenolat, fenilpropanoid, flavonoid, antrakuinon,
antosian, xanton, glikosida, saponin, tanin, dll (Anonim 1987).

III. BAHAN DAN ALAT

A. Bahan
Serbuk simplisia, heksana /petroleum eter, kloroform/eter, etanol, aquades,
kertas saring, HCl, amonia, NaOH, gelatin, FeCl3, asam sulfat, asam asetat anhidrida,
pereaksi Stiassny.

B. Alat
Oven, waterbath, Beaker glass, tabung reaksi, corong kaca, vial, seperangkat
KLT, alat gelas lain.

IV. CARA KERJA

1. Preparasi sampel
Sebanyak 1 g sampel dipanaskan dalam 100 mL air suling dan dididihkan
selama 15 menit, kemudian disaring, dan diperoleh filtrat A. Sampel yang digunakan :
a. Analisis saponin : buah lerak/buah pare
b. Analisis tanin : daun jambu biji
c. Analisis antrakuinon : akar kelembak
d. Analisis steroid/triterpenoid : herba sambiloto

2. Analisis Saponin
Sebanyak 10 mL filtrat A dimasukkan ke dalam tabung reaksi dikocok vertikal
selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Hasil positif bila terbentuk
busa yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit dengan tinggi busa lebih dari
atau sama dengan 1 cm. Kemudian ditambahkan beberapa tetes asam hidroklorida 2N.
Hasilnya, apabila busa tidak hilang maka positif mengandung saponin (Farnsworth
1966).

3. Analisis Fenolik dan Tanin

Sebanyak 15 mL filtrat A dibagi ke dalam tiga tabung reaksi. Tabung pertama
ditambahkan dengan besi (III) klorida. Hasil positif fenol ditunjukkan dengan
terbentuknya warna hijau, ungu, biru, atau hitam. Hasil positif tanin ditunjukkan oleh
biru kehitaman jika tanin galat atau hijau kehitaman jika tanin katekol (Depkes RI
1987).
Tabung kedua ditambahkan dengan gelatin. Hasil positif tanin ditunjukkan
dengan terbentuknya endapan putih.
Tabung ketiga ditambahkan dengan pereaksi Stiasny (formaldehida 30% -
asam hidroklorida pekat 2:1). Hasil positif tanin katekat ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan merah muda. Hasil dari tabung ketiga disaring dan pada filtrat
ditambahkan natrium asetat dan besi (III) klorida. Hasil positif tanin galat ditunjukkan
dengan terbentuknya endapan biru tinta (Farnsworth 1966).

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 28

4. Analisis Antrakuinon
Sebanyak 5 mL filtrat A ditambahkan dengan beberapa tetes larutan amonia
25% atau larutan natrium hidroksida 10%, lalu dikocok (Reaksi Borntrager). Hasil
positif antrakuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah (Depkes RI 1987).

5. Analisis Steroid/Triterpenoid
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 mL n-heksana selama 2 jam,
kemudian disaring dan diperoleh filtrat B. Sebanyak 5 mL filtrat B diuapkan dalam
cawan penguap. Residu ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard
yang berisi anhidrida asetat dan asam sulfat pekat (2:1). Hasil positif steroid
ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru sampai hijau. Terbentuknya warna
merah sampai ungu menunjukkan positif triterpenoid (Farnsworth 1966).

V. PUSTAKA
Farnsworth NR. 1966. Biological and phytochemical screening of plants. Journal of
Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-277.
[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1987. Analisis Obat
Tradisional. Jakarta: Depkes RI.

LEMBAR KERJA

Materi : Analisis Metabolit Sekunder Lain

Ringkasan Uraian Kegiatan
Hari/Tanggal Kegiatan

A. Identitas Tanaman
Nama Latin tanaman :
Nama daerah :
Bagian tanaman :
Sistematika tanaman :

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 29

 B. ANALISIS METABOLIT SEKUNDER (selain alkaloid, flavonoid, minyak atsiri)
Kandungan Baku dan Hasil Hasil Sampel Interpretasi
senyawa Hasil Sampel
Saponin Baku : Sampel :

Fenolik Baku : Sampel :

dan Tanin

Antrakuinon Baku : Sampel :

Triterpen/ Baku : Sampel :

Steroid

ACC Surakarta,
Surakarta, Praktikan,

.................................................... ………………………….....

-Petunjuk Praktikum Isolasi dan Analisis Tumbuhan Obat - 30