ksisitas Akut Dengan BSLT ( Brine Shrimp Letality Test )

I. Tujuan Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT Mengetahui cara perhitungan LD50 dengan metode BSLT Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan metode BSLT Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa probit. Landasan Teori Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai atau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit). Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan, pemaparan bahan kimia terhadap organism tingkat rendah seperti bakteri dan kultur sel-sel dari mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia. Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat di lakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk uji aktifitas farmakologi dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach. Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi. Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini sering dikaitkan digunakan dalam penelitian bahan alam. Peranan antioksidan sangat penting dalam meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh. Radikal dengan metode penapiasan senyawa antikanker. Dengan alas an-alasan tersebut, maka uji ini sangat tepat

II.

bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses metabolisme normal, dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif. Reaksi radikal bebas secara umum dapat dihambat oleh antioksidan tertentu baik alami maupun sintetis. Sebahagian besar antioksidan alami berasal dari tanaman, antara lain berupa senyawaan tokoferol, karatenoid, asam askorbat, fenol, dan flavonoid. Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi, oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian. Salah satu organisme yang sesuai untuk hewan uji adalah brine shrimp (udang laut). Untuk mengetahui toksisitas ekstrak daun dalam penelitian ini digunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) dan untuk mengetahui aktivitas ekstrak daun sebagai antioksidan digunakan metode DPPH (-1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Pengukuran antioksidan secara Efek peredaman radikal bebas DPPH merupakan metode pengukur an antioksidan yang sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya uji lain (xantin-xantin oksidase, metode Tiosianat, antioksidan total). Hasil pengukuran menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum tidak berdasar jenis radikal yang dihambat. Pada metode ini, DPPH berperan sebagai radikal bebas yang diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana DPPH akan bereaksi dengan antioksidan tersebut membentuk 1,1,-difenil-2- pikril hidrazin. Reaksi ini menyebabkan terjadinya perubahan warna yang dapat diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada 515 nm, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan.

Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Metode Meyer et al.

digunakan untuk

mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan telur udang ( Artemia salina Leach). Penetasan Larva Udang, disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan + 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.

Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Sebanyak 100 L air laut yang mengandung larva udang sebanyak 10-12 ekor dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam

wadah uji. Di tambahkan larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 100 L, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500 dan 1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan (triplikat). Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang. Angka mati dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (3 lubang). Angka hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam setiap konsentrasi (3 lubang).Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi mati untuk konsentrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi tersebut, akumulasi mati untuk konsentrasi 100 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100n ppm, akumulasi mati untuk konsentrasi 200 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka mati dihitung sampai konsentrasi 1000 ppm. Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi hidup untuk konsentrasi 1000 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 500 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 200 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka hidup dihitung sampai konsentrasi 10 ppm. Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian 50% yang diperoleh dengan memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.

III.

Alat dan Bahan Kotak penetasan larva Mikro pipet 2-20 L Mikro pipet 20-200 L Wellplate Kaca pembesar Tabung reaksi Labu ukur kotak steroform

IV.

Prosedur kerja a.Penetasan larva

b.Orientasi konsentrasi

V.

HASIL PENGAMATAN Analisis data BSCT dengan analisis Probit Kelas Konsentrasi Log C Hidup mati ppm (y) A 10000 4 10 Ekstrak 1000 3 10 BINTARO 100 2 10 10 1 10 1 0 10 0,1 -1 10 B 10000 4 10 Ekstrak 1000 3 1 9 Alpukat 100 2 4 6 10 1 5 5 1 0 2 8 0,1 -1 3 7 Ket : Digunakan regresi linier Y = a + bx Probit = a + b (log C) a = 3,26715 b = 1,21853 r = 0,9271

% kematian 100 100 100 100 100 100 100 90 60 50 80 70

Probit 8,7190 8,7190 8,7190 8,7190 8,7190 8,7190 8,7190 6,2816 5,2533 5,000 5,8416 5,5244

Lc 50

26,4338 ppm

di hitung LC 50 ? LC 50 = (5-a)/b LC 50 = (5-3,26715)/1,21853 LC 50 = 1,42216 Antilog LC 50 = 26,4338 ppm

Analisis data BSCT dengan analisis Reed-Munch Konsentrasi kelas hidup mati mati ppm hidup B 0,1 11 19 19 45 Ekstrak 1 7 23 42 34 Alpukat 10 13 17 59 27 100 13 17 76 14 1000 1 29 105 1 10000 0 30 135 0 Di hitung : h= 50%-a/(b-a) h : ukuran jarak a : % yang menyebabkan kematian lebih kecil dari 50 % b : % yang menyebabkan kematian lebih besar dari 50 % h = (50%-29,68%)/(55,26%-29,68%) Di hitung : i = log kematian diatas 50% / kematian dibawah 50% i : log kenaikan dosis i = log 1/0,1 i = log 10 i=1 Di hitung : g=hXi g : hasil kali dari ukuran jarak dan log kenaikan dosis g = 0,749 X 1 g = 0,749 DI hitung : y = g + log kematian lebih kecil dari 50 % y : hasil penjumlahan g dan log kematian kecil dari 50 % y = 0,749 + log 0,1 y = 0,749 1 y = - 0,206 LC 50 = anti log y LC 50 = anti log 0,206 LC 50 = 0,6223 ppm

total 64 76 86 90 106 135

ratio 19/64 42/76 52/79 76/90 105/106 135/135

% kematian 29,68 55,26 68,6 84,4 99,0 100

LC 50

0,6223 ppm

Analisis data BSCT dengan analisis Farmakope kelas Konsentrasi Log Hidup Mati ppm dosis 0,1 -1 11 19 1 0 7 23 B 10 1 13 17 Ekstrak 100 2 13 17 Alpukat 1000 3 1 29 10000 4 0 30

mati 63 76 56 56 96 100

Pi 0,63 0,76 0,56 0,56 0,96 100

Pi

LC 50

4,47

1,071 ppm

Di hitung : m = a b ( Pi 0,5) Pi : % kematian terhadap % seluruh hewan yang dicobakan. m = 4 1 (4,47 0,5) m = 4 1 (3,97) m = 4 3,97 m = 0,03 LC 50 = anti log m LC 50 = anti log 0,03 LC 50 = 1,071 ppm VI. Pembahasan Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) merupakan uji toksisitas yang digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni. Pada praktikum kali ini larva udang yang digunakan adalah jenis Artemia salina yang telah berumur 48 jam dan proses pembenihan telur udang yang digunakan adalah sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan dalam air garam dengan kadar 38% (38 gram dalam 1liter air) hal ini dilakukan sebagai simulasi dari habitat asli udang yaitu air laut. Adapun ekstrak yang digunakan adalah ekstrak buah alpukat dan bintaro yang dibuat larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu mulai dari 10000, 1000, 100, 10, 1 dan 0,1 ppm. Hal ini bertujuan untuk mengetahui LC50 dari masing - masing ekstrak tersebut dengan berbagai konsentrasi. Pada prakteknya dengan perlakuan yang sama yaitu larutan ekstrak yang dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 10 buah larva dengan 10 ml larutan (9 ml air garam dan ekstrak sebanyak 1 ml). Ekstrak bintaro menunjukkan hasil data yang error, hal ini ditunjukkan dengan adanya kematian pada semua larva udang di berbagai konsentrasi. Adapun untuk ekstrak alpukat menunjukkan hasil bahwa dengan naiknya konsentrasi maka larva udang yang mati semakin banyak, tetapi pada konsentrasi 1 dan 0,1 ppm tidak menunjukkan hal denmikian, sehingga data yang dipakai adalah pada konsentrasi 10000

sampai 100 ppm. Selain itu percobaan dilakukan triplo agar didapat data statistik yang baik sehingga, dapat dihitung secara statistik dari data tersebut. Dalam penentuan nilai LC50 ini dapat dilakukan dengan 3 cara/metode, yaitu : 1. 2. 3. Perhitungan probit analisis Reed-Munch analisis Farmakope

Dalam perhitungan dengan metode analisis probit, diperlukan tabel probit dan rumus regresi liniear untuk menentukan nilai a, b dan r. Kemudian dimasukkan dalam rumus X 50 = (b-a)/b dan kemudian dapat ditentukan nilai LC50. Adapun hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini menunjukkan hasil bahwa LC50 adalah 26,438 ppm. Sedangkan dalam perhitungan dengan metode analisis Reed-Munch sebelumnya harus diketahui jumlah larva yang mati dan hidup. Yang kemudian dihitung ukuran jarak (h) = (50%-a)/(b-a) , kenaikan dosis (i) = log kematian diatas 50 %/kematian dibawah 50% , nilai (g) = h X I , nilai (y) = g + log kematian lebih kecil dari 50 %, kemudian dapat ditentukan bahwa: nilai LC 22,54 ppm. Perhitungan data BSLT dengan metode yang ketiga yaitu dengan analisis Farmakope. Terlebih dahulu dicari nilai Pi dan sigma Pi untuk selanjutnya dimasukkan dalam rumus : m = a b ( Pi 0,5) dicobakan a = dosis terendah yang dapat menyebabkan kematian 100% b = beda log dosis yang berurutan selanjutnya dapat ditentukan nilai LC didapatkan nilai LC50 sebesar 26,3 ppm. Dari ketiga metode tersebut dapat diketahui bahwa didapatkan LC 50 dengan perbedaan yang tak terlalu jauh yaitu 26,438 ppm, 22,54 ppm, dan 22,54 ppm sehingga hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biji alpukat bersifat toksik terhadap larva udang karena LC
50 50 50

= anti log y

Dengan menggunakan metode analisis Reed-Munch didapatkan hasil LC50 sebesar

Pi = % kematian terhadap % seluruh hewan yang

= anti log m. Dari hasil perhitungan

1000 g/mL, sedangkan suatu ekstrak dikatakan aktif apabila mempunyai LC

50

1000

g/mL.

VII.

Kesimpulan Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan :

1. 2.

Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin banyak larva udang yang mati. Nilai LC50 pada metode perhitungan analisis probit adalah 26,438 ppm, pada analisis Reed-Munch nilai LC50 adalah 26,438 ppm, dan pada analisis farmakope nilai LC50 adalah 26,3 ppm.

3.

Ekstrak biji bintaro tidak dapat dihitung LC50 nya karena pada berbagai konsentrasi larva udang mati semua.

VIII.

Daftar Pustaka Anonim. 2000. Informatorium Obat Nasional Indonesia . Depkes RI : Jakarta Anief, Moh. 2000. Ilmu Meracik Obat. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI : Jakarta Ansel, Howard.C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Universitas Indonesia Press : Jakarta Ernst Mutschler, 1986, Dinamika Obat ; Farmakologi dan Toksikologi (terjemahan), ITB, Bandung