ANALISIS BAHAN KIMIA OBAT

FENILBUTAZON DAN PIROXICAM DALAM

SEDIAAN JAMU ASAM URAT DENGAN
MENGGUNAKAN METODE
KLT-SPEKTROFOTODENSITOMETRI
Anggota Kelompok . .

• I Gede Pasek Winantara Putra (1008505020)

• Ni Wayan Ika Himawari (1008505074)
• Desak Made Asrini Kencanasari (1008505081)
 BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang

Obat tradisional

Pengobatan alternatif

Perlu jangka waktu lama untuk memberikan

efek terapi
Penambahan BKO oleh produsen untuk mengatasi
kurang cepatnya efek

Obat tradisional dilarang mengandung BKO

Penambahan BKO pada OT melanggar regulasi dan

membahayakan pasien
Jamu asam urat frekuensi penggunaan cukup tinggi

Sering ditambahkan fenilbutazon dan piroksikam

Efek samping Fenilbutazon: kerusakan pada darah dan

lambung; piroksikam: tukak duodenum, tukak lambung
gagal ginjal, kerusakan hati, dll
Penggunaan fenilbutazon dan piroksikam membahayakan
pasien

Diperlukan metode kontrol untuk identifikasi fenilbutazon

dan piroksikam

Salah satunya dengan metode KLT-

spektrofotodensitometri
 TUJUAN

Untuk mengetahui keberadaan bahan kimia obat

fenilbutazon dan piroksikam pada sediaan jamu
asam urat dengan metode KLT-
Spektrofotodensitometri.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Tinjauan Obat Tradisional
• Definisi Obat Tradisional
Menurut undang-undang republik Indonesia nomor
36 tahun 2009 tentang kesehatan, yang dimaksud
dengan obat tradisional adalah bahan atau ramuan
bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan
hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik)
atau campuran dari bahan-bahan tersebut yang
secara tradisional telah digunakan untuk
pengobatan berdasarkan pengalaman, dan dapat
diterapkan sesuai dengan norma yang berlaku
dimasyarakat.
• Dalam penggunaannya maupun dalam
perdagangan ada beberapa macam bentuk obat
tradisional yaitu: rajangan serbuk, pil, dodol/jenang,
pastilles, kapsul, tablet, cairan obat, sari jamu,
parem, pilis, tapel, koyok, dan salep/krim (MenKes
RI, 1994).
 JAMU
• Jamu harus memenuhi kriteria yaitu aman sesuai
dengan persyaratan yang ditetapkan, klaim khasiat
dibuktikan berdasarkan data empiris dan memenuhi
persyaratan mutu yang berlaku. Jenis klaim
penggunaan sesuai dengan jenis pembuktian
tradisional dan tingkat pembuktiannya yaitu tingkat
pembuktian umum dan medium (BPOM RI, 2004;
BPOM RI, 2005).
 Fenilbutazon
• Kelarutan : sangat larut dalam air, larut dalam 28 bagian
etanol, mudah larut dalam 1,25 bagian kloroform, larut dalam 15
bagian eter, mudah larut dalam aseton, dan larut dalam larutan
alkali.
• pKa : 4,4
• Koefisien partisi log P (Oktanol/pH 7,4) 0,7; (oktanol/air) 3,2.
• Identifikasi dengan KLT menggunakan sistem TE memberikan nilai
Rf 65; sistem TF-Rf 68, panjang gelombang maksimal : Asam-237
dan Basa-264
 Piroksikam
• Kelarutan : sangat sukar larut dalam air, dalam asam-
asam encer dan sebagian besar pelarut organic; sukar larut
dalam etanol dan dalam larutan alkali mengandung air.
• pKa : 6,3
• Koefisien partisi log P (oktanol/air) 3,1.
• Identifikasi dengan KLT menggunakan sistem TE
memberikan nilai Rf 17; sistem TF-Rf 38
Solid Phase Extraction (SPE)
• Prinsip proses ekstraksi adalah interaksi polar dan/atau
non polar tergantung dari sifat campuran yang akan
dimurnikan dan karakteristik fisik dari penyangga padat
(Pignataro, 2009).
Thin Layer Chromatography
(TLC)
• Prinsip KLT adalah pemisahan komponen-komponen
atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase
diam di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut
pengembang campur.
Spektrofotodensitometri
• Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan
interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis
dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi
elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh
analit, ditransmisi atau diteruskan jika plat yang
digunakan transparan
Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
dengan TLC-Spektrofotodensitometri

• Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-spektrofotodensitometri
dapat dilakukan dengan membandingkan parameter Rf.
Dua senyawa murni dikatakan identik jika memiliki harga
Rf yang sama jika diukur pada kondisi yang sama.
• Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif pada plat KLT dapat dilakukan
berdasarkan hubungan antara luas area puncak (AUC)
kromatogram senyawa tersebut dengan konsentrasinya.
Luas area puncak suatu senyawa berbanding lurus
dengan kadar senyawa yang terkandung dalam noda
(Sherma and Fried, 1994).
 Validasi Metode

Pada penelitian ini validasi yang dilakukan hanya

pada parameter :
• Presisi
• Linieritas dan rentang
• Spesifisitas
• LOD.
 BAB III
METODE ANALISIS
ALAT
• Alat yang digunakan meliputi alat-alat gelas yang umum dipakai
dalam laboratorium analitik, seperti pipet ukur (IWAKI Pyrex),
labu ukur (IWAKI Pyrex), gelas beaker (IWAKI Pyrex),
Erlenmeyer (IWAKI Pyrex), dan vial. Selain itu, juga digunakan
pipet mikro, timbangan analitik (AND GR-200), pipet tetes,
ballfiller, oven (Memmert), alat pengaduk mekanik (Ika vibrax
VXR basic), pompa vakum (Gast), pH meter (Oakton), penotol
Linomat V, TLC-Scanner (CAMAG Spektrootodensitometer
TLC-Scanner 3), bejana kromatografi (CAMAG-Mutenz-
Switzerland).
BAHAN
• Bahan kimia dan pelarut yang digunakan pada penelitian
ini mempunyai derajat kemurnian pro analisis (Merck-
Germany) antara lain: metanol, natrium hidroksida
(NaOH), etil asetat, buffer fosfat (KH2PO4), n-heksan,
dan aquades. Bahan yang diteliti yaitu fenilbutason dan
piroksikam diperoleh dari BPOM RI. Fase diam yang
digunakan adalah plat TLC silika gel 60 F254 (Merck-
Germany). Kolom SPE Strata Screen C (Phenomenex).
 Prosedur Kerja
Penyiapan Larutan
1. Pembuatan Larutan Natrium Hidroksida 0,2 M
2. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (KH2PO4) 0,1 M
pH 6
3. Pembuatan Larutan Stok Baku 2 mg/mL
4. Pembuatan Larutan Baku Kerja 500 µg/mL
5. Pembuatan Larutan Campuran (Dibuat larutan
campuran senyawa fenilbutazon dan piroksikam
dengan konentrasi 50 µg/mL )
6. Pembuatan Larutan Standar Pembanding
7. Pembuatan Larutan Standar Pembanding
Untuk pembuatan larutan standar pembanding
disiapkan 4 seri larutan campuran senyawa
asam (fenilbutazon dan piroksikam) dengan
variasi konsentrasi sebesr 5, 50, 100, dan 500
µg/mL.
8. Pembuatan Fase Gerak
• Pembuatan fase gerak sistem TE
Etil asetat: metanol: amonia (85:10:5 v/v)
• Pembuatan fase gerak sistem TF  Etil asetat
sebagai fase gerak.
 Pemisahan dengan SPE

• Pembuatan Kolom SPE

Di siapkan kolom SPE Strata Screen C yaitu
kolom yang terbuat dari campuran oktilsilan
(C8) dan asam benzene sulfonat. Kolom
kemudiaan dielusi berturut-turut dengan
menggunakan 3 mL metanol, dilanjutkan
dengan 3 mL air, dan 3 mL dapar fosfat 0,1 M
pH 6, laju alir diatur 1,5 mL/menit
menggunakan alat vakum.
Multi Step SPE
• Disiapkan sebuah vial diisi dengan 500 µL larutan
baku kerja 500µg/mL lalu ditambahkan dapar
fosfat 500 µL 0,1 M pH 6. Larutan campuran
tersebut diaduk dengan pengaduk mekanik
selama 30 menit. Larutan campuran tersebut
dimasukkan ke dalam kolom, dibiarkan mengalir
(tanpa divakum). Kolom dicuci dengan pengelusi
berturut-turut dengan 1 mL larutan dapar fosfat
0,1 M pH 6; 1 mL asam asetat 0,1 M; dan 500 µl
heksana. Laju alir elusi diatur pada 1,5 mL/menit
dengan alat vakum. Fraksi ditampung sebagai
fraksi nol (F0).
• Kolom SPE dielusi 3 kali dengan 500 µL
metanol untuk mengelusi senyawa asam (FA).
Masing-masing ekstrak yang diperoleh
ditampung dalam vial dan diuapkan pada suhu
tidak lebih dari 60oC diatas penangas air.
Ekstrak direkonstitusi menggunakan 100 µL
methanol. Percobaan ini diulang sebanyak 3
kali pengulangan.
 Pemisahan dengan KLT-
Spektrofotodensitometri
• Preparasi plat KLT
Plat KLT dipotong dengan ukuran yang
dibutuhkan, kemudiaan dielusi dengan 10 mL
methanol dalam bejana kromatograf sampai
tepi atas plat. Selanjutnya plat diaktivasi
didalam oven pada suhu 120o C selama 30
menit.
• Pengembangan plat dengan fase
gerak
Sistem KLT TE dan TF digunakan untuk fraksi
nol dan asam. Disiapkan 1 buah plat untuk
fraksi nol dan asam. Plat ditotolkan dengan
fraksi hasil ekstraksi dengan SPE (asam) dan
larutan standar sesuai dengan gambar di
bawah ini:
 Batas elusi

Keterangan :
Spot 1 : 2 µL Fraksi nol (F0) hasil SPE
Spot 2 : 2 µL Fraksi asam (FA) hasil SPE
Spot 3 : 2 µL larutan standar 500 µg/mL

1 2 3
Penotolan awal
1 cm

1 cm
Identifikasi dan Penetapan Kadar
BKO dengan
KLT-Spektrofotodensitometer

• Penentuan panjang gelombang maksimum

Penentuan panjang gelombang pengukuran
dilakukan dengan menotolkan masing-masing
senyawa standar asam hingga 1000 ng pada
plat KLT yang telah dielusi dengan metanol.
Plat tersebut selanjutnya dielusi dengan
metanol. Plat tersebut selanjutnya dielusi
dengan sistem KLT yang sesuai.
• Plat yang telah kering selanjutnya dipindai
dengan spektrofotodensitometer dan
dibuat spektrumnya dari panjang
gelombang 190-400 nm. Panjang
gelombang pengukuran ditentukan dari
panjang gelombang maksimum masing-
maisng senyawa berdasarkan data
spektrum yang diperoleh.
Identifikasi Bahan Kimia Obat
(Analisis kualitatif)
• Pemisahan dengan SPE
Sampel jamu yang diduga mengandung BKO
(fenilbutazon dan piroksikam) ditimbang
sebanyak 1 gram kemudian dilarutkan dengan
buffer fosfat pH 6 sebanyak 1 mL dalam vial
dan diaduk dengan pengaduk mekanik selama
30 menit. Sampel dielusi pada kolom SPE.
Larutan campuran tersebut dimasukkan
kedalam kolom, dibiarkan mengalir (tanpa
divakum). asetat 0,1 M; dan 500 µl heksana.
• Kolom dicuci dengan pengelusi berturut-turut
dengan 1 mL larutan dapar fosfat 0,1 M pH 6; 1
mL asam. Laju alir elusi diatur pada 1,5
mL/menit dengan alat vakum. Fraksi ditampung
sebagai fraksi nol (F0). Kolom SPE dielusi 3 kali
dengan 500 µL metanol untuk mengelusi
senyawa asam (FA). Masing-masing ekstrak
yang diperoleh ditampung dalam vial dan
diuapkan pada suhu tidak lebih dari 60oC diatas
penangas air. Ekstrak direkonstitusi
menggunakan 100 µL methanol. Percobaan ini
diulang sebanyak 3 kali pengulangan.
Identifikasi dengan
KLT-Spektrofotodensitometer

• Plat KLT dipotong dengan ukuran yang

dubutuhkan, kemudiaan dielusi dengan 10 mL
methanol dalam bejana kromatograf sampai
tepi atas plat. Selanjutnya plat diaktivasi
didalam oven pada suhu 120o C selama 30
menit. Sistem KLT TE dan TF digunakan untuk
fraksi nol dan asam.
• Disiapkan 1 buah plat untuk fraksi nol dan
asam. Plat ditotolkan dengan fraksi hasil
ekstraksi dengan SPE (asam) dan larutan
standar sesuai dengan gambar di atas. Plat
yang telah kering selanjutnya dipindai dengan
spektrofotodensitometer dan dibuat
spektrumnya pada panjang gelombang
maksimum masing-masing senyawa.
 BAB IV
PEMBAHASAN
• Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan suatu
sistem KLT-Spektrofotodensitometri yang mampu
digunakan sebagai metode untuk uji kualitatif BKO yang
diduga ditambahkan ke dalam obat tradisional.

• Digunakan dua jenis fase gerak untuk senyawa asam

yaitu etil asetat (sistem TF) dan etil asetat: metanol:
ammonia (85:10:5 v/v) (sistem TE).

• Fase diam yang digunakan adalah plat Alumunium TLC

Si 60 GF254.

• Penelitian yang dilakukan dimulai dari proses ekstraksi

pemisahan senyawa BKO yaitu fenilbutazon dan
piroksikam yang berupa senyawa asam menggunakan
metode SPE Copolymeric Cation-Exchange dengan
teknik ekstraksi multi step.
• Dilakukan 2 tahap ekstraksi dengan eluen yang berbeda
dikerjakan dalam 1 kolom secara berurutan dengan tujuan
untuk memperoleh fraksi netral dan asam sekaligus.
• Fase diam yang digunakan merupakan fase diam
copolymeric cation-exchange yang terdiri dari campuran
silica C8 dan asam benzene sulfonat sehingga dapat
digunakan untuk mengekstraksi senyawa asam dan basa.
Senyawa asam dipisahkan melalui mekanisme ikatan
hidrofobik dengan silika C8 (Telephchak et al., 2004).

• Asam benzene sulfonat merupakan gugus yang bersifat

asam kuat (pKa < 1) yang dapat menarik kation ketika
kontak dengan larutan (Supelco, 1998).
• Sampel yang diekstraksi ditambahkan larutan dapar fosfat
0,1 M pH 6 sebelum dimasukkan kedalam kolom SPE.
Pada pH ini diharapkan senyawa yang bersifat asam akan
berada dalam bentuk tak terionkan. Senyawa asam akan
terikat secara hidrofobik pada C8 melalui ikatan Van Der
Waals (Teleohchak et al, 2004)
• Tahapan terakhir dari prosedur SPE adalah pengelusian
analit yang tertahan pada fase diam dalam kolom SPE.
Senyawa yang lebih dahulu dielusi adalah senyawa BKO
yang bersifat asam dengan menggunakan metanol.
• Pemilihan metanol sebagai eluen senyawa asam
didasarkan pada kelarutan senyawa BKO asam
(fenilbutazon dan piroksikam) yang memiliki kelarutan
yang baik dalam metanol sehingga metanol secara efektif
mampu memecah ikatan hidrofobik yang terjadi antara
analit dengan fase diam.
• Pemisahan senyawa menggunakan kromatografi lapis
tipis yang sebelum digunakan plat KLT terlebih dahulu
harus dicuci dengan metanol dan diaktivasi pada suhu
1200C selama 30 menit

• Pemisahan dengan metode KLT-Spektrofotodensitometri

dilakukan terhadap fraksi yang diperoleh dari proses
SPE. Fraksi asam (fenilbutazon dan piroksikam).

• Panjang gelombang pengukuran ditentukan dari panjang

gelombang maksimum tiap senyawa BKO pada sistem
fase gerak, Panjang gelombang yang telah ditentukan dari
tiap senyawa BKO pada fase gerak digunakan untuk
mengukur luas area puncak (AUC) pada saat uji validasi
metode analisis.
• senyawa akan memberikan serapan yang maksimal
sehingga menghasilkan luas area puncak (AUC) yang
tepat. Tentunya hal ini akan berpengaruh terhadap
penetapan batas deteksi (LOD) dan presisi AUC dari tiap
senyawa yang dianalisis.

• Dalam kromatografi dihindari pemilihan panjang

gelombang maksimum suatu senyawa yang berada
dibawah dari 200 nm agar serapan senyawa yang
dihasilkan tidak menggangu oleh CO2, O2, H2O yang
memberikan serapan cukup besar pada panjang
gelombang di bawah 200 nm (Sherma dan Fried, 1994).
Thank You

Kingsoft Office
Make Presentation much more fun
@Kingsoft_Office

kingsoftstore