HPLC – HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY
HPLC/KCKT merupakan suatu teknik
dengan fase gerak cairan dan fase diam
berupa cairan atau padat. Teknik ini
menggunakan tekanan yang tinggi untuk
mengirim fase gerak melewati kolom.

Prinsip dari KCKT adalah memisahkan

setiap komponen dalam sampeluntuk
diidentifikasi baik secara kualitatif
maupun kuanititatif
 KCKT - HPLC
• Pemisahan senyawa
organik, anorganik, biologis
KCKT • Senyawa tidak mudah
menguap

• Jika sampel sangat

Keterbatasan kompleks maka resolusi
yang baik sulit diperoleh
KCKT
 CARA KERJA KCKT
• Solut terpisah oleh perbedaan kecepatan
elusi
• Solut melewati kolom kromatografi
• Pemisahan solut diatur distribusi solut
dalam fase gerak dan fase diam
 KCKT
Fase gerak

Ukuran Jenis
sampel kolom

kckt
Suhu Panjang,
diameter
kolom kolom

Kecepatan
alir fs gerak
 INSTRUMENTASI KCKT
• Wadah Fase Gerak
• Sistem penghantaran fase gerak, alat
untuk memasukkan sampel
• Kolom
• Detektor
• Wadah penampung buangan fase gerak
• Tabung penghubung
• Komputer/ integrator/ perekam
Skema HPLC
 FASE GERAK KCKT
• Fase gerak / eluen – campuran pelarut
• Daya elusi dan resolusi ditentukan :
- polaritas pelarut
- polaritas fase diam
- sifat komponen sampel
Fase normal = fase diam lebih polar dari fase
gerak ----- elusi naik, polaritas pelarut >>
Fase terbalik = fase diam kurang polar dari fase
gerak-----elusi turun, polaritas pelarut >>
 FASE GERAK KCKT
isokratik • Komposisi fase gerak tetap selama elusi

• Komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi

Bergradien • Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran
kompleks

Fase gerak • Larutan buffer + metanol

fase terbalik • Air + asetonitril

Fase gerak • Pelarut hidrokarbon + pelarut terklorisasi

fase normal • Pelarut jenis alkohol
 POMPA KCKT
• Inert terhadap fase gerak
Wadah

• gelas
• Baja tahan karat
Bahan • Teflon dan batu nilam
• 5000 psi
• Kecepatan alir 3ml/menit
Tekanan • Tujuan preparatif kec 20ml/menit

• Menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepa,

Tujuan reprodusibel, konstan, bebas gangguan

• Pompa tekanan konstan

Jenis • Pompa aliran fase gerak yang konstan
pompa
 KOLOM KCKT
• Efisiensi meningkat dengan
berkurangnya ukuran partikel
fase diam
KONVENSIONAL

• Konsumsi fase gerak 80% <

karena kec alir lebih lambat
• Lebih lambat– lebih ideal jika
MIKROBOR digabung spektro massa
• Sensitivitas ditingkatkan karena
solut lebih pekat
 FASE DIAM KCKT
• Silica dimodifikasi secara kimiawi ----
reagen-reagen ex/ klorosilan
silika fase terikat--- stabil hidrolisis – ikatan
siloksan
• Silica tidak dimodifikasi
• Polimer stiren dan divinil benzen
• Silika modif dan tidak – karakteristik
kromatografi & selektifitas berbeda
 DETEKTOR KCKT
• Karakteristik ideal
• Respon terhadap solut cepat dan
reprodusibel
• Sensitifitas tinggi, deteksi pada kadar
solut sangat kecil
• Stabil dalam pengoprasian
• Sel volume kecil, minimalis pelebaran
pita
• Tidak peka terhadap perubahan suhu &
kecepatan alir fase gerak